左俐俊，任亞萍，趙 瑋，宋婉玲

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Bcl-2和Bax在ICR小鼠睪丸中的表達及與eNOS的關(guān)聯(lián)性研究

左俐俊1，任亞萍2，趙 瑋1，宋婉玲3

目的 探討B(tài)淋巴細胞瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)在雄性ICR小鼠睪丸中的表達及與內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的聯(lián)系和意義。方法 30只(分別為4、8、12周齡，各10只)健康雄性ICR小鼠，分為性成熟前(4周齡組)、性成熟(8周齡組)、性成熟后(12周齡組)，取左側(cè)睪丸經(jīng)石蠟切片，免疫組化法檢測小鼠睪丸中eNOS、Bcl-2和Bax蛋白的表達分布情況；取右側(cè)睪丸，Western blot法檢測eNOS、Bcl-2和Bax的表達情況。結(jié)果 Bcl-2在睪丸間質(zhì)細胞高表達，Bax在生精上皮有表達；8周齡小鼠睪丸間質(zhì)細胞Bcl-2表達明顯高于4、12周齡組，且8周齡組小鼠Bax表達明顯低于4、12周齡組小鼠(P<0.05)；4周齡組小鼠睪丸eNOS蛋白表達明顯高于8、12周齡組(P<0.01)。結(jié)論 Bcl-2、Bax與eNOS在睪丸間質(zhì)細胞的表達并沒有直接的相關(guān)性，提示NO或許未直接參與睪丸間質(zhì)細胞的凋亡活動。

eNOS；Bcl-2；Bax；雄激素；精子

生精過程是一個自我選擇的凋亡過程，適度凋亡可形成優(yōu)質(zhì)精子，過度凋亡則可能少精或弱精。B淋巴細胞瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)作為一類重要的凋亡基因，通過“二聚體化”過程[1-2]，參與精子的發(fā)生與成熟，Bcl-2高表達抑制凋亡，Bax高表達促進凋亡，Bcl-2、Bax兩者的相對含量是啟動凋亡與否的關(guān)鍵因素[3]。而精子的發(fā)生也許不僅僅與凋亡有關(guān)，已知一氧化氮(nitric oxide,NO)為目前體內(nèi)研究較多的一種信使分子，其廣泛分布于雄性動物睪丸、附睪、輸精管等生殖系統(tǒng)及精子的頂體和尾部，且NO在陰莖勃起、調(diào)節(jié)睪丸血供、參與精子的發(fā)生與成熟方面都有重要作用[4]。同時，NO也是一種調(diào)節(jié)精子發(fā)生的雙重效應(yīng)物質(zhì)，這種雙重作用是由精液中NO濃度所決定的，過量的NO對精子有毒性作用，降低精子成活率和活力，適量的NO則有利于生育。但NO半衰期短，性質(zhì)活潑，故通過測定內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(endothelia nitric oxide synthase，eNOS)含量來探討NO的作用機制。那么，小鼠生殖發(fā)育的不斷凋亡過程是否是NO活性的表達過程，或是兩類基因相互協(xié)調(diào)的結(jié)果，又是如何協(xié)調(diào)，該研究擬探討B(tài)cl-2、Bax和eNOS對不同發(fā)育階段雄性ICR小鼠睪丸發(fā)育和精子形成的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 正置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；化學(xué)發(fā)光成像儀(上海天能科技有限公司)；Bcl-2、Bax(武漢博士德公司)；eNOS(美國Affinity公司)；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG、DAB試劑盒(北京中杉金橋公司)；PMSF(江蘇碧云天公司)；RIPA裂解液(北京康為世紀公司)；PVDF膜、Western blot膜再生液(北京索萊寶公司)；普通ECL Plus發(fā)光液(北京泛博生物化學(xué)有限公司)；SABC免疫組化染色試劑盒(福州邁新公司)。

1.2 動物及其分組、處理 30只SPF級雄性ICR小鼠由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，將小鼠分為3組，每組10只，分別為性成熟前(4周齡組)，體重(30±3)g；性成熟期(8周齡組)，體重(43±3)g；性成熟后(12周齡組)，體重(45±3)g。于桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心飼養(yǎng)，環(huán)境溫度25 ℃，濕度55%～65%，光照10～12 h/d，飼料、飲用水均經(jīng)消毒處理。

1.3 方法

1.3.1 取材 小鼠取材前1 d禁食，頸椎脫臼處死，75%酒精消毒皮膚，切開下腹部皮膚，另換一套無菌器械打開腹腔，用食指和拇指輕微擠壓陰囊皮膚，使睪丸滑入腹腔，用無菌鑷子輕輕分離出雙側(cè)睪丸及附睪，去離子水沖洗。左側(cè)睪丸取出后用手術(shù)刀片將其劃一小口，利于固定液進入組織，10%中性甲醛固定，用于免疫組化檢測；右側(cè)睪丸取出后迅速置于凍存管，液氮保存，-80 ℃超低溫冰箱儲存?zhèn)溆?，行Western blot法檢測。

