徐睿，季芳，李夢龍

（1.西昌學院動物科學學院，四川 西昌 615013；

2.四川省涼山州德昌縣農(nóng)牧局飼料監(jiān)測站，四川 德昌 615500）

雞致病性大腸桿菌16S rRNA PCR鑒定方法的建立

徐睿1，季芳2，李夢龍1

（1.西昌學院動物科學學院，四川 西昌 615013；

2.四川省涼山州德昌縣農(nóng)牧局飼料監(jiān)測站，四川 德昌 615500）

為了建立一種雞致病性大腸桿菌的快速檢測方法，本試驗通過無菌采集疑似感染致病性大腸桿菌雞的心、肝、脾、腎作為病料，經(jīng)過細菌分離培養(yǎng)、生化鑒定和致病力試驗，利用大腸桿菌16S rRNA通用引物對3株致病菌進行PCR擴增，均得到了特異性擴增產(chǎn)物。并對擴增產(chǎn)物進行核酸測序和BLAST比對。結果顯示，分離得到3株雞致病性大腸桿菌（DZMG、DGCG1、DGCP3），擴增出的16S rRNA基因序列與雞致病性大腸桿菌基因序列同源性為100%。提示該檢測方法具有特異性高和簡單快捷的特點。

雞致病性大腸桿菌；分離培養(yǎng)；16S rRNA；PCR鑒定

雞大腸桿菌病是一種在特定情況下由某些致病性大腸桿菌引起雞發(fā)病或死亡的細菌性傳染病，是一類禽類急性和全身性疾病，病型復雜，對養(yǎng)雞業(yè)造成極大危害和重大經(jīng)濟損失[1]。禽致病性大腸桿菌屬于埃希菌屬，為直桿菌，革蘭氏陰性，無芽孢，屬于兼性厭氧型，常以散在或成對的形式存在[2]。雞大腸桿菌病會引起雞的心包炎、肝周炎、氣囊炎、輸卵管炎、腹膜炎、肺炎、肉芽腫和全眼球炎等[3]，嚴重時甚至引起菌血癥、急性敗血癥導致雞死亡。因此，建立一種有快速、準確、有效的檢測方法對預防和治療該病尤為重要。

16S rRN A素有“細菌化石”之稱，16S rRN A存在的保守區(qū)為所有的細菌所共同擁有，具有十分高的保守性，因此，通過設計細菌通用引物是可以將此實現(xiàn)菌種鑒定的[4]。PCR技術具有高特異性、高靈敏度和操作簡易等諸多特點，目前它已經(jīng)被廣泛應用于食源性致病菌檢測技術的研究和開發(fā)[5]。本次試驗利用PCR技術和16S rRN A保守性高的這些特點，建立一種雞致病性大腸桿菌16S rRN A PCR快速鑒定方法。

1 試驗材料

1.1試驗器材解剖器材、顯微鏡恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、PCR儀、電泳儀、瓊脂凝膠成像系統(tǒng)等。

1.2藥品和試劑營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（購自杭州濱和微生物試劑有限公司）、革蘭氏染色液試劑盒（購自青島高科園海博生物技術有限公司）、生化發(fā)酵管（購自杭州微生物試劑有限公司提供）、M IX（Taq DN A聚合酶、dN TPs、緩沖液）、DL2000DN A M arker、瓊脂糖凝膠DN A回收試劑盒（購自北京天根生物科技有限公司）。

大腸桿菌ATCC35218（DZK）、金黃色葡萄球菌ATCC29213（J ZK）、乙型副傷寒沙門氏菌CM CC50094（SZK）、肺炎克雷伯氏菌CM CC46117（KZK）標準菌株購于中國獸醫(yī)監(jiān)察所。

2 試驗方法

2.1病料采集從西昌市周邊3個養(yǎng)雞場（編號為XN、GC、ZM）中采集的疑似病雞在無菌條件下取出的心（X）、肝（G）、脾（P）、腎（S）作為病料。

2.2病原菌分離鑒定

2.2.1病原菌分離培養(yǎng)無菌采集病料深部組織接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃，培養(yǎng)16～24 h，挑取典型菌落2～3個接種于伊紅美蘭培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基，37℃，培養(yǎng)16～24 h，挑取典型菌落2～3個接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)，37℃，培養(yǎng)16～24 h后，備用。

2.2.2生化鑒定對分離出的病原菌接種于蔗糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇等生化發(fā)酵管，置于37℃，培養(yǎng)24 h，觀察。

