王柏濤，張啟芳，邱小芬，楊紅杰，孟云超，鄭 奕

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抗巨噬細(xì)胞移動抑制因子單抗對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠發(fā)病的干預(yù)機(jī)制研究

王柏濤1，張啟芳2，邱小芬3，楊紅杰4，孟云超2，鄭 奕2

目的 探討抗巨噬細(xì)胞移動抑制因子單抗(抗MIF單抗)對小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎(UC)發(fā)病的干預(yù)作用及其可能調(diào)控機(jī)制。方法 以葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)制備小鼠急性UC模型，小鼠分為正常組、UC模型組、抗MIF單抗干預(yù)組和生理鹽水組。造模及藥物干預(yù)期間觀察小鼠一般情況并行疾病活動指數(shù)(DAI)評分，7 d后斷頸處死全部小鼠，行結(jié)腸大體損傷評分，HE染色后光鏡下觀察結(jié)腸病理改變，免疫組化染色觀察巨噬細(xì)胞移動抑制因子(MIF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等促炎因子在結(jié)腸組織炎癥細(xì)胞的表達(dá)情況，實(shí)時熒光定量PCR(real-time PCR)檢測結(jié)腸組織核因子-κβ(NF-κβ) p65 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 與正常組相比，其余三組小鼠結(jié)腸炎癥病變明顯，MIF、TNF-α、IL-6等促炎因子的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，干預(yù)組結(jié)腸黏膜損傷程度減輕，抗MIF單抗顯著改善MIF、TNF-α、IL-6等促炎因子的表達(dá)水平(P<0.05)，而生理鹽水組與其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。real-time PCR結(jié)果顯示應(yīng)用抗MIF單抗的小鼠能顯著抑制結(jié)腸組織NF-κβ p65 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)論 抗MIF單抗對小鼠UC的發(fā)病有明顯的干預(yù)作用，可能通過抑制NF-κβ信號通路，減少促炎因子的表達(dá)發(fā)揮作用。

抗巨噬細(xì)胞移動抑制因子單抗；葡聚糖硫酸鈉；潰瘍性結(jié)腸炎；炎癥因子；核因子-κβ

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種主要累及結(jié)腸黏膜及黏膜下層的非特異性自身免疫性疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確。腸道黏膜免疫耐受的異常表達(dá)和細(xì)胞因子的失衡與UC的發(fā)病密切相關(guān)，其中因NF-κβ作為一種多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可以促使效應(yīng)細(xì)胞分泌多種炎癥因子，從而被證實(shí)在UC的發(fā)病中起重要作用[1]。巨噬細(xì)胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一種特殊結(jié)構(gòu)的炎癥趨化因子，通過抑制巨噬細(xì)胞的游走、移動，促使巨噬細(xì)胞在炎癥部位聚集、增生，從而發(fā)揮其促炎作用。既往研究[2]已證實(shí)其作為促炎因子參與UC的發(fā)病。因此該研究通過對小鼠結(jié)腸組織的檢測，評價應(yīng)用抗MIF單抗抑制MIF促炎作用后對小鼠結(jié)腸的炎癥浸潤情況，及各組小鼠MIF、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)等促炎因子和核因子-κβ(nuclear factor-κβ，NF-κβ)p65 mRNA在結(jié)腸組織的表達(dá)水平，旨在證實(shí)抗MIF單抗對UC的保護(hù)作用及其作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 SPF級雄性BALB/c小鼠40只，鼠齡8～9周，(24±2)g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物公司。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對照組、UC模型組、抗MIF單抗干預(yù)組、生理鹽水組，每組10只。

1.2 藥品與試劑 抗MIF單抗購自重慶探生科技有限公司；葡聚糖硫酸鈉(DSS, MW 36 000～50 000)購自美國MP Biomedicals生物醫(yī)學(xué)公司；MIF多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗TNF-α多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；IL-6多克隆抗體購自美國Bioworld公司；二抗HRP鼠兔通用型購自廣州安必平醫(yī)藥科技有限公司；TRIzol A+總RNA提取試劑購自天根生化科技(北京)有限公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司；Power SYBR Green PCR Master Mix(2×)購自美國Applied Biosystems公司。