1.3.2 免疫組化檢測 10%中性甲醛固定48 h后(睪丸固定時間略長易于固定液滲入組織)，常規(guī)石蠟包埋、切片，厚度5 mm，貼于預(yù)先用賴氨酸處理的玻片上，62 ℃烤片1 h，脫蠟和水化后，用檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，過氧化酶室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加一抗(Bcl-2稀釋度為1 ∶100，Bax稀釋度為1 ∶300)，室溫孵育60 min，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加二抗，PBS沖洗3次，每次3 min。100 μl DAB染色，蘇木精復(fù)染，PBS沖洗，脫水，透明封片。正置顯微鏡Axio Vision軟件拍攝圖片，每組10個視野，分別記錄10×40倍視野圖，觀察各組蛋白表達情況，圖像處理軟件Image-Pro-Plus 6.0測定各組Bcl-2和Bax染色平均吸光度。eNOS表達情況為引用本課題組前期實驗中的部分結(jié)果，故本實驗僅做定位檢測[5]。

1.3.3 Western blot法檢測 取右側(cè)睪丸組織放入無菌研缽中，使用液態(tài)氮充分研磨組織，使其成為粉末狀，按照1 ∶100加入PMSF與裂解液，靜置30 min后，震蕩、離心、取上清液，沸水煮蛋白樣品使其變性，置冰上冷卻后待用。電泳蛋白樣品，濕式電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，Bcl-2、Bax：260 mA、40 min；eNOS：260 mA、100min。使用PVDF膜，麗春紅染色見蛋白條帶，TBST洗膜10 min，封閉液封閉1 h，TBST洗膜5次，每次6 min，4 ℃一抗孵育過夜(Bcl-2、Bax、eNOS稀釋度均為1 ∶250)，隔日室溫孵育一抗1 h，TBST洗膜5次，每次6 min，孵育二抗1 h(二抗稀釋度1 ∶5 000)，TBST洗膜5次，每次6 min，滴加發(fā)光液，Tanon計算機發(fā)光成像軟件成像。Tanon Gel Image System ID分析軟件，分別測得各組內(nèi)參、目的蛋白灰度值，計算目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值比值。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果分析 8、12周齡小鼠睪丸曲細精管壁較4周齡小鼠明顯增厚，且8、12周齡小鼠增厚的生精上皮中可見各級生精細胞和支持細胞分布，并呈現(xiàn)漩渦狀分布輪廓。Bcl-2和Bax在各組睪丸組織中均有表達，呈棕黃色顆粒。Bcl-2主要表達于4周齡小鼠精原細胞、精母細胞以及8周齡小鼠精子細胞，且3組小鼠睪丸間質(zhì)細胞的細胞質(zhì)均可見陽性表達，8周齡小鼠睪丸表達陽性率高于4、12周齡小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.574±0.065vs0.435±0.040vs0.489±0.064，F(xiàn)=8.774，P<0.05)。Bax主要表達于精原細胞、精子細胞和睪丸間質(zhì)細胞的細胞質(zhì)，8周齡性成熟期小鼠表達明顯低于4、12周齡小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.431±0.052vs0.513±0.023vs0.485±0.036，F(xiàn)=5.873，P<0.05)。eNOS主要表達于精母細胞、間質(zhì)細胞和支持細胞的細胞質(zhì)，且結(jié)合免疫印跡結(jié)果示4周性成熟前小鼠表達高于8、12周齡小鼠，見圖1、2。

2.2 Western blot法檢測結(jié)果 8周齡組小鼠睪丸Bcl-2蛋白表達明顯高于4、12周齡組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.774，P<0.05)；8周齡組小鼠睪丸Bax蛋白表達明顯低于4、12周齡組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.975，P<0.05)；4周齡組小鼠睪丸eNOS蛋白表達明顯高于8、12周齡組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.125，P<0.01)，見表1、圖2。

表1 Western blot法檢測小鼠Bcl-2和Bax表達

與8周齡組比較：*P<0.05，**P<0.01；與4周齡組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

Bcl-2、Bax協(xié)同在睪丸間質(zhì)細胞或生精細胞的表達調(diào)節(jié)雄激素合成，進而影響精子發(fā)生[6]。本實驗將8周與4、12周齡小鼠比較，Bcl-2高表達，Bax低表達，說明機體通過調(diào)節(jié)凋亡基因，抑制睪丸間質(zhì)細胞凋亡，促進合成大量雄激素，維持小鼠生精，也提示睪丸間質(zhì)細胞的凋亡抑制過程很可能是精子的發(fā)生過程。而性成熟期小鼠Bcl-2表達強于性成熟后小鼠，這也從另一個角度說明精子發(fā)生過程的啟動需要足夠量的雄激素來維持，即青春期萌動時分泌的大量雄激素。而Bcl-2表達于精子細胞、精子(生精小管腔面)，也提示精子的變態(tài)反應(yīng)一定程度上依賴Bcl-2基因的調(diào)控。那么，此兩種基因異常表達是否影響機體正常發(fā)育，有關(guān)Bcl-2轉(zhuǎn)基因小鼠和Bax基因敲除小鼠的實驗顯示，Bcl-2過度表達，早期生殖細胞的凋亡則被抑制，大多處于發(fā)育的初期階段，精子形成明顯減少而不育；Bax基因敲除小鼠曲細精管中有大量不正常精原細胞累積，最終也導(dǎo)致不育[7-8]。精子DNA損傷也是不育的重要原因之一[9]，那么Bcl-2阻止包膜脂質(zhì)過氧化及DNA損傷的作用便顯得尤為重要[10]，此外，Bcl-2和Bax的協(xié)調(diào)表達也避免機體產(chǎn)生畸形精子或無精，而低質(zhì)量的精子可能與不明原因的流產(chǎn)有關(guān)[11]?？梢夿cl-2和Bax對機體生殖發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。

