陳冬梅，劉淑丹，馬會(huì)明，劉曉明，梁雪云，魏 軍

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腫瘤環(huán)境下脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌因子促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲

陳冬梅1，劉淑丹1，馬會(huì)明2，劉曉明1，梁雪云1，魏 軍1

目的 確定腫瘤環(huán)境下人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSCs)的旁分泌特征變化與腫瘤細(xì)胞侵襲的關(guān)系。方法 體外分離培養(yǎng)AMSCs,收集培養(yǎng)上清液制備條件培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)HCT116細(xì)胞。利用Transwell培養(yǎng)板共培養(yǎng)AMSCs與HCT116細(xì)胞。通過(guò)檢測(cè)穿透人工基底膠(Matrigel膠)的能力比較兩種培養(yǎng)條件下HCT116細(xì)胞侵襲能力的差異。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HCT116細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)基因的表達(dá)變化。ELISA法檢測(cè)共培養(yǎng)后AMSCs基因表達(dá)和旁分泌因子表達(dá)變化。結(jié)果 結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116與AMSCs的Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)中，HCT116細(xì)胞的侵襲能力較AMSCs條件培養(yǎng)液培養(yǎng)顯著增強(qiáng)。同時(shí)結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116構(gòu)成的腫瘤微環(huán)境也影響了AMSCs旁分泌因子表達(dá)的變化，其中成纖維生長(zhǎng)因子10(FGF10)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(VEGFC)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素10(IL-10)的表達(dá)較正常培養(yǎng)條件下顯著上調(diào)。結(jié)論 腫瘤微環(huán)境影響下的AMSCs旁分泌因子表達(dá)改變，這些變化能夠增強(qiáng)結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

轉(zhuǎn)移性；旁分泌因子；脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；結(jié)腸癌

肥胖已成為發(fā)達(dá)國(guó)家和部分發(fā)展中國(guó)家共同面對(duì)的人口健康問(wèn)題。肥胖與腫瘤的關(guān)系發(fā)生在機(jī)體的各個(gè)方面，在肥胖群體中，腫瘤的發(fā)生和不良預(yù)后均高于正常體重指數(shù)的群體[1]。有研究[2]顯示腫瘤周圍的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，AMSCs)較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更易遷徙至腫瘤組織中，并伴隨間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)皮化，說(shuō)明AMSCs作為重要的肥胖相關(guān)的腫瘤微環(huán)境細(xì)胞可能在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移中起了重要作用。同時(shí)AMSCs在提供腫瘤生長(zhǎng)和血管形成方面的作用已被肯定，但是其對(duì)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是否有關(guān)鍵影響卻報(bào)道很少[3]。腫瘤細(xì)胞的EMT是腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的必然進(jìn)程。因此闡明AMSCs在特定腫瘤微環(huán)境下對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的作用機(jī)制是重要的理論創(chuàng)新，對(duì)相關(guān)疾病的防治有重要的指導(dǎo)意義。該研究選取HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞系與原代分離的AMSCs共培養(yǎng)，觀察HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移特性和AMSCs的旁分泌改變，從而闡明AMSCs影響HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞系發(fā)生EMT的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人脂肪組織來(lái)源于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院行腹部外科手術(shù)的非腫瘤患者，經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)且獲得患者知情同意。結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116由寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院人類干細(xì)胞研究所實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清(FBS)、DMEM ∶F12(1 ∶1)、胰蛋白酶、TRIzol(Invitrogen公司)； A型膠原酶(Roche公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒(Fermentas公司)；山羊抗人多克隆抗體E-cadherin、vimentin (Santa Cruz 公司)；CY3標(biāo)記兔抗山羊二抗 (博士德公司)；倒置熒光顯微鏡(Olympus公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)；定量PCR儀、電泳儀 (Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 手術(shù)無(wú)菌條件下取脂肪組織，無(wú)菌運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。立即剔除系膜和血管組織，剪碎后置于1 g/L 膠原酶A中37 ℃消化1 h，1 500 r/min 離心10 min，棄去上清液和未消化漂浮組織，紅細(xì)胞裂解液(155 mmol/L NH4Cl, 20 mmol/L Tris pH 7.6)裂解紅細(xì)胞，1000 r/min 離心5 min，重懸于含15%FBS的DMEM ∶F12(1 ∶1)培養(yǎng)基中，以3.2×104個(gè)細(xì)胞/cm2密度接種于100 mm培養(yǎng)皿中，次日換液去除未貼壁細(xì)胞，37 ℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)6 d，待細(xì)胞匯合至80%，即可傳代，期間每2 d換液1次。HCT116細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM ∶F12(1 ∶1)培養(yǎng)基中。

1.2.2 條件培養(yǎng)基的制備 1×106個(gè)AMSCs培養(yǎng)24 h收集培養(yǎng)上清液，0.45 μm濾膜過(guò)濾，作為條件培養(yǎng)基繼續(xù)用于培養(yǎng)HCT116細(xì)胞。

