陳 偉，方 圓，汪小五，許常青，朱晨辰，楊 宇，張龍龍，王林定

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◇基礎(chǔ)醫(yī)學研究◇

KSHV K15蛋白多克隆抗體的制備及其初步鑒定

陳 偉，方 圓，汪小五，許常青，朱晨辰，楊 宇，張龍龍，王林定

目的 制備卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒(KSHV)K15蛋白多克隆抗體，并將其應(yīng)用于細胞內(nèi)K15蛋白的檢測。 方法 選擇K15基因第8個外顯子(K15Pex8)序列做為模板，構(gòu)建 K15Pex8的表達載體pQE-80L-K15Pex8。誘導重組菌蛋白表達，免疫新西蘭兔，制備抗K15Pex8多克隆抗體，并用間接ELISA法測定抗體效價。將pFJ和pFJ-K15P兩種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入HEK 293T細胞，用Western blot法檢測抗K15Pex8多克隆抗體對K15P-Flag蛋白的識別。結(jié)果 由K15Pex8制備的抗K15Pex8多克隆抗體效價大于1 ∶6 400，能特異性識別重組質(zhì)粒pFJ-K15P轉(zhuǎn)染293T細胞產(chǎn)生的K15P-Flag融合蛋白。結(jié)論 初步證明K15Pex8蛋白有免疫反應(yīng)性，該多克隆抗體可用于重組的K15P-Flag融合蛋白的檢測。

卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒；K15基因；多克隆抗體

卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)又被稱為人類皰疹病毒8型(human herpesvirus 8，HHV-8)，于1994年Chang et al[1]在卡波氏肉瘤(Kaposi′s sacoma，KS)組織中發(fā)現(xiàn)，是引起KS的病原體[2]。研究[3]證明KSHV還是原發(fā)滲液性淋巴瘤(primary effusion lymphoma，PEL) 多中心性Castleman病(multicentric Castlemandisease，MCD)的病原體。K15基因位于KSHV最右端，由8個外顯子構(gòu)成，編碼一個有12個跨膜區(qū)域的糖蛋白[4]。該蛋白能與抗凋亡蛋白HAX-1結(jié)合，參與抗凋亡機制[5]。該實驗選擇K15的第8個外顯子序列為模板，通過PCR擴增，誘導表達，融合蛋白免疫新西蘭兔，產(chǎn)生多克隆抗體，旨在為KSHV的致病機制研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源 pFJ、pFJ-K15P、pQE-80L 3種質(zhì)粒，HEK293T細胞、宿主菌DH5α均由本實驗室保存。其中HEK293T細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有100 U/ml青霉素和100 g/ml鏈霉素。清潔級新西蘭白兔(約3 kg)購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶 BamH I、PCR高保真酶和蛋白質(zhì)預染Marker(美國Thermo公司)；提取試劑盒和凝膠純化試劑盒(北京天根生化有限公司);ClonExpressTMⅡ One Step Cloning Kit(一步法無縫克隆試劑盒)(南京諾唯贊生物科技有限公司);兔抗His多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司); 辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);不完全/完全福氏佐劑(美國Sigma公司)。

1.3 K15Pex8重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

1.3.1 K15Pex8基因的擴增 根據(jù)NCBI上K15基因第8個外顯子的基因序列，引物設(shè)計合成由上海生工生物工程有限公司完成，F(xiàn)：5’-TCACCATCACGGATCCACTTTACAAGGACTGCTGGTAT-3’；R：5’-GCTCGCATGCGGATCCCTAGTTCCTGGGAAATAAAACC-3’(下劃線部分代表BamH Ⅰ的酶切位點)。以已有的pFJ-K15P質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系總共25 μl，包括pFJ-K15P質(zhì)粒模板1 μl，10×PCR緩沖液2.5 μl，dNTP 2 μl，上下游引物各1 μl，高保真酶 1 μl，ddH2O 17.5 μl。PCR反應(yīng)體系：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，此過程共35個循環(huán)；之后72 ℃ 10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，以DL 2 000 Marker 為參照，切膠回收目的條帶并測定其濃度。

