祝凱麗

（青島農(nóng)業(yè)大學，山東 青島 266109）

海藻酸鈉對生鮮雞肉肌原纖維蛋白凍融引起的功能性和流變性影響

祝凱麗

（青島農(nóng)業(yè)大學，山東 青島 266109）

本試驗采取對添加海藻酸鈉的試驗組和未添加海藻酸鈉的對照組進行反復凍融4次，通過測定每次凍融后的樣品進行樣品蛋白含量、鹽溶性蛋白含量、乳化性、總巰基含量、蛋白質(zhì)Ca2+--ATPase活性、蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的測定、肌原纖維蛋白SDS-PAGE的分析和動態(tài)流變性的方法，探究海藻酸鈉對反復凍融的生鮮雞肉中所提取的肌原纖維蛋白所引起的功能特性和流變特性的影響。結(jié)果表明，隨著反復凍融次數(shù)的增加，樣品蛋白含量、鹽溶性蛋白含量、乳化性、總巰基含量、蛋白質(zhì)Ca2+--ATPase活性和蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性均是逐漸降低的，試驗組樣品各指標的降低程度小于對照組。蛋白質(zhì)的動態(tài)流變學特性的測定說明試驗組比對照組的凝膠能力強，變性溫度高,為生產(chǎn)加工提供理論依據(jù)。

肌原纖維蛋白；海藻酸鈉；反復凍融；蛋白質(zhì)變性

反復凍融使樣品中小冰晶體重結(jié)晶從而在肌原纖維中重新分布，導致細胞結(jié)構(gòu)被破壞，肌原纖維蛋白變性，質(zhì)構(gòu)變化，降低了動物產(chǎn)品的食用價值[1]。肌原纖維蛋白是由肌球蛋白、肌動蛋白、肌動球蛋白以及被稱為調(diào)節(jié)蛋白的原肌球蛋白、肌鈣蛋白所組成的復合體[2]，因此反復凍融過程中肉類蛋白的變性主要是肌原纖維蛋白的變性[3]。肉類中肌原纖維蛋白的冷凍變性導致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性發(fā)生改變，但并不破壞蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，此現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性[4]。

海藻酸鈉是從褐藻植物中提取的一種天然多糖類物質(zhì)，是由α-L-甘露糖醛酸（M段）和β-D-古羅糖醛酸（G段），通過1,4-糖苷鍵連接而成，分子式：（C6H 7O 6N a）n[5]，在食品工業(yè)中被廣泛用作穩(wěn)定劑、增稠劑、粘結(jié)劑、乳化劑和凝固劑等[6]，可增加肉制品的膠著性、持水性和柔嫩性，減少營養(yǎng)成分損失，提高了產(chǎn)品的質(zhì)量[7]。本試驗采取對添加海藻酸鈉的試驗組和未添加海藻酸鈉的對照組進行反復凍融4次，測定指標，為實際的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器設(shè)備

1.1.1試驗材料與試劑材料：正大新鮮雞大胸肉（大潤發(fā)超市購買）。

主要試劑：Tri s-m al eate緩沖液、三氯乙酸（TCA）、硫酸亞鐵-鉬酸銨、0.1 m ol/L CaCl2、0.02 m ol/L ATP、雙縮脲試劑、玉米油、0.2 m ol/ L Tri s-H Cl（pH 6.8）、0.1%DTN B、蛋白質(zhì)M arker（14.4～116.0 KD）、過硫酸銨（APS）等。

1.1.2儀器設(shè)備UV-2000型紫外可見分光光度計、電子分析天平（型號：TE124S）、電子天平（型號：008040）、高速冷凍離心機、凝膠成像儀、差示掃描量熱儀、動態(tài)流變儀（型號：M CR102）等。

1.2試驗方法

1.2.1樣品的預處理選購新鮮的同一批次的雞胸脯肉，去除表面脂肪組織和結(jié)締組織，然后將其順肌原纖維方向分割為大小1 cm3的肉塊，將分割好的肉塊分為兩份，一份為試驗組，另一份為對照組。試驗組肉塊浸泡在0.4%的海藻酸鈉溶液中1 h，用鑷子夾出放入3個自封袋中，每袋100 g，分別編號為試驗1組、試驗2組、試驗3組。同時，對照組不做任何處理的肉塊也分別放入3個自封袋中，每袋100 g，分別編號為對照1組、對照2組、對照3組。將試驗組和對照組的樣品放入-18℃的冰箱中冷凍4 d，過后，將其轉(zhuǎn)移至4℃冷藏室中解凍12 h，即凍融一次完成。從每個自封袋中各取25 g肉塊用絞肉機粉碎，進行試驗各指標的測定。然后再將剩余樣品放入-18℃的冰箱中冷凍4 d，依此方法反復凍融4次，每一次相應(yīng)的做各指標的測定。

