敬思群，于紅，郭改，涂亦嫻，普燕

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046)

油莎豆（CyperusesculentusL.）為莎草科莎草屬多年生草本植物[1]，油莎豆起源于非洲東北部，有著非常悠久的栽培歷史，在世界各地?zé)釒У綔貛У貐^(qū)均有種植[2]．又稱人參豆、老虎豆、鐵荸薺、地下板栗、地下核桃等，是營養(yǎng)最豐富的堅果之一[3,4]，并有“油料作物之王”[5]之稱．根據(jù)《新華本草綱要》記錄，油莎豆塊莖性辛、甘、溫，疏肝、健胃及健脾，可以治療消化不良等癥狀[6]．油莎豆中含有很多種保健成分和藥效活性成分，具有非常高的營養(yǎng)價值和藥效價值，越來越被研究者們高度重視．

目前，關(guān)于油莎豆的研究主要集中于栽培技術(shù)[7]、油莎豆油提取工藝[8]、油莎豆成分分析[9]及油莎豆飲料的開發(fā)[10]，而對油莎豆基因方面的研究較少，趙永國等人[11]利用SRAP分子標(biāo)記構(gòu)建了14份不同地理來源、表型具有差異的油莎豆品系的分子指紋圖譜并進(jìn)行了遺傳多樣性分析；程超等人[12]通過RACE技術(shù)，從油莎豆葉片中克隆到WRI1編碼基因的cDNA序列及編碼AGPase小亞基編碼基因的cDNA序列，同時構(gòu)建了35S啟動子介導(dǎo)的油莎豆WRl1過表達(dá)載體及APSRNA干擾載體；敬思群等人[13]成功克隆得到PEPCase編碼基因ppc的兩個片段S1和S2，國外研究未見報道．

實(shí)時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法．通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法．實(shí)時熒光定量技術(shù)具有高度的靈敏性、特異性及精確性，廣泛應(yīng)用于生物體基因功能的研究[14]．通過植物基因工程進(jìn)行相關(guān)功能基因調(diào)控，以提高油莎豆油的產(chǎn)量．但是，目前油莎豆缺乏功能基因qRT-PCR分析中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因．本研究以油莎豆地上莖為材料，采用qRT-PCR分析2個常用內(nèi)參基因18S rRNA、GAPDH的表達(dá)穩(wěn)定性，篩選出合適的內(nèi)參基因，從而為利用qRT-PCR探討油莎豆的基因表達(dá)分析奠定理論基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

植物材料：油莎豆，來源于河南．將其處理后播種于逸夫樓前試驗(yàn)地，自然光照下采中間第一至第三片的幼嫩葉片（從里往外數(shù)）．經(jīng)采樣后用錫箔紙包住，置于液氮中備用．

試劑與酶：植物總RNA提取試劑盒（Omega），DNA小提質(zhì)粒試劑盒及凝膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司；M-MLV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor(40U/μL)、pMD18-T Vector、Oligo(dT)18 Primer、dNTP Mixture(各10 mM)、rTaq等購自TaKaRa公司；液氮購買自烏魯木齊西山；熒光定量試劑盒購自Promega公司，基因合成和測序于上海生工．

1.2 油莎豆處理

選取生長40 d的油莎豆幼苗，從早上10:00開始，每2 h（即10:00，12:00，14:00，16:00，18:00，20:00）以及生長天數(shù)為20，30，40，50，55，65，75，85，95，105，115，125，135，145 d的油莎豆地上莖采一次樣（4個重復(fù)），取樣后保存在-80?C冰箱備用．

1.3 引物設(shè)計與RT-PCR擴(kuò)增

依據(jù)實(shí)時熒光定量引物設(shè)計原則[15]，應(yīng)用DNAMAN設(shè)計引物，普通PCR摸索擴(kuò)增條件，檢測引物特異性，引物序列見表1，引物由上海生工合成．