1.2.3 共培養(yǎng)系統(tǒng) 利用膜孔徑為0.4 μm 的Transwell小室進(jìn)行兩種細(xì)胞共培養(yǎng)，下室接種AMSCs，上室接種HCT116，共培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM ∶F12(1 ∶1)培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)10 d，期間正常換液和傳代，10 d后取出AMSCs，重新接種于無(wú)血清和添加因子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，收集上清液用于ELISA檢測(cè)成纖維生長(zhǎng)因子10(fibroblast growth factor 10, FGF10)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(vascular endothelial growth factor C, VEGFC)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)和白細(xì)胞介素10(interleukin-10, IL-10)的表達(dá)。HCT116細(xì)胞用做免疫組化、侵襲實(shí)驗(yàn)等。

1.2.4 ELISA檢測(cè) 正常培養(yǎng)或與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后的AMSCs消化離心后，以4×105個(gè)細(xì)胞的密度重新接種于60 mm皿，無(wú)血清培養(yǎng)24 h，收集上清液用于ELISA檢測(cè)，分別標(biāo)記為對(duì)照組和共培養(yǎng)組。

1.2.5 細(xì)胞RNA提取及實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè) 收集正常培養(yǎng)、AMSCs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)和與AMSCs共培養(yǎng)后的HCT116細(xì)胞，分別標(biāo)記為對(duì)照組、條件培養(yǎng)基組和共培養(yǎng)組。TRIzol提取各試驗(yàn)組樣本總RNA后，紫外分光光度計(jì)和電泳檢測(cè)RNA濃度、純度和完整性。通過(guò)隨機(jī)引物體外逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，用SYBR Green染料法獲得不同樣本中目的基因的相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)2-ΔΔCt算法，計(jì)算統(tǒng)計(jì)分析目的基因mRNA相對(duì)內(nèi)參GAPDH基因表達(dá)水平的差異。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.6 免疫熒光染色 各處理組細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定，0.3%TritonX-100細(xì)胞膜穿孔10 min，根據(jù)二抗來(lái)源選擇山羊或兔血清封閉30 min，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)一抗(1 ∶100) 4 ℃孵育過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，Cy-3或FITC熒光標(biāo)記二抗室溫避光孵育30 min，PBS洗滌3次，DAPI染核3 min，封片，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞特異性發(fā)光情況。

1.2.7 流式分析 流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代AMSCs表面標(biāo)志物CD105、CD90、CD73、CD34的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)由BD FACSCaliburTMplatform完成。

1.2.8 成脂和成骨分化 分化培養(yǎng)基參考已發(fā)表文獻(xiàn)[4]，成脂分化21 d后油紅O染色，成骨分化21 d后茜素紅染色。

1.2.9 腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 12 mm Transwell小室膜表面(8 μm孔隙大小)包被1 ∶5稀釋的Matrigel基底膜基質(zhì)40 μl，小室至于37 ℃孵化4～5 h形成凝膠。5×104個(gè)HCT116細(xì)胞重懸于200 μl 0.5%血清培養(yǎng)基中，接種至有凝膠的上室，500 μl 10%FBS的培養(yǎng)基補(bǔ)充至下室中。培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色光學(xué)顯微鏡下確定細(xì)胞遷移到基底膜背面的細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 AMSCs的培養(yǎng)和鑒定 原代接種2 d后，AMSCs貼壁，生長(zhǎng)出短臂，7 d后布滿100 mm培養(yǎng)皿，傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞呈典型間質(zhì)細(xì)胞樣，梭形，漩渦樣生長(zhǎng)(圖1A)。成脂誘導(dǎo)分化后能分化出油紅O染色陽(yáng)性的脂肪樣細(xì)胞(圖1B)，成骨誘導(dǎo)分化后能分化出茜素紅著色的鈣沉積顆粒(圖1C)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)該細(xì)胞中間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD73、CD105、CD90陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞的90%以上，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34(圖1D)。

2.2 共培養(yǎng)后結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系HCT116的形態(tài)和特征變化 正常培養(yǎng)的HCT116細(xì)胞呈上皮樣、團(tuán)簇樣生長(zhǎng)(圖2A1)，表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin(圖2B1)。與AMSCs共培養(yǎng)10 d后HCT116細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)樣改變，伸展出短臂，游走至團(tuán)簇之外(圖2A2)，開(kāi)始表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin蛋白(圖2B2)。

