王重，樊哲儒，張躍強，李劍峰，高新，王子霞

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學院核技術(shù)生物技術(shù)研究所，烏魯木齊 830091；2.農(nóng)業(yè)部荒漠綠洲作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室，烏魯木齊 830091)

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春小麥單倍體胚得胚率的影響因素研究

王重1，2，樊哲儒1，2，張躍強1，2，李劍峰1，2，高新1，2，王子霞1

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學院核技術(shù)生物技術(shù)研究所，烏魯木齊 830091；2.農(nóng)業(yè)部荒漠綠洲作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室，烏魯木齊 830091)

【目的】研究玉米花粉對于春小麥單倍體胚的誘導效率及影響因素，獲得穩(wěn)定且高效的單倍體胚誘導方法，并應(yīng)用于春小麥育種實踐?！痉椒ā渴褂萌N不同基因型玉米分別和不同春小麥品種進行遠緣雜交，分別采用兩種授粉方式和兩種激素處理方式獲得單倍體胚?！窘Y(jié)果】三種不同基因型玉米與不同春小麥品種均可以獲得單倍體胚，爆裂玉米得胚率最高(9.59%)，重復(fù)授粉以及重復(fù)噴施激素均能夠有效增加春小麥單倍體胚的得胚率。【結(jié)論】采用爆裂玉米為父本與春小麥進行遠緣雜交，間隔24 h重復(fù)授粉及重復(fù)噴施激素處理，能夠有效提高春小麥單倍體胚的得胚率。

小麥×玉米；單倍體胚；基因型

0 引 言

【研究意義】小麥與玉米遠緣雜交獲得單倍體胚，經(jīng)過組織培養(yǎng)得到單倍體植株，人工加倍后當年便可獲得純合雙單倍體，繁育1年后即可進行品系比較試驗，與常規(guī)雜交育種相比較能夠縮短育種年限3～5年，而且該方法既不會產(chǎn)生白化苗，又避免了基因型的制約[1-3]，是小麥產(chǎn)生單倍體效率最高的途徑之一。具有非常良好的育種應(yīng)用潛力?！厩叭搜芯窟M展】1984年，Zenkteler等[4]報道了小麥與玉米遠緣雜交獲得球型雜種胚的研究結(jié)果，但因未提供細胞學證據(jù)而受到質(zhì)疑Laurie等[5, 6]提供了詳細的細胞學證據(jù)，表明小麥與玉米遠緣雜交后得到的是真正的雜種胚，并通過小穗培養(yǎng)法獲得了單倍體植株。20世紀90年代，孫敬三等[7]、陳新民等[8]開展了此方面的研究，獲得了單倍體植株。國內(nèi)很多學者對小麥與玉米遠緣雜交進行了研究，包括基因型[9-12]、授粉方式[13]、激素處理[7, 13, 14]、小花穗位[15]等?！颈狙芯壳腥朦c】目前研究多以冬小麥為研究對象，針對春小麥的研究尚少見報道。單倍體胚誘導率不穩(wěn)定是制約該方法應(yīng)用于育種的主要問題[16]。以春小麥為母本與玉米進行遠緣雜交，結(jié)合授粉方式和激素處理的比較，研究春小麥與玉米遠緣雜交誘導單倍體胚的影響因素?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以春小麥為母本，利用三種不同基因型的玉米花粉進行遠緣雜交，結(jié)合授粉方式和激素處理比較，研究春小麥與玉米遠緣雜交誘導單倍體胚的影響因素，為春小麥×玉米遠緣雜交方法應(yīng)用于育種實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

春小麥材料XC、126H由新疆農(nóng)業(yè)科學院核技術(shù)生物技術(shù)研究所提供，不同基因型玉米材料由新疆農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所提供，分別為爆裂玉米、甜玉米、糯玉米。

1.2 方 法

1.2.1 去雄授粉

2015年4月上中旬，玉米材料分三期覆膜播種，小麥材料4月下旬分兩期播種。抽穗后選擇即將開花小穗進行整穗、剪穎、去雄、套袋，開花當日收集新鮮玉米花粉使用脫脂棉蘸取進行授粉雜交，授粉采用3種方式：

方式Ⅰ：第一次授粉24 h后，進行第二次玉米花粉授粉，48 h后以小花柱頭噴施方式進行第一次激素處理，72 h進行第二次激素處理。

方式Ⅱ：進行第一次玉米花粉授粉后，24 h后進行激素處理。

方式Ⅲ：玉米花粉授粉后，24 h后以小花柱頭噴施方式進行第一次激素處理，48 h進行第二次激素處理。

1.2.2 剝胚培養(yǎng)