1.3.2 pQE-80L-K15Pex8重組載體構(gòu)建及鑒定 用BamH I單酶切pQE-80L載體，37 ℃ 酶切2 h，將其線性化，切膠回收，并測定其濃度。按照ClonExpressTMII One Step Cloning Kit的說明書進行重組載體構(gòu)建。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞后均勻涂布于含有氨芐青霉素(Amp)的平板中，18～24 h 后挑取陽性克隆，搖菌30%甘油保存于-80 ℃冰箱。用試劑盒提取質(zhì)粒，進行酶切鑒定，并送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.4 目的蛋白的誘導表達及純化

1.4.1 目的蛋白誘導表達 -80 ℃ 冰箱取出含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌，5 μl菌液加到5 ml含5 μl Amp的液體培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)過夜，進行復蘇，次日將菌液按1 ∶100的比例接種于3 ml含3 μl Amp的新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)4 h，之后取1 ml菌液12 000 r/min離心1 min，棄去上清液，加入1×SDS-PAGE的上樣緩沖液100 μl，-20 ℃保存，作為誘導前樣本。剩余菌液加入IPTG誘導(終濃度1 mmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，取1 ml菌液12 000 r/min離心1 min，棄上清液留沉淀，同樣加入1×SDS-PAGE的上樣緩沖液100 μl。誘導前后樣本SDS-PAGE電泳，檢測目的蛋白的表達。

目的蛋白表達后進行擴大培養(yǎng)。-80 ℃ 冰箱取出轉(zhuǎn)化菌進行復蘇，次日5 ml菌液轉(zhuǎn)入500 ml含Amp的培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min搖床培養(yǎng)4 h后加入IPTG(終濃度1 mmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)，6 h后菌液經(jīng)4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集沉淀。菌體沉淀用100 ml裂解緩沖液(非變性)重懸，加入蛋白酶抑制劑(PMSF)和溶菌酶混勻，終濃度分別為(1 mmol/L 和 1 mg/ml)，冰上靜置20 min后，在冰浴中進行超聲破碎：功率 300 W，工作3 s，暫停5 s，每次工作6 min，總時間18 min，每次間隔5 min。超聲破碎后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，上清液即為上清粗蛋白。沉淀用50 ml裂解液(變性)溶解，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，上清液即為包涵體粗蛋白，所得蛋白分別經(jīng)SDS-PAGE電泳，確定目的蛋白的表達形式。

1.4.2 目的蛋白的純化 將已預處理好的Ni-NTA懸浮液混勻填裝到親和層系柱中，用10倍柱體積的超純水清洗柱子，上清粗蛋白經(jīng)Ni-NTA柱進行純化。先后用10 ml裂解緩沖液和10 ml洗脫緩沖液過柱，去除雜蛋白，最后用10 ml洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定。

1.5 多克隆抗體的制備及檢測

1.5.1 動物免疫制備多克隆抗體 取3只健康的新西蘭白兔分別標記為RA1、RA2、RA3。免疫前心臟取血2 ml，取血清作為陰性對照。將制備好的蛋白抗原200 μg與完全弗氏佐劑1 ∶1充分混勻后，經(jīng)皮下、背部等多點注射。第2周將蛋白抗原100 μg與不完全弗氏佐劑充分混勻，同上加強免疫。每隔1周加強免疫1次，總共免疫4次，末次免疫前取耳緣靜脈血，Western blot檢測抗體是否產(chǎn)生。第4次加強免疫后7 d，采集兔心臟血60～80 ml，分離出血清，無菌分裝，于-80 ℃ 冰箱保存。