2.3 共培養(yǎng)后HCT116細(xì)胞EMT相關(guān)基因表達(dá)變化 熒光定量PCR檢測(cè)EMT相關(guān)基因ZEB1、Slug、Snail、Twist和E-cadherin的表達(dá)，結(jié)果顯示與AMSCs共培養(yǎng)后的HCT116細(xì)胞中，間質(zhì)相關(guān)基因ZEB1、Slug、Snail、Twist的表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FZEB1=87.762，F(xiàn)Slug=17.187，F(xiàn)Snail=83.332，F(xiàn)Twist=94.513，P<0.01)，而上皮標(biāo)志基因E-cadherin表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FE-cadherin=135.060，P<0.05)。同時(shí)，通過(guò)AMSCs條件培養(yǎng)基進(jìn)行的非接觸性的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，HCT116細(xì)胞中EMT相關(guān)基因Slug、E-cadherin表達(dá)較正常培養(yǎng)條件下無(wú)明顯差異， ZEB1、Snail、Twist的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖1 AMSCs培養(yǎng)及特征鑒定

A：P1代AMSCs形態(tài) ×40；B：成脂分化后油紅O染色 ×100；C：成骨分化后茜素紅染色 ×100；D：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)志物

圖2 共培養(yǎng)后HCT116細(xì)胞表型變化

A1：正常HCT116細(xì)胞形態(tài) ×40；B1：E-cadherin ×200；C1：DAPI ×200；A2：共培養(yǎng)后HCT116細(xì)胞形態(tài) ×40；B2：Vimentin ×200； C2：DAPI ×200

2.4 共培養(yǎng)后HCT116細(xì)胞侵襲性的改變 結(jié)果顯示兩種細(xì)胞共培養(yǎng)后，穿透Matrigel膠包被的Transwell基底膜的HCT116細(xì)胞數(shù)量顯著高于正常培養(yǎng)和條件培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=279.377，P<0.001)。見(jiàn)圖4。2.5 共培養(yǎng)后AMSCs旁分泌因子的變化 Transwell共培養(yǎng)與條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后，HCT116細(xì)胞在遷移和侵襲能力上的差異，說(shuō)明腫瘤微環(huán)境下的AMSCs的旁分泌因子組成發(fā)生了變化，導(dǎo)致HCT116細(xì)胞侵襲能力增加。進(jìn)一步檢測(cè)共培養(yǎng)后AMSCs的旁分泌因子的表達(dá)，結(jié)果顯示：經(jīng)過(guò)與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后，AMSCs分泌的FGF10、TNF-α、VEGFC和IL-10的表達(dá)顯著高于正常培養(yǎng)條件下的分泌量(FFGF10=44.169，F(xiàn)TNF-α=10.915，F(xiàn)VEGFC=207.644，F(xiàn)IL-10=133.698，P<0.01)。見(jiàn)圖5。

圖3 HCT116細(xì)胞EMT相關(guān)基因表達(dá)變化

圖4 共培養(yǎng)后HCT116細(xì)胞侵襲能力變化

圖5 與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后AMSCs所分泌細(xì)胞因子變化

3 討論

通常條件下，EMT在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用，同樣在原始腫瘤的侵襲和遷移中EMT也普遍被認(rèn)為起了關(guān)鍵作用。這一過(guò)程中上皮樣腫瘤細(xì)胞頂-底極性消失，蛋白水解活性升高，侵襲細(xì)胞外基質(zhì)的能力增高。頂-底極性是細(xì)胞中蛋白和脂質(zhì)結(jié)構(gòu)非均勻分布造成的，能抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，以及細(xì)胞與其所處環(huán)境的交流。在EMT過(guò)程中，細(xì)胞丟失E-鈣黏蛋白、緊密連接蛋白和細(xì)胞角蛋白等上皮標(biāo)志基因，表現(xiàn)出N-鈣黏蛋白、波形蛋白、纖連蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白等間質(zhì)樣表型[5]。實(shí)驗(yàn)證明，腫瘤微環(huán)境中的信號(hào)分子通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)控制EMT，如表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、Wnt1、TGF-β和IL-6通過(guò)激活酪氨酸激酶受體(RTKs)、Wnt、TGF-β、NF-κB等信號(hào)通路，激活一組下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子：Snail、Slug、Twist 和ZEB1等[6-7]，可以誘導(dǎo)EMT和浸潤(rùn)性癌癥的形成。獲得間質(zhì)表型的腫瘤干細(xì)胞亞群是腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HCT116細(xì)胞與AMSCs共培養(yǎng)后獲得了Snail、Slug、Twist 和ZEB1等基因的表達(dá)上調(diào)，E-cadherin上皮標(biāo)志基因表達(dá)下降，并表達(dá)Vimentin蛋白，說(shuō)明AMSCs促進(jìn)了HCT116細(xì)胞的EMT發(fā)生。而AMSCs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的HCT116細(xì)胞在以上各間質(zhì)標(biāo)志基因的表達(dá)較共培養(yǎng)組低，說(shuō)明腫瘤微環(huán)境造成了AMSCs旁分泌因子的改變。