2.3致病力試驗將試驗菌液濃度調整為1個麥氏單位，細菌濃度為3×108cl f/L菌液備用。

將1日齡的雛雞進行分組，雛雞處理見表1。

表1 致病力試驗分組Table1Pathogenicity test group

對5組雛雞連續(xù)觀察48 h的，并每12 h記錄一次雛雞的發(fā)病和死亡情況。試驗結束后將雛雞全部處死，并無菌采取病料回收菌株。

2.41166S rRN A PCCRR檢測方法的建立

2.4.1引物設計本次試驗根據(jù)GenBank中公布的大腸桿菌16S rRN A通用引物，由上海杰李生物公司合成，其PCR產(chǎn)物為552 bp。

2.4.2病原菌的PCR擴增本試驗采用單菌落PCR，試驗采用采用25 μL體系，見表2。

表2 PCR反應體系Table2PCR reaction system

反應程序為：94℃預變性5 m i n，94℃變性45 s、56.1℃退火45 s、72℃延伸50 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5 m i n。

反應結束后取10 μL PCR產(chǎn)物，于1%瓊脂糖凝膠，以115 V、100 m A于1×TBE緩沖液中電泳45 m i n后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)成像、記錄。

2.4.3克隆測序將回收的PCR產(chǎn)物按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明，對DN A回收后，送至上海杰李生物公司進行克隆測序。并在美國國家生物技術信息中心（N CBI）數(shù)據(jù)庫，運用Bl ast軟件進行比對。

3 試驗結果

3.1解剖結果病死雞關節(jié)腫脹變形，皮膚及大腿肌肉內可見散在出血點，肝臟明顯腫大，心包膜增厚，小腸黏膜充血，可見散在出血點。

3.2病原菌分離培養(yǎng)結果病料接種于營養(yǎng)瓊脂上，可見圓形、半透明、表面濕潤的單個菌落；麥康凱培養(yǎng)基上可見光滑的粉紅色菌落；伊紅美蘭培養(yǎng)基上有黑色有金屬光澤的圓形菌落。挑取典型菌落經(jīng)革蘭氏染色后，可見革蘭氏陰性的短桿菌兩端鈍圓，大多數(shù)散開排列少數(shù)有2個連在一起，與相關的文獻描述一致[6]，如圖1所示。

圖1 病原菌革蘭氏染色結果Fig.1Gram stain results of pathogenic bacteria

3.3生化鑒定結果生化鑒定試驗結果如表3所示。

表3 生化鑒定結果Table3Results of biochemical identification

從表3可以看出，菌株DZM G與菌株DZK的生化特性一致，而且菌株DGCG1和DCGP3的生化特性與菌株DZK的生化特性基本相同，所以初步判定DZM G、 DGCG1、DGCP3這3株菌株符合大腸桿菌的生化特性。

3.4致病力試驗結果分離到的3株菌株（DZM G、DGCG1、DGCP3）進行致病力試驗的結果如表4所示。

表4 致病力試驗雛雞死亡情況記錄表Table4Mortality of chickens in pathogenicity test

從表4可以看出本次試驗所用的3株菌株均存在致病性，而且DZM G致病力最強，死亡率100%；DGCP3的致病力次之，死亡率75%；DGCG1的死亡率只有50%。

3.5試驗菌株1166S rRRNN AA檢測結果將PCR產(chǎn)物，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察的結果如圖2所示。

圖2 試驗菌株16S rRNA PCR結果Fig.2Results of 16S rRNA PCR test

從圖2可以看出，試驗菌DZM G、DGCG1、DGCP3均得到552 bp的特異性條帶，而對照菌J ZK、SZK、KZK均未得到相應條帶。

3.6測序結果經(jīng)過克隆測序后發(fā)現(xiàn)試驗菌株的16S rRN A基因序列與雞致病性大腸桿菌16S rRN A序列同源性為100%。

4 討論與分析

本次試驗通過對病原菌分離培養(yǎng)、生化試驗和致病力試驗，結果表明，3株試驗菌株（DZM G、DGCG1、DGCP3）均為致病性大腸桿菌。同時，對3株菌株進行分子生物學鑒定，所得到的16S rRN A序列通過在N CBI數(shù)據(jù)庫中運用BLAST程序進行比對，結果發(fā)現(xiàn)3個試驗菌株與大腸桿菌的同源性達到100%，根據(jù)M at suki的研究，凡是16S rRN A序列的同源性大于97%便可認為是同一種[7]，說明16S rRN A對菌株的鑒定結果與分離培養(yǎng)生化鑒定的結果是一致的。但是，傳統(tǒng)的分離鑒定試驗存在試驗周期長、工作量大而繁雜、準確性差等問題，而16S rRN A PCR鑒定方法則周期短、成本低、準確性高等優(yōu)勢。