1.5.2 ELISA法檢測抗K15Pex8多克隆抗體效價 用1 μg/L K15Pex8蛋白包被ELISA板，4 ℃孵育過夜，每孔100 μl。次日以含1%小牛血清的封閉液37 ℃條件下封閉，2 h后洗滌，以免疫前采集的兔血清為對照，將抗血清1 ∶200、1 ∶400、1 ∶800、1 ∶1 600、1 ∶3 200、1 ∶6 400、1 ∶12 800、1 ∶25 600稀釋后每孔100 μl加到包被好的ELISA檢測板，37 ℃溫育30 min后PBST洗滌3次，每孔加入1 ∶5 000稀釋的HRP標記羊抗兔IgG 100 μl，37 ℃ 孵育1 h后洗滌5次，每孔加入100 μl四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 底物后于37 ℃溫育10 min，加終止液終止反應(yīng)。酶標儀檢測450 nm波長下的吸光度(absorbance, A) 值。結(jié)果判定: A450 nm<0.1為陰性血清，A450 nm>1.0為陽性血清，以陽性血清的最高稀釋倍數(shù)作為抗體血清ELISA效價。

1.5.3 檢測抗K15Pex8多克隆抗體的特異性 將本實驗室保存含K15基因的真核表達載體pFJ和pFJ-K15P對照兩種載體分別轉(zhuǎn)入HEK 293T細胞，通過Western blot檢測該多克隆抗體能否特異性識別細胞表達的K15P-Flag蛋白。

2 結(jié)果

2.1 pQE-80L-K15Pex8重組載體構(gòu)建及鑒定 以實驗室保存的重組質(zhì)粒pFJ-K15P為模板，擴增出K15Pex8基因，在462 bp位置處出現(xiàn)目的條帶。見圖1A。根據(jù)ClonExpressTMII One Step Cloning Kit的說明書進行重組載體構(gòu)建。經(jīng)BamH I酶切后出現(xiàn)載體pQE-80L和K15Pex8，大小分別為4 751 bp和462 bp兩條條帶。見圖1B。重組質(zhì)粒進行測序，并與GenBank中的序列進行比對，結(jié)果正確，證明重組質(zhì)粒連接成。

2.2 目的蛋白的表達純化 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α中，經(jīng)IPTG誘導表達出約15 ku的目的蛋白，如箭頭所指。見圖2。

2.3 抗K15Pex8多克隆抗體效價測定結(jié)果 未免疫前心臟取血作為陰性對照血清。第5次加強免疫后的第7天，取得血清，通過間接ELISA方法分別檢測3只兔所產(chǎn)生的抗K15Pex8血清的效價，結(jié)果3份血清的效價均大于1 ∶6 400。見表1。

表1 抗K15Pex8 多克隆抗體效價測定

圖1 K15Pex8 基因的PCR擴增及重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

A：K15Pex8基因PCR擴增圖；B：重組質(zhì)粒酶切鑒定圖；M：DNA Marker;1：PCR擴增產(chǎn)物462 bp；2：重組pQE-80L-K15Pex8質(zhì)粒；3：重組質(zhì)粒酶切

圖2 K15Pex8 蛋白的表達及純化

M：Marker；1：誘導前的重組菌；2：誘導6 h后的重組菌；3：超聲破碎后的上清液；4：超聲破碎后的包涵體；5：Ni2+柱親和層析純化后的上清蛋白

2.4 抗K15Pex8多克隆抗體的特異性的檢測結(jié)果 采用陰性和陽性的血清作為一抗，收集轉(zhuǎn)染到HEK 293T細胞的pFJ和pFJ-K15P兩種質(zhì)粒產(chǎn)生的蛋白，檢測所制備多抗的特異性。結(jié)果顯示pFJ-K15P質(zhì)粒產(chǎn)生的蛋白與抗K15Pex8多克隆抗體有免疫印跡，而其他均無免疫印跡，初步判斷抗K15Pex8多克隆抗體能特異性識別重組質(zhì)粒pFJ-K15P轉(zhuǎn)染293T細胞產(chǎn)生的K15P-Flag融合蛋白。見圖3。