腫瘤的微環(huán)境包括低氧、酸性、細(xì)胞外分泌因子等很多因素組成[8]。已有研究[9]顯示，在結(jié)腸癌中，由環(huán)境中的肌成纖維細(xì)胞分泌的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT和腫瘤起始能力，并伴隨腫瘤細(xì)胞中Wnt通路高度激活。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)能夠在化療中被激活，并分泌許多生長(zhǎng)因子，包括：VEGF、EGF、IGF-1和HGF等；趨化因子SDF-1/CXCR4以及炎癥細(xì)胞因子IL-6和TNF-α等，通過(guò)PI3K/AKT、Wnt和STAT3等信號(hào)通路保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受化療藥物的損傷，并引發(fā)腫瘤細(xì)胞的EMT和干細(xì)胞特性[10]。這些研究證明腫瘤中的間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞間通信對(duì)腫瘤細(xì)胞本身增殖、遷徙和侵略特性的影響。而對(duì)腫瘤微環(huán)境中的間充質(zhì)干細(xì)胞本身特征改變的研究還非常少。本試驗(yàn)選取的HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞系是含有β-catenin突變的細(xì)胞系，該細(xì)胞系表達(dá)包括Wnt1、Wnt3a等數(shù)種Wnt配體，能通過(guò)自分泌和旁分泌途徑模擬體內(nèi)環(huán)境下結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境[11]。來(lái)源于腹部手術(shù)廢棄脂肪組織中分離的AMSCs，在與HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞系共培養(yǎng)后，表達(dá)更高的生長(zhǎng)因子IGF、FGF10、VEGFC，進(jìn)一步ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示腫瘤環(huán)境下的AMSCs表達(dá)更高的VEGFC、FGF10、TNF-α和IL-10，有報(bào)道[12]顯示其中VEGFC是典型的促血管生成細(xì)胞因子，IL-10可能和腫瘤細(xì)胞的免疫豁免和逃逸有關(guān)[13]，而FGF10和TNF-α是與EMT直接相關(guān)的細(xì)胞因子[14-15]，其高表達(dá)證明腫瘤微環(huán)境下AMSCs更能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。AMSCs與腫瘤細(xì)胞之間的這種正反饋聯(lián)系可能是通過(guò)細(xì)胞因子的旁分泌途徑實(shí)現(xiàn)的，其中的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。本研究闡明了腫瘤微環(huán)境下AMSCs旁分泌因子表達(dá)譜的改變影響了結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，研究細(xì)胞與微環(huán)境之間的關(guān)系將為更好地明確腫瘤發(fā)展的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)肥胖相關(guān)腫瘤臨床診療提供理論指導(dǎo)。

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Paracrine factors from adipose-mesenchymal stem cells enhance metastatic capacity of colon-cancer cell in tumor microenvironment

(1Human Stem Cell Institute of General Hospital，2Key Laboratory of Fertility Preservation andMaintenanceofMinistryofEducation,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004)

Objective To investigate the underpinning mechanisms by which human adipose-derived mesenchymal stem cells (hAMSCs) promote cancer metastasis remain elusive. Methods Colon cancer cells were co-cultured with AMSCs using a Transwell model. The capacity of invasion of HCT116 cells in the indicated conditions was detected by a Transwell invasive assay. The transcripts of EMT-associated genes in HCT116 treated with indicated conditions were determined by a qRT-PCR assay. Concentration of indicated paracrine factors and cytokines of the culture medium was ascertained by an ELISA. Results The results showed that AMSCs could promote colon cancer cells to a mesenchymal-like phenotype in a contact-dependent manner. Reciprocally, colon cancer cells were able to induce AMSCs to produce metastasis-related factors and cytokines, such as fibroblast growth factor 10 (FGF10), vascular endothelial growth factor C (VEGFC)，tumor necrosis factor-α(TNF-α) and interleukin 10 (IL-10) in part through a mechanism of an activation of tumor microenvironment. Intriguingly, an inhibition of contact with AMSCs led a reduced capacity of invasion of colon cancer cellsinvitro. Conclusion These findings thus suggest that the crosstalk between the microenvironment of cancer cells and paracrine factors of AMSCs has an implication in colon cancer malignancy. This study thus uncovers a novel paracrine factors mediated-crosstalk between colon cancer cells and AMSCs in colon cancer malignancy.

metastatic; paracrine factor; adipose mesenchymal stem cells; colon cancer

時(shí)間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.018.html

寧夏自然科學(xué)基金(編號(hào)NZ13162)

1寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院干細(xì)胞研究所，銀川 750004

2寧夏醫(yī)科大學(xué)教育部生育力保持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004

陳冬梅，女，博士，助理研究員；

魏 軍，女，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：Lydiajunwei@163.com

R 73-37

A

1000-1492(2016)01-0036-06

2015-09-30接收