表1 qPCR引物

1.4 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

1.4.1 實(shí)驗(yàn)材料的處理

待油莎豆幼苗生長至有5～6葉子時（出苗后40 d左右），取其中間三片葉子進(jìn)行采樣，分別稱取0.1 g油莎豆葉片，迅速凍于液氮中備用．

1.4.2 地上莖總RNA提取和cDNA的合成

將地上莖在盛有液氮的研缽中快速碾磨成粉末狀，取50～100 mg轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，具體步驟按植物總RNA提取試劑盒（Omega公司）操作手冊進(jìn)行，貨號為R6827-01[16]．

提取完畢后取10μL RNA用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶，用NanoDrop檢測RNA的濃度和質(zhì)量，每份組織三個生物學(xué)重復(fù)．按照1μg總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（20μL體系），以O(shè)ligo(dT)18Primer作為引物，后用M-MLV Reverse Transcriptase合成cDNA．程序如下：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液RNA，H2O，Oligo(dT)1870?C孵育10 min；冰浴2 min，M-MLV Buffer，dNTP，RRI，M-MLV，H2O 混合后42?C孵育1 h，70?C孵育15 min，取出放置在-20?C備用，將該cDNA作為PCR擴(kuò)增的模板．

1.5 內(nèi)參基因的qRT-PCR分析

采用三步法進(jìn)行定量反應(yīng)，參照Promega試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR，使用ABI PRISM 7500實(shí)時定量PCR儀進(jìn)行檢測，SYBR作為染料，4個生物學(xué)重復(fù)，2個技術(shù)重復(fù)，試驗(yàn)同時設(shè)置陰性對照：以RNase-free ddH2O為模板．參照Qing Wang等人的方法經(jīng)過改進(jìn)并按照試劑盒說明進(jìn)行操作[17]，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用相對定量法分析．在每個PCR反應(yīng)結(jié)束后得到熔解曲線，其用來證實(shí)設(shè)計的引物擴(kuò)增和檢測PCR產(chǎn)物的唯一性．qPCR的引物見表1．

先用普通PCR進(jìn)行擴(kuò)增判斷引物的特異性，再進(jìn)行實(shí)時熒光定量，PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳檢測，選取條帶單一，無引物二聚體的退火溫度進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增．用Omega純化回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，用pMD18-T試劑盒連接，操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，鑒定陽性克隆，用Omega質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖刑崛≠|(zhì)粒，測定質(zhì)粒濃度，以質(zhì)粒為模板用Elution Buffer將質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，質(zhì)粒依次稀釋為：1，10?1，10?2，10?3，10?4，10?5，10?6，10?7ng/μL，以此為模板進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，繪制各基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線．

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的提取

選用Omega植物總RNA提取試劑盒，獲得含量較高、純度較好的油莎豆RNA．取0.1 g油莎豆幼苗葉片在液氮中充分研磨，采用試劑盒提取油莎豆地上莖總RNA，接著進(jìn)行定量和電泳檢測．采用Revert Aid First SttrandcDNA Synthesis Kit(大連TaKaRa公司)試劑盒合成cDNA．電泳結(jié)果表明，RNA分子保持完整，見圖1．

圖1 不同采樣時間下油莎豆總RNA電泳圖

2.2 RT-PCR擴(kuò)增

根據(jù)設(shè)計的熒光定量引物18S rRNA，GAPDH可知擴(kuò)增條帶大小大約分別為117bp，143bp．PCR擴(kuò)增進(jìn)行梯度試驗(yàn)，進(jìn)行梯度PCR，PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系為94?C預(yù)變性5 min；94?C變性30 s，中間溫度退火30 s，72?C延伸60 s，35個循環(huán)；72?C延伸10 min，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測．根據(jù)梯度PCR結(jié)果可知，18S rRNA，GAPDH，退火溫度分別為60?C，52?C．結(jié)果如圖2所示．