3 討論

KSHV 又名Kaposi肉瘤相關(guān)皰疹病毒，屬于γ皰疹病毒亞科，為雙鏈DNA病毒[6]。研究[7]表明KS有4種不同的類型，經(jīng)典型KS、地域型KS、AIDS相關(guān)型KS和移植型KS。KSHV通常在非洲、部分歐洲地區(qū)及地中海國家比較常見，但近些年來在美洲地區(qū)、臺灣及韓國也出現(xiàn)卡波氏肉瘤病例[8]。我國對KSHV的研究開展稍晚，有研究[9]顯示我國新疆地區(qū)典型KS發(fā)病率較高，而在其他區(qū)域或民族人群發(fā)病較罕見。

圖3 Western blot 檢測 抗K15Pex8 多克隆抗體的特異性

A：陰性血清；B：含抗K15Pex8多克隆抗體的血清；1、2：轉(zhuǎn)染pFJ載體產(chǎn)生的蛋白樣品；3、4：轉(zhuǎn)染pFJ-L15P重組質(zhì)粒產(chǎn)生的蛋白樣品；GAPDH：內(nèi)參

K15基因存在至少3種等位基因，P、M和N，P和M型之間存在65%的保守區(qū)域，N型僅在非洲南部地區(qū)有發(fā)現(xiàn)，KS病例中主要是P型[10]。K15基因由8個外顯子構(gòu)成，編碼一個帶有12個跨膜區(qū)域和一個C末端位于細胞質(zhì)中，編碼一個保守的SH 2，能與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子和酪氨酸激酶(Src)相互作用[11]，進一步激活NF-κB、JNK和MAPK等信號途徑[12]。

本研究通過PCR擴增目的基因，一步克隆法連接到表達載體pQE-80L，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化、誘導表達出目的蛋白。有文獻[13]報道在K15基因的末端加上標簽基因，作為K15蛋白的檢測，這樣容易使K15蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，不能識別相應(yīng)的蛋白。本實驗通過選擇該基因的一段序列作為模板，因此避免這樣的問題。此外該蛋白雖然在包涵體中也有表達，但在破碎上清液的表達比例較高，所以純化上清液得到可溶性蛋白。純化得到的蛋白做為抗原免疫新西蘭兔，制備出多克隆抗體，并且多抗的效價達到了1 ∶6 400，同時多抗也能特異性地識別K15P-Flag融合蛋白，因此本實驗的成果為K15基因的功能和KSHV致病機制的研究提供了基礎(chǔ)。

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Generation of polyclonal antibody of Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus K15 and its preliminary identification

Chen Wei, Fang Yuan, Wang Xiaowu, et al

(Dept of Microbiology, Anhui Medical University, Hefei 230032)

Objective To generate rabbit polyclonal antibody against Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) encoding peptides of K15, identify the detection of K15P protein in cell. Methods After selecting the eighth exon (EX8) sequence of K15P gene as a template, the recombinant plasmid named pQE-80L-K15Pex8was constructed. Recombinant protein was induced and expressed. New Zealand white rabbits were immunized with the K15Pex8to generate polyclonal antibodies against K15P. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was applied to characterize the titers of the polyclonal antibody. The two recombinant plasmids, pFJ and pFJ-K15P, were transfected HEK 293T cells to produce K15P-Flag fusion protein,which was identified by Western blot.Results The titer of the polyclonal antibody against K15P was more than 1 ∶6 400 with indirect ELISA and could react specifically with the K15P-Flag fusion protein in 293T cells. Conclusion We preliminarily find K15Pex8protein has immunoreactivity and the rabbit polyclonal antibody against K15P could react with the K15P-Flag fusion protein.

Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus;K15P gene;polyclonal antibody

時間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.002.html

國家自然科學基金(編號：81271837)；安徽高校省級自然科學研究項目(編號：KJ2012A161)；安徽醫(yī)科大學博士科研經(jīng)費資助項目(編號：XJ200914)

安徽醫(yī)科大學微生物學教研室，合肥 230032

陳 偉，男，碩士研究生；

王林定，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail: wanglinding@ahmu.edu.cn

R 373.4

A

1000-1492(2016)01-0001-04

2015-10-22接收