1.2.2CCMP的提取和測定采用雙縮脲法測定肌原纖維蛋白含量。用電子分析天平準確稱取酪蛋白0.05 g溶于0.05 m ol/L的N aO H溶液中，并定容至10 m L，即為5 m g/m L的標準蛋白溶液，取12支試管分為兩組，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 m L的標準蛋白溶液，用水補足到l m L，在每個試管中加入4 m L雙縮脲試劑，得到每管中的蛋白質(zhì)含量分別為0、1、2、3、4、5 m g，充分搖勻后，在室溫（20～25℃）下放置30 m i n，于540 nm處進行比色測定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫坐標，光吸收值為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.3鹽溶性蛋白含量測定在蛋白質(zhì)溶解后，取0.5 m L于試管中，加水至1 m L，加入雙縮脲試劑4 m L，充分混勻后，在室溫下（20～25℃）靜止10 m i n，測吸光度，平行測3次。

1.2.4生化活性數(shù)據(jù)測定對肌原纖維蛋白Ca2+--ATPase活性、標磷、Ca2+--ATPase活性、肌原纖維蛋白乳化特性、總巰基含量、DSC蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性、SDS-PAGE（SDS-凝膠電泳）、動態(tài)流變性分別進行測定，用EXCEL對測定指標進行統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1海藻酸鈉對反復凍融的肌原纖維蛋白含量的影響

2.1.1蛋白質(zhì)標準曲線見圖1。

2.1.2蛋白質(zhì)含量的測定見圖2。圖2表明，隨著凍融次數(shù)的增加，對照組和試驗組的蛋白質(zhì)含量都呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢，這是由于反復凍融使樣品中的冰晶體重結(jié)晶從而在肌原纖維中重新分布，導致細胞結(jié)構(gòu)被破壞，肌原纖維蛋白變性。而試驗組肌原纖維蛋白變性趨勢較對照組肌原纖維蛋白變性趨勢平緩，這是由于海藻酸鈉在冷藏制品的加工中可以較好地抑制冰晶體的增長，能夠較好地緩解由于溫度波動而使肌原纖維蛋白變性的現(xiàn)象。

2.2海藻酸鈉對反復凍融的肌原纖維蛋白中鹽溶性蛋白含量變化見圖3。

圖1 蛋白質(zhì)標準曲線Fig.1The standard curve of protein

圖2 樣品蛋白含量變化Fig.2The change of protein content in samples

圖3 鹽溶性蛋白含量變化Fig.3The change of salt soluble protein content

在反復凍融過程中，肌原纖維蛋白部分結(jié)合水形成冰晶，這使得肌動球蛋白分子之間可以相互形成非共價鍵（疏水鍵和氫鍵），進而形成超大分子的不溶性凝集體，導致在凍藏過程中其溶出量不斷下降[8]。鹽溶性蛋白的減少是蛋白質(zhì)變性的一個主要指標，這與氫鍵和疏水鍵的結(jié)構(gòu)和二硫鍵同離子的相互作用有關(guān)[9]。試驗結(jié)果顯示，對照組的鹽溶性蛋白和試驗組的鹽溶性蛋白都呈現(xiàn)出下降趨勢，但兩組試驗下降趨勢平緩程度接近，出現(xiàn)這種情況的原因可能是海藻酸鈉對于鹽溶性蛋白提取的影響是不明顯的。

2.3海藻酸鈉對反復凍融的肌原纖維蛋白CCaa22++----ATTPPaassee活性的影響

2.3.1標磷測定見圖4。

2.3.2Ca2+--ATPase活性的測定見圖5。

ATPase活性是個非常好的表現(xiàn)蛋白質(zhì)分子完整性的指標[10]，ATPase活性降低說明了反復凍融破壞肌原纖維蛋白的完整性，進而會降低肌原纖維蛋白的功能特性，特別是凝膠特性[11]?？梢姾Ｔ逅徕c能夠防止肌原纖維蛋白Ca2+--ATPase活性大幅下降，從而很好地抑制肌原纖維蛋白變性。