將授粉15 d的小穗剪下取回，將籽粒剝出，使用70%乙醇消毒1 min，無菌水洗滌3次，再使用0.1% HgCl2消毒8 min，無菌水洗滌5次，接種于1/2 MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)7 d，此時胚體積明顯增大，部分胚已萌發(fā)，移至正常光照下培養(yǎng)直至分化成苗。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

計算結(jié)實率、結(jié)實穎果得胚率和得胚率。

結(jié)實率=結(jié)實穎果數(shù)/授粉穎花數(shù)×100%。

結(jié)實穎果得胚率=單倍體胚數(shù)/結(jié)實穎果數(shù)×100%。

得胚率=單倍體胚數(shù)/授粉穎花數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)實率及單倍體胚的獲得頻率

研究表明，分別使用3個不同基因型玉米花粉與小麥材料進行遠緣雜交，共授粉小花2 072朵，經(jīng)過授粉和激素處理，15 d后剪穗剝胚，得到穎果1 812個，結(jié)實率為87.45%，其中得胚65個，得胚率為3.14%。表1

2.2 不同基因型玉米對小麥單倍體胚得胚率的影響

研究表明，就春小麥而言，爆裂玉米、甜玉米、糯玉米與玉米遠緣雜交后均能誘導其產(chǎn)生單倍體胚，得胚率分別為9.59%、4.82%和4.35%，結(jié)實穎果得胚率分別為11.11%、5.76%和4.88%，爆裂玉米均高于其他基因型玉米，與其他玉米種類之間存在差異；而就結(jié)實率而言，糯玉米結(jié)實率最高，但不同基因型玉米之間并無差異。結(jié)實率、得胚率、結(jié)實穎果得胚率三者之間并無相關(guān)性。表1

表1 不同基因型玉米對小麥單倍體胚得胚率
Table 1 Effect of different maize genotypes on frequency of embryo formation

品種Varieties授粉小花數(shù)No．ofspikeletpollinated結(jié)實穎果數(shù)No．ofcaryopsis結(jié)實率(%)Fre．ofcaryopsis單倍體胚數(shù)No．ofhaploidembryos結(jié)實穎果得胚率(%)Fre．ofembryoformationofcaryopsis得胚率(%)Fre．ofembryoformation爆裂玉米Puffedmaize3442978634a331111a959a甜玉米Sweetmaize4984178373a24576b482b糯玉米Glutincusmaize1841648913a8488b435b

注：數(shù)字后的不同字母表示在5%水平上差異顯著。下同

Note：Different letters refer to difference significant at 0.05 level. The same as below

2.3 授粉次數(shù)對小麥單倍體胚得胚率的影響

研究表明，春小麥與玉米遠緣雜交過程中使用單次授粉和重復(fù)授粉兩種操作方法，重復(fù)授粉得胚率與結(jié)實穎果得胚率分別為5.18%和6.08%，均高于單次授粉的3.51%和3.85%，但單次授粉的結(jié)實率高于重復(fù)授粉，兩者之間存在差異，表明在遠緣雜交過程中使用重復(fù)授粉操作能夠有效提高小麥單倍體胚的得胚率。表2

表2 不同授粉次數(shù)下小麥單倍體胚得胚率變化
Table 2 Effect of pollinated times on frequency of embryo formation

方法Method授粉小花數(shù)No．ofspikeletpollinated結(jié)實穎果數(shù)No．ofcaryopsis結(jié)實率(%)Fre．ofcaryopsis單倍體胚數(shù)No．ofhaploidembryos結(jié)實穎果得胚率(%)Fre．ofembryoformationofcaryopsis得胚率(%)Fre．ofembryoformation單次授粉Singlepollination1141049123a4385b351b重復(fù)授粉Repeatedpollination8507248518b44608a518a

2.4 激素噴施次數(shù)對小麥單倍體胚得胚率的影響

研究表明，春小麥與玉米遠緣雜交以后單次噴施和重復(fù)噴施激素，重復(fù)噴施激素得胚率與結(jié)實穎果得胚率分別為5.27%和6.19%，均高于單次噴施激素的2.73%和2.97%，但單次噴施激素的結(jié)實率高于重復(fù)噴施激素，兩者之間存在差異，表明在遠緣雜交后重復(fù)噴施激素能夠有效提高小麥單倍體胚的得胚率。表3

表3 不同激素噴施次數(shù)下小麥單倍體胚得胚率變化
Table 3 Effect of times of spraying hormones on frequency of embryo formation

方法Method授粉小花數(shù)No．ofspikeletpollinated結(jié)實穎果數(shù)No．ofcaryopsis結(jié)實率(%)Fre．ofcaryopsis單倍體胚數(shù)No．ofhaploidembryos結(jié)實穎果得胚率(%)Fre．ofembryoformationofcaryopsis得胚率(%)Fre．ofembryoformation單次噴施Singlespray1101019182a3297b273b重復(fù)噴施Repeatedspray8547278513b45619a527a

