周雅君，時 菁，田 耕，周漢新，高國全

(1.中山大學中山醫(yī)學院，廣東 廣州 510000；2. 深圳市第二人民醫(yī)院中心實驗室，廣東 深圳 518000)

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甲基蓮心堿體外抑制人肝癌細胞增殖和侵襲的作用機制研究

周雅君1,2，時 菁2，田 耕2，周漢新2，高國全1

(1.中山大學中山醫(yī)學院，廣東 廣州 510000；2. 深圳市第二人民醫(yī)院中心實驗室，廣東 深圳 518000)

目的 探討甲基蓮心堿(neferine，Nef)對人肝癌HepG2和Bel-7402細胞侵襲的影響和作用機制。方法 人肝癌HepG2和Bel-7402細胞體外培養(yǎng)，經不同濃度的甲基蓮心堿處理后，CCK-8法檢測細胞的增殖，Transwell細胞體外侵襲實驗觀察Nef對細胞侵襲能力的影響；免疫印跡檢測Rho相關蛋白的表達。結果 CCK-8結果顯示，與對照組比較，甲基蓮心堿干預組抑制人肝癌HepG2和Bel-7402細胞增殖，并呈劑量-效應關系(P<0.05)；Transwell細胞體外侵襲實驗顯示，3 μmol·L-1甲基蓮心堿明顯抑制HepG2和Bel-7402細胞的侵襲；免疫印跡結果顯示，3 μmol·L-1甲基蓮心堿作用HepG2和Bel-7402細胞12 h后，RhoA、RhoC和ROCK表達明顯降低。結論 甲基蓮心堿可體外抑制HepG2和Bel-7402細胞的增殖和侵襲，其抑制肝癌細胞的侵襲可能與抑制RhoA、RhoC和ROCK蛋白的表達有關。

甲基蓮心堿；人肝癌細胞HepG2；人肝癌細胞Bel-7402；增殖；侵襲； RhoA；RhoC；ROCK

甲基蓮心堿(neferine，Nef)是從睡蓮科植物蓮成熟種子的綠色胚芽中提取出的一種雙芐基異喹啉類生物堿。近年來研究表明，甲基蓮心堿具有明顯的抗肝纖維化作用，亦對耐藥肝癌具化療增敏作用[1-3]，但甲基蓮心堿抗肝癌作用及其機制尚未明確。Rho(rashomologue)是近年來發(fā)現的一種小分子G蛋白，RhoA、RhoC為Rho蛋白的亞家族成員，而Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiled coil forming protein kinase, ROCK)為RhoA下游蛋白[4]。研究發(fā)現，Rho信號通路與肝纖維化的形成、肝癌的侵襲和轉移密切相關[5-6]。本文以人肝癌細胞株HepG2和Bel-7402為研究對象，通過觀察甲基蓮心堿對HepG2和Bel-7402細胞增殖、侵襲的影響以及Rho相關蛋白的表達，探討甲基蓮心堿對人肝癌細胞的作用及機制，為甲基蓮心堿的臨床應用奠定實驗基礎。

1 材料與儀器

1.1 細胞株 人肝癌細胞HepG2和Bel-7402均購自中科院上海細胞庫。

1.2 藥物與試劑 甲基蓮心堿(批號：052M4732V)購自美國Sigma公司，1 mol·L-1HCl溶解，制成1 mmol·L-1的甲基蓮心堿溶液，4℃避光保存，用時稀釋成不同濃度的工作液。高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；CCK-8試劑盒購自聯(lián)科生物技術有限公司；兔抗人RhoA、RhoC和ROCK單克隆抗體購自武漢三鷹技術有限公司；ECL化學發(fā)光顯色試劑盒購自美國Thermo公司。

1.3 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo)；低溫高速離心機(美國Eppendorf)；酶標儀(美國ThermoFisher Scientific)；光學顯微鏡(日本Olympus)；倒置相差顯微鏡(德國Leica)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞HepG2和Bel-7402，在37℃、5% CO2飽和濕度條件