2.4海藻酸鈉對反復凍融的肌原纖維蛋白乳化性的影響見圖6。

圖4 磷酸量標準曲線Fig.4The standard curve of phosphoric acid

圖5 Ca2+--ATPase活性變化Fig.5The change of Ca2+--ATPase activity

圖6 肌原纖維蛋白乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)的變化Fig.6The change of myofibril protein’s EAI and ESI

蛋白質(zhì)的乳化特性表明蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與脂肪交聯(lián)的能力，蛋白質(zhì)乳化性和乳化穩(wěn)定性受很多因素的影響[12]。試驗結(jié)果顯示，試驗組和對照組的EAI、ESI都呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，說明隨著反復凍融次數(shù)的增加，肌原纖維蛋白的乳化活性逐漸降低，乳化穩(wěn)定性也呈降低趨勢，因為反復凍融的次數(shù)增多，使其改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，肌原纖維的交聯(lián)程度增大，使蛋白質(zhì)發(fā)生了變性，增加了表面疏水性，降低了蛋白質(zhì)的凝膠特性，喪失了表面吸附脂肪顆粒的靈活性[13]。圖示表明試驗組的乳化活性和乳化穩(wěn)定性都較對照組高，這說明海藻酸鈉作為乳化劑添加在肉樣中，能夠使提取的肌原纖維蛋白分散均勻，使蛋白質(zhì)凝膠體系更加穩(wěn)定，乳化活性提高。

2.5海藻酸鈉對反復凍融的肌原纖維蛋白總巰基含量的測定見圖7。

圖7總巰基含量的變化Fig.7The change of the total sulphur content

圖7 表明，隨著凍融次數(shù)的增加，試驗組和對照組肌原纖維蛋白總巰基含量都有明顯的下降趨勢。在第一次凍融過程中，試驗組和對照組總巰基含量大致相同，變化不明顯，而在第一次凍融后總巰基含量明顯降低且試驗組總巰基含量明顯高于對照組總巰基含量。在反復凍融過程中總巰基含量的減少是因為肌原纖維蛋白的巰基被氧化，肌球蛋白分子變性加劇，頭部構(gòu)象發(fā)生變化，活性巰基暴露而被氧化[14]。而試驗組巰基含量高于對照組巰基含量是因為海藻酸鈉的凝膠特性，維持肌原纖維蛋白的三維結(jié)構(gòu)，保護巰基不被氧化。

2.6海藻酸鈉對反復凍融的肌原纖維蛋白熱穩(wěn)定性的影響

表1 差示掃描熱量計（DSC）分析結(jié)果Table1Results of DSC analysis

表1表示了凍融次數(shù)對未添加海藻酸鈉的雞肉峰Ⅰ、峰Ⅱ、峰Ⅲ變性溫度和變性焓值的影響，隨著凍融次數(shù)的增加，第一個峰的變性溫度呈逐漸減小的趨勢，這種趨勢說明隨著凍融次數(shù)的增加，肌球蛋白越易變性，而肌漿蛋白和肌動蛋白變性溫度沒有明顯的規(guī)律，不能判斷凍融次數(shù)對這兩種蛋白質(zhì)變性的影響。添加加海藻酸鈉的雞胸肉分別在1次凍融、2次凍融、3次凍融、4次凍融后的肌肉蛋白質(zhì)DSC熱流圖，圖中每個曲線都有2個吸收峰：58℃左右和77℃左右，說明這兩個吸收峰分別是肌球蛋白頭部變性和肌動蛋白變性引起的，肌漿蛋白和肌球蛋白尾部的焓變點未在DSC譜圖上顯示，說明海藻酸鈉的添加影響了肌漿蛋白和肌球蛋白尾部的變性。

由表2呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)趨勢分析可知，肌球蛋白的變性溫度波動幅度不明顯，說明添加海藻酸鈉的樣品肌原纖維蛋白變性不明顯。而焓值除個別數(shù)據(jù)出現(xiàn)很大程度的偏差外其余呈下降趨勢，說明肌原纖維蛋白隨著凍融次數(shù)的增加也有一定程度的變性。

2.7海藻酸鈉對反復凍融的肌原纖維蛋白流變學特性的影響見圖8和圖9。

表2 差示掃描熱量計（DSC）分析結(jié)果Table2Results of DSC analysis

圖8 反復凍融對對照組肌原纖維蛋白的溫度掃描譜圖Fig.8The temperature scanning spectra of the control group that repeated freezing and thawing four times