3 討 論

研究采用三種不同基因型玉米與不同品種春小麥材料進行遠緣雜交，均能夠獲得單倍體胚，表明春小麥能夠受不同基因型玉米花粉的誘導產(chǎn)生單倍體胚，而且這種誘導并不受玉米基因型的限制，但不同基因型玉米對于小麥單倍體胚的誘導率方面存在差異，得胚率：爆裂玉米>甜玉米>糯玉米，這與王廣金等[9]、蔡華等[10, 11]、趙翠榮等[12]的研究并不完全一致，造成這一結(jié)果的原因可能是由于不同玉米花粉對于春小麥的誘導能力存在一定差異。

遠緣雜交過程中使用玉米花粉對小麥進行重復(fù)授粉操作以及重復(fù)噴施激素均能夠有效的提高小麥單倍體胚的得胚率，這與陳新民等[13]在冬小麥中的研究結(jié)果一致，但是試驗中重復(fù)授粉及重復(fù)噴施激素的結(jié)實率低于單次授粉和單次噴施激素，造成該結(jié)果的原因可能與整穗時間、小穗發(fā)育狀態(tài)、花粉活力以及授粉時間等多種因素有關(guān)，今后還需對于這些影響因素進一步研究。

小麥×玉米遠緣雜交具有縮短育種年限、不產(chǎn)生白化苗、不受基因型制約等優(yōu)點，但是目前產(chǎn)生單倍體胚的效率不穩(wěn)定且太低，制約了該技術(shù)在育種實際中的應(yīng)用。研究中平均得胚率為6.34%，個別處理得胚率不到1%，可見得胚效率可能受到多種因素的制約和影響。蔡華等[17]、來長凱等[18]和陳新民等[19]提出遠緣雜交后的生長條件尤其是積溫等會對得胚率產(chǎn)生明顯的影響，因此若要將小麥×玉米遠緣雜交方法應(yīng)用于育種實踐，還需要對得胚率的影響因素進一步進行研究，以便獲得較為穩(wěn)定和高效的得胚方法。

4 結(jié) 論

以春小麥為母本與玉米進行遠緣雜交，就小麥單倍體胚的得胚率而言，爆裂玉米的誘導率最高，其次是甜玉米，糯玉米誘導率最低。就結(jié)實率而言，糯玉米>爆裂玉米>甜玉米。相對于單次授粉，第一次授粉后間隔24 h重復(fù)授粉能夠有效提高小麥單倍體胚的得胚率，同時，授粉后間隔24和48 h重復(fù)噴施激素處理，也能夠有效的提高春小麥單倍體胚的獲得效率。

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Fund project:Supported by Youth Science Fund Projects of Xinjiang Uygur Autonomous Region (2013211B23)

Analysis of Influencing Factors on Embryo Rate of Haploid Embryos in Spring Wheat

WANG Zhong1，2, FAN Zhe-ru1，2, ZHANG Yue-qiang1，2,LI Jian-feng1，2, GAO Xin1，2, WANG Zi-xia1

(1.ResearchInstituteofNuclearandBiologicalTechnologies,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China; 2.KeyLaboratoryofCropEcophysiologyandFarmingSysteminDesertOasisRegion,MinistryofAgriculture,Urumqi, 830091,China)

【Objective】 In order to explore the induction efficiency and influencing factors of spring wheat haploid embryo induced by maize pollen, obtain s
Table and efficient method for inducing haploid embryos applied to spring wheat breeding. 【Method】 Distant hybridization was performed using three different maize genotypes and different spring wheat varieties and two kinds of pollination methods and two kinds of hormone treatments were used to induce haploid embryos. 【Result】 Spring wheat haploid embryos could be induced by three genotypes of maize and different varieties of spring wheat, the highest rate (9.59 %) was puffed maize, and repeated pollination and repeated spraying hormones could effectively increase the yield of haploid embryos of spring wheat. 【Conclusion】 The rate of spring wheat haploid embryo could be effectively increased by puffed maize as pollen supplier, repeated pollination and repeated spraying hormones at 24 h interval.

wheat × maize cross; haploid embryo; genotype; influence

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.08.005

2016-03-08

新疆維吾爾自治區(qū)青年科學基金項目(2013211B23)

王重(1982-)，男，陜西長安人，助理研究員，研究方向為小麥遺傳育種，(E-mail)wangzhongac@126.com

樊哲儒(1964-)，男，甘肅民勤人，研究員，研究方向為小麥遺傳育種，(E-mail)fzr518@163.com

S513

A

1001-4330(2016)08-1404-05