結(jié)果證明與預(yù)期片段大小一致．?dāng)U大體系進(jìn)行膠回收，擴(kuò)大體系至100μL，按PCR產(chǎn)物純化試劑盒（Omega）說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收．回收的片段與pMD18-T（北京全式金公司）連接，轉(zhuǎn)化至Trans5α中，挑取單克隆，利用菌液PCR進(jìn)行鑒定．挑取陽性克隆，送上海生工測序．

2.3 質(zhì)粒提取

從2對引物擴(kuò)增出的陽性克隆各選擇一個搖菌5 mL，1%接菌，過夜搖菌，提取質(zhì)粒，定量結(jié)果如下：1，2，3，4，6分別為126，138.1，145.4，150.5，140.1 ng/μL．放置在-20?C冰箱中備用．

圖2 目的基因部分序列的PCR擴(kuò)增

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

依據(jù)表1列出的2對引物對各標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒（上述質(zhì)粒）分別進(jìn)行8次10n倍系列稀釋（1，10?1，10?2，10?3，10?4，10?5，10?6，10?7ng/μL），對引物的特異性進(jìn)行檢驗(yàn)，每一個基因得到最佳退火溫度和擴(kuò)增效率的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示．

圖3 18S rRNA，GAPDH熔解曲線

表2 目的基因片段擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)數(shù)據(jù)

對兩個內(nèi)參基因的熔解曲線（圖3）進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熔解曲線均為單峰，反應(yīng)過程中無非特異性擴(kuò)增和引物二聚體，說明引物特異性較好．由表2可知，兩個候選基因片段的相關(guān)系數(shù)R2的大小依次為18S rRNA>GAPDH；擴(kuò)增效率依次為：18S rRNA>GAPDH；熔解溫度依次為18S rRNA

3 結(jié)論與討論

實(shí)時熒光定量PCR廣泛用于各個領(lǐng)域，在基因表達(dá)研究、疾病的快速檢測、定量分析、食品安全檢測、基因分型、以及疫苗效力測定中發(fā)揮重要作用．獲得準(zhǔn)確可靠的實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果，不僅需要正確的試驗(yàn)與引物設(shè)計之外，選擇合適的內(nèi)參基因也至關(guān)重要．合適的內(nèi)參基因應(yīng)該是在任何試驗(yàn)條件下及不同的細(xì)胞或組織中表達(dá)量均恒定，不受任何外因和內(nèi)因的影響．常用的內(nèi)參基因有GAPDH、Actin2、βtublin、18S rRNA等．其中GAPDH是參與糖酵解的一種關(guān)鍵酶；Actin2是編碼肌動蛋白的基因；β-tublin是骨架蛋白；18S rRNA是真核生物體內(nèi)含量最多的核糖體RNA．秦曉藝等人[18]研究了不同貯藏時期杏鮑菇內(nèi)參基因的篩選，結(jié)果表明β-actin的表達(dá)穩(wěn)定性最高，為最佳內(nèi)參基因；張德輝等人[19]進(jìn)行了天藍(lán)苜蓿鋅脅迫下實(shí)時定量PCR內(nèi)參基因的篩選，研究結(jié)果顯示不同的Zn2+濃度所對應(yīng)的最適內(nèi)參基因不同；溫志斌等人[20]研究干旱脅迫下松葉豬毛菜實(shí)時定量PCR內(nèi)參基因的篩選，β-actin為松葉豬毛菜干旱脅迫下基因表達(dá)最合適的內(nèi)參基因．孫美蓮等人[21]研究認(rèn)為比較不同成熟度的葉片和愈傷組織時，GAPDH可以作為校正內(nèi)參基因；蘇曉娟等人[22]研究了毛果楊內(nèi)參基因，結(jié)果表明18S rRNA為不同組織基因表達(dá)的合適內(nèi)參基因，與本研究結(jié)果一致．本文利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，探討了兩個候選基因，結(jié)果表明18S rRNA可以作為qRT-PCR合適的內(nèi)參基因．本研究為開展其功能基因的表達(dá)分析奠定了基礎(chǔ)，同時也可以為其他植物篩選內(nèi)參基因提供參考．