圖9 反復凍融對試驗組肌原纖維蛋白溫度掃描譜圖Fig.9The temperature scanning spectra of the experimental group that repeated freezing and thawing four times

通過對肌原纖維蛋白溶液應(yīng)力掃描確定線性粘彈區(qū)，確定了最佳應(yīng)變?yōu)?.5%，頻率設(shè)置在0.1～10 H z。上述圖顯示，在相同的震蕩頻率下，不同凍融次數(shù)的添加海藻酸鈉的試驗組中的G′均高于未添加海藻酸鈉的對照組樣品的G′。這種結(jié)果表明海藻酸鈉的添加增加了體系的凝膠彈性。

3 小結(jié)

生鮮雞肉的反復凍融能夠改變肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)，隨著反復凍融次數(shù)的增加，肌原纖維蛋白的含量，肌原纖維蛋白的Ca2+--ATPase活性、總巰基含量、乳化性都是逐漸降低的，通過DSC譜圖分析，隨著反復凍融次數(shù)的增加，熱轉(zhuǎn)變溫度和焓值都是逐漸降低的；肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳譜圖分析結(jié)果顯示，反復凍融次數(shù)越多，蛋白質(zhì)降解越明顯。反復凍融過程改變了蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)，從而影響雞肉肌原纖維蛋白的功能特性。通過肌原纖維蛋白流變學特性的變化分析，反復凍融的過程降低了蛋白質(zhì)的凝膠化作用，使得流變學參數(shù)儲能模量G′值明顯降低。

海藻酸鈉作為食品添加劑添加到低溫肉制品中，可改善肉制品的物理性質(zhì)，增加粘度，富于其良好的口感，同時可增加肉制品的膠著性、持水性和柔嫩性，減少營養(yǎng)成分損失，從而提高了產(chǎn)品的質(zhì)量。添加海藻酸鈉的試驗組相對于對照組能夠減緩蛋白質(zhì)的變性速率，使得試驗中各指標都顯著高于未添加海藻酸鈉的對照組。蛋白質(zhì)的動態(tài)流變學特性的測定也說明試驗組比對照組的凝膠能力強，變性溫度高。許多研究人員將海藻酸和海藻酸鈉/鈣應(yīng)用于肉制品中，以改善肉類產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)。添加海藻酸鈉的肌原纖維蛋白經(jīng)過反復凍融，蛋白質(zhì)變性能夠得到極大的改善。

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The effects of the functional characteristics and the rheological properties on myofibril protein that caused by sodium alginate

Zhu Kai l i
(Q i ngdao agri cul tural uni versi ty,ShandongQ i ngdao266109)

Addi ng sodi um al gi nate group and w i thout addi ng sodi um al gi nate w i th a controlgroup repeated freezi ng and thaw i ng on 4 ti m es.M easuri ng the sam pl es every ti m e afterfreezi ng and thaw i ng,sal tsol ubl e protei n contenti n the sam pl e protei n,em ul si fi cati on,totalsul phur content,Ca2+protei n ATPase acti vi ty and protei n determ i nati on of therm alstabi l i ty,m yofi bri lprotei n sds-page anal ysi s and dynam i c rheol ogi calm ethod.Expl ori ng the functi onaland characteri sti cs on repeated freezi ng and thaw i ng raw chi cken.The resul ts show that w i th the num ber i ncreasi ng,the repeated freezi ng and thaw i ng sam pl e protei n content,sal t sol ubl e protei n content,em ulsi fi cati on,totalsul phur content,Ca2+-protei n ATPase acti vi ty and protei n therm alstabi l i ty are gradual l y reduced.Extent of the test sam pl es of each i ndex w as l ess than the controlgroup.Dynam i c rheol ogi calproperti es ofprotei n determ i nati on show ed that experi m entalgroup i s stronger than the controlgroup i n the gelcapabi l i ty.And the tem perature i s hi gher than controlgroup. Thi s paperprovi ded theoreti cal basi s for producti on and processi ng.

M yofi bri l protei n;Sodi umal gi nate;Repeated freezi ng;Thaw i ng protei n degenerati on

TS251.1

B

1672-9692(2016)07-0006-08

2016-05-26

祝凱麗（1982-），女，?？疲饕獜氖氯怆u品質(zhì)檢測工作。