圖1 小鼠睪丸Bcl-2、Bax和eNOS免疫組化 ×400

圖2 Western blot法檢測小鼠睪丸Bcl-2、Bax和eNOS表達

本實驗顯示，8、12周小鼠睪丸曲細精管壁較4周明顯增厚，管腔中有大量精子發(fā)生，且增厚的生精上皮中分布著多數(shù)支持細胞和生殖細胞，說明進入性成熟期，生精上皮需增加并持續(xù)維持一定厚度，以便精子發(fā)生。睪丸微血管承擔氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物等的運輸，血睪屏障同時為精子發(fā)生提供一個穩(wěn)定環(huán)境。性成熟前期小鼠，血睪屏障及睪丸微循環(huán)并未發(fā)育完善，而雄激素對血睪屏障發(fā)育有促進作用，本實驗4周齡小鼠較8、12周齡eNOS表達最高，說明此時為成熟期的啟動做準備，而性成熟的啟動需要較高的雄激素，機體可能通過NO調(diào)節(jié)合成大量雄激素，進而完善自身的睪丸微循環(huán)和血睪屏障，完成啟動過程。而8、12周齡eNOS含量雖略低于4周齡小鼠，但仍保持一定含量，少量的NO有利于精子形成，提示也許當其已經(jīng)性成熟，機體便不必合成過多雄激素來維持睪丸微循環(huán)和血睪屏障的發(fā)育，只需一定量的雄激素維持并促進生精。4周齡小鼠高表達的eNOS，也提示較高的NO含量，NO作為一種血管舒張因子，擴張的血管也更有利于加快物質(zhì)運輸，提高代謝率，更利于小鼠盡快完成性成熟過程。

綜上所述，Bcl-2、Bax與eNOS均持續(xù)表達于小鼠各個發(fā)育時期，雖然作用高峰時間段不同，但共同促進性成熟發(fā)育，而在這之間是否仍存在一些未知因子參與啟動和調(diào)節(jié)這一過程，有待進一步研究。

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The correlation research on the expression of Bcl-2，Bax and eNOS in the ICR mice testicles

Zuo Lijun1,Ren Yaping2,Zhao Wei1,et al

(1Graduate School of Guilin Medical University,2Dept of Histology and Embryology,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004)

Objective To explore the expression and significance of the B-cell lymphoma/leukemia-2(Bcl-2),Bcl-2 associated X protein(Bax) in ICR mice testicles,and the correlation with endothelial nitric oxide synthase(eNOS).Methods 30 (4 weeks,8 weeks and 12 weeks respectively,each 10) healthy male ICR mice were divided into three groups randomly:young period,adolescent period and the period of sexual maturity.Paraffin section of the left testis was made, the expressions of the Bcl-2,Bax and eNOS in the testis of male mice were observed with immunohistochemical method.Then Western blot was carried out to screen the protein of Bcl-2,Bax and eNOS in the right side of the mice testicles.Results The Bcl-2 highly appeared in leydig cells,while Bax in rawhide cell.The expression of Bcl-2 in the 8-week-old mice leydig cells was significantly higher than that in 4 or 12-week-old groups. The protein levels of Bax in the 8-week-old mice was lower than that in 4 or 12-week-old group(P<0.05). Besides,the expression of eNOS in 4-week-old group was obviously higher than that of 8 or 12-week-old groups. (P<0.01). Conclusion There is no direct correlation between the expression of Bcl-2,Bax and eNOS in leydig cells. Nitric oxide(NO) may not directly be involved in the apoptosis activities of leydig cells.

eNOS;Bcl-2;Bax;androgen;sperm

時間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.010.html

廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項目(編號：2013ZD043)；桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)項目(編號：20130416-3)

桂林醫(yī)學(xué)院1研究生學(xué)院、2組織與胚胎教研室、32010級臨床本科，桂林 541004

左俐俊，女，碩士研究生；

任亞萍，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，責任作者，E-mail：yapingrengl@163.com

R 332；R 322.33；R 321.1

A

1000-1492(2016)01-0018-04

2015-10-13接收