1.3 模型制備及藥物干預(yù) 正常對照組自由飲水，其余三組每日飲用5 % DSS溶液連續(xù) 7 d?？筂IF單抗(4 mg/ml)與生理鹽水1 ∶3體積比稀釋后，抗MIF單抗干預(yù)組與生理鹽水組于1、2、4、6 d分別腹腔注射抗MIF單抗和生理鹽水0.2 ml/只。造模及給藥期間觀察并記錄各組小鼠體重變化、精神狀態(tài)、毛色、糞便性狀等一般情況，并根據(jù)Cooper的經(jīng)典評分方法[3]，進(jìn)行疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)評分。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR) TRIzol法提取各組小鼠結(jié)腸組織的總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行完整性分析，紫外分光光度計進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄定量。β-actin引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司設(shè)計合成，NF-κβ引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計合成，引物序列見表1。擴(kuò)增條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min,；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后采用2-ΔΔCt法對結(jié)果進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參校對NF-κβ的相對表達(dá)量。

表1 基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況 正常對照組小鼠毛色亮澤、順滑，反應(yīng)迅捷，體重均不同程度增加，糞便成條形、無便血和腹瀉現(xiàn)象；與正常對照組對比，UC模型組和生理鹽水組小鼠毛色混雜、無光澤、嚴(yán)重者毛發(fā)干枯，反應(yīng)遲滯，活動度明顯減低，出現(xiàn)拱背、扎堆現(xiàn)象，體重下降明顯，糞便稀樣、次數(shù)增多、便血嚴(yán)重；抗MIF單抗干預(yù)組小鼠毛色較正常對照組略黯淡、部分稍顯雜亂，但不如模型組和生理鹽水組明顯，精神狀態(tài)良好，體重減輕幅度小，部分小鼠出現(xiàn)輕微便血現(xiàn)象。

2.2 小鼠DAI評分 與正常對照組相比，其余三組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明模型制備成功；與抗MIF單抗干預(yù)組相比，UC模型組和生理鹽水組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而UC模型組和生理鹽水組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，F(xiàn)=28.910)。見表2。

2.3 結(jié)腸大體損傷評分 肉眼觀察正常對照組小鼠結(jié)腸無充血水腫、無出血點(diǎn)，腸壁均勻光滑，血管清晰；UC模型組和生理鹽水組結(jié)腸腸壁充血水腫、色澤晦暗，局部出現(xiàn)明顯潰瘍，伴有糜爛，與周圍組織粘連，管壁有僵硬感；抗MIF單抗干預(yù)組小鼠結(jié)腸腸壁色澤暗淡，充血水腫，出現(xiàn)微小出血點(diǎn)，但其范圍、程度、潰瘍個數(shù)均不及UC模型組和生理鹽水組顯著(F=31.494)。見表2。

表2 小鼠DAI評分及結(jié)腸大體損傷評分(分，

與正常對照組比較：*P<0.05；與UC模型組比較：#P<0.05；與抗MIF單抗干預(yù)組比較：▲P<0.05

2.4 HE染色組織學(xué)評分 正常對照組小鼠結(jié)腸黏膜及黏膜下層結(jié)構(gòu)完整無缺損，上皮細(xì)胞排列整齊，腺體形態(tài)規(guī)則，漿膜層血管無充血現(xiàn)象；UC模型組結(jié)腸黏膜上皮糜爛嚴(yán)重，黏膜固有層大部分腺體結(jié)構(gòu)破壞，肉芽組織形成，提示可能曾存在淺潰瘍，黏膜固有層及黏膜下層被大量炎癥細(xì)胞浸潤；抗MIF單抗干預(yù)組結(jié)腸黏膜上皮無糜爛，腺體結(jié)構(gòu)正常，血管內(nèi)紅細(xì)胞聚集，呈充血現(xiàn)象，黏膜固有層炎癥細(xì)胞浸潤，但炎癥細(xì)胞數(shù)量及浸潤深度不及UC模型組和生理鹽水組；生理鹽水組結(jié)腸黏膜上皮缺損、斷裂，輕度糜爛，炎癥細(xì)胞主要集中在黏膜固有層(F=58.456)。見圖1、表3。