圖3 試驗菌株16S rRNA同源性比對結果Fig.3Homology comparison results of test strains16S rRNA

近幾年，PCR技術在實驗室檢測技術中發(fā)展快速，在醫(yī)學檢驗方面有著十分突出成果[8]的技術，并廣泛應用到了環(huán)境細菌學檢驗、臨床細菌學檢驗、流行病學調查等領域。隨著集約化養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展迅速，雞致病性大腸桿菌病是生產(chǎn)中常見細菌病，并在一定程度上危害養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展，給養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展造成嚴重的經(jīng)濟損失[9]。所以，建立一種該病快捷的檢測方法，對雞大腸桿菌病的快速診斷、預防、治療和控制等方面都具有積極作用。

[1]栗艷.雞致病性大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].畜禽業(yè)，2013，（10）：12-13.

[2]陶勇.四川雞源致病性大腸桿菌血清型鑒定及質粒DN A分析[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2001.

[3]李宏娟.雞致病性大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測及基因型研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學，2008.

[4]楊苗，程安春，汪銘書，等.基于鴨疫里默氏桿菌16 SrRN A PCR檢測方法的建立和應用[J].四川農(nóng)業(yè)大學學報，2007，3：343-347.

[5]趙紅慶.五種致腹瀉大腸埃希菌的多重PCR檢測研究[D].長春：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院，2007.

[6]師福山，趙德明.禽大腸桿菌的分離與16S rRN A的鑒定[J].中國畜牧獸醫(yī)，2009，2：111-113.

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[8]楊洋.PCR技術檢測測乳品中金黃色葡萄球菌研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學，2005.

[9]趙紅慶.五種致腹瀉大腸埃希菌的多重PCR檢測研究[D].長春：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院，2007.

Establish a Identification Method of 16S rRNA PCR for Avian Pathogenic Escherichia Coli

Xu Rui1,J i Fang2,Li M engl ong1
（1.Departm ent of Ani m al Sci ence of Xi chang Col l ege,Xi changSi Chuan615013; 2.Feed m oni tori ng stati on of agri cul ture and Ani m al H usbandry Bureau of DeChang Country,DeChangSi Chuan 615500）

In order to establ i sh a rapi d i denti fi cati on m ethod of Chi cken Pathogeni c Escheri chi a col i.The testcol l ected heart,l i ver,spl een,ki dney ofdi seases chi cken as di sease m ateri al, then through bacteri ali sol ati on and cul ture,bi ochem i cali denti fi cati on and pathogeni ci ty test. By usi ng com m on pri m ers of E.col i 16S rRN A,3 strai ns of test bacteri a w ere am pl i fi ed by PCR.And the speci fi c am pl i fi cati on products w ere obtai ned from 3 tested strai ns.The am pl i fi cati on products w ere sequenced and com pared w i th BLAST.The resul ts show ed that 3 strai ns of Chi cken Pathogeni c Escheri chi a col i(DZM G,DGCG1,DGCP3)am pl i fi ed 16S rRN A gene sequence and Chi cken Pathogeni c Escheri chi a col igene sequences of 100%anastom osi s.The m ethod to detect the Escheri chi a col i 16s rRN A PCR has good speci fi ci ty and si m pl e characteri sti cs.Betw een 3 strai ns pathogeni c Escheri chi a col i(DZM G,DGCG1,DGCP3)and Chi cken Pathogeni c Escheri chi a col i,thei r hom ol ogy of16S rRN A gene sequences reached 100%.Thi s test w as suggested that the i denti fi cati on m ethod had the characteri sti cs of hi gh speci fi ci ty and si m pl e and rapi d.

Chi cken Pathogeni c Escheri chi a col i;Isol ati on and Cul ture;16S rRN A;PCR i denti ficati on m ethod

S852.61

B

1672-9692(2016)07-0001-05

2016-05-16

徐睿（1980-），女，四川西昌人，講師，碩士，主要從事基礎獸醫(yī)教學及研究工作。

四川省涼山州農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項目（15NYCX0040）；四川省科技廳支撐計劃項目（13ZC1796）。