2.5 免疫組化結(jié)果 各組小鼠結(jié)腸黏膜腺上皮均不表達(dá)MIF、TNF-α、IL-6。正常對照組結(jié)腸黏膜炎癥細(xì)胞不表達(dá)或極微量表達(dá)；而在UC模型組和生理鹽水組中，結(jié)腸黏膜炎癥細(xì)胞均強(qiáng)表達(dá)；抗MIF單抗干預(yù)組中結(jié)腸黏膜炎癥細(xì)胞MIF、TNF-α、IL-6呈弱表達(dá)，介于正常對照組和其余兩組之間；MIF、TNF-α、IL-6的F值依次為766.448、308.356、1 626.643。見圖2～4、表3。

圖1 小鼠結(jié)腸組織病理切片 HE×200

2.6 real-time PCR結(jié)果 UC模型組小鼠結(jié)腸組織 NF-κβ p65 mRNA相對表達(dá)量(2.011±0.137)顯著高于正常對照組(1.01±0.018)與抗MIF單抗干預(yù)組(0.84±0.211)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與UC模型組相比，抗MIF單抗干預(yù)組的相對表達(dá)量較低(P<0.05)，而生理鹽水組(2.00±0.12)與其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；抗MIF單抗干預(yù)組的相對表達(dá)量較正常對照組略低，二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；F=63.658。

圖2 小鼠結(jié)腸組織MIF 的表達(dá) SP×200

圖3 小鼠結(jié)腸組織TNF-α的表達(dá) SP×200

分組病理評分陽性細(xì)胞率(%)MIFTNF?αIL?6正常對照0．30±0．48#▲8．10±1．32#▲7．97±1．59#▲11．10±1．32#▲UC模型13．60±1．17?▲59．00±1．23?▲60．40±2．40?▲85．83±1．96?▲抗MIF單抗干預(yù)6．30±1．16?#22．17±1．51?#30．53±1．74?#55．27±1．78?#生理鹽水13．90±1．52?▲59．00±1．22?▲60．63±3．08?▲83．90±2．75?▲

與正常對照組比較：*P<0.05；與UC模型組比較：#P<0.05；與抗MIF單抗干預(yù)組比較：▲P<0.05

圖4 小鼠結(jié)腸組織IL-6的表達(dá) SP×200

3 討論

UC發(fā)病率在我國呈明顯上升趨勢[6]，隨著抗TNF-α類新型制劑的成功運(yùn)用[7]，嘗試生物制劑治療UC已成為當(dāng)前研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。而MIF作為近年發(fā)現(xiàn)的多效能細(xì)胞因子，在機(jī)體內(nèi)廣泛存在，被認(rèn)為是TNF-α、IL-6等參與UC發(fā)病的炎癥因子的上游調(diào)控因子。因此該實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用抗MIF單抗抑制MIF的表達(dá)，評價抗MIF單抗是否對小鼠UC能起到顯著的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)通過DSS誘導(dǎo)制備小鼠急性UC模型，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用抗MIF單抗的小鼠較UC模型組而言，小鼠的體重減輕幅度、糞便性狀、結(jié)腸的大體損傷、光鏡下結(jié)腸組織病理改變等均有顯著改善，免疫組化染色觀察MIF、TNF-α、IL-6等促炎因子的表達(dá)也不同程度的下降。這就證明抗MIF單抗對小鼠UC的發(fā)病的確能起到保護(hù)作用。

近年來在對UC發(fā)病機(jī)制的研究中，發(fā)現(xiàn)TLR4/NF-κβ 信號通路與UC的發(fā)病密切相關(guān)，主要通過TLR4→ Myd88 → IRAK → TRAF → NIK → IKK → NF-κβ發(fā)揮作用[8-11]。而NF-κβ已被證實(shí)可以激活參與UC發(fā)病的TNF-α、IL-6等促炎因子的啟動子[12]，當(dāng)這些炎癥因子釋放后，反過來可再次正反饋調(diào)節(jié)NF-κβ的表達(dá)[13]，如此則形成“級聯(lián)效應(yīng)”，炎癥不斷放大。

本實(shí)驗(yàn)通過real-time PCR檢測小鼠結(jié)腸組織 NF-κβ p65 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用抗MIF單抗的小鼠較UC模型組而言，其 NF-κβ p65 mRNA的表達(dá)水平顯著下降，證實(shí)抗MIF單抗可能通過抑制NF-κβ的表達(dá)，進(jìn)而減少NF-κβ下游信號通路炎癥因子的含量發(fā)揮其干預(yù)作用。但本研究顯示應(yīng)用抗MIF單抗干預(yù)的小鼠，其 NF-κβ p65 mRNA的表達(dá)略低于正常對照組，理論上如果單純通過TLR4-NF-κβ信號通路發(fā)揮作用，那么抗MIF單抗干預(yù)組的結(jié)腸組織學(xué)評分、陽性細(xì)胞率的表達(dá)等檢測指標(biāo)均應(yīng)與正常對照組的表達(dá)水平相一致。因此，該研究也證實(shí)了有不同的信號通路參與UC的發(fā)病。

本次實(shí)驗(yàn)從分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路層面對抗MIF單抗對小鼠UC可能產(chǎn)生的干預(yù)作用進(jìn)行了探討，初步判定抗MIF單抗通過抑制NF-κβ信號通路及其下游炎癥因子的表達(dá)發(fā)揮作用，對其可能作用通路進(jìn)行了大膽推測，肯定了抗MIF單抗的療效。但是關(guān)于UC的信號通路是一個多因素參與的復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可能存在著分子間的重疊交叉激活，參與UC發(fā)病的很多關(guān)鍵的因子及其機(jī)制也尚未明確，且本次實(shí)驗(yàn)采用的小鼠樣本量較少，故現(xiàn)階段很難對抗MIF單抗對UC的保護(hù)作用有一個全面的定性，尚須進(jìn)一步研究。

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Wang Baitao1，Zhang Qifang2，Qiu Xiaofen3，et al

The protective effect of anti-macrophage migration inhibitory factor monoclonal antibody on ulcerative colitis in mice

(1Dept of Graduate School, Guilin Medical College，Guilin 541004；2Dept of Gastroenterology，3Dept of Pathology,NanxishanHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion，Guilin541002)

Objective To investigate the protective effect and possible regulatory mechanism of anti-macrophage migration inhibitory factor monoclonal antibody(anti-MIF Ab)on acute ulcerative colitis(UC) in mice. Methods Acute ulcerative colitis model in mice was established by dextran sulfate sodium(DSS), to observe the protective effect of anti-MIF Ab on ulcerative colotis in mice. The experiment was divided into normal group, UC model group, anti-MIF Ab intervention group and saline group. During modeling and the period of administration, to observe general situations and score Disease Activity Index(DAI) of mice, after 7 days, all mice were killed, performing the gross damage score in colon, observing the colonic histopathological changes under the light microscope on HE staining, viewing the expression conditions of serum inflammatory cytokins such as MIF，TNF-α，IL-6 in intestinal inflammatory cells on immunohistochemical staining, using real-time quantitative(real-time PCR) to analyze the expression levels of NF-κβ p65 mRNA in colon tissue. Results Compared with the normal group, the degrees of colonic inflammation were significantly severe in the other three groups, the expression levels of serum inflammatory cytokines such as MIF，TNF-α，IL-6 were remarkably increased(P<0.05); compared with the model group, the degrees of colonic mucosa damage were alleviated in intervention group. Anti-MIF Ab could obviously improve the expression levels of serum inflammatory cytokines such as MIF, TNF-α, IL-6(P<0.05), but no significant differences between saline group and model group. The results of real-time PCR showed that mice using anti-MIF Ab could apparently inhibit the expression level of NF-κβ p65 mRNA. Conclusion Anti-MIF Ab has a strongly protective effect against ulcerative colitis in mice, maybe the inhibition of NF-κβ signal pathway and the decreasion of inflammatory cytokines play a central factor resulting from this conclusion.

anti-macrophage migration inhibitory factor monoclonal antibody；dextran sulfate sodium； ulcerative colitis；inflammatory factor；nuclear factor-κβ

時間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.016.html

廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點(diǎn)科研課題(編號：重2011018)；桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項(xiàng)目(編號：科技攻關(guān)20140120-7-2)

1桂林醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，桂林 541004

廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院2消化內(nèi)科、3病理科、4中醫(yī)科，桂林 541002

王柏濤，男，碩士研究生；

張啟芳，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zhangqifang-gl@163.com

R 574.1

A

1000-1492(2016)01-0031-05

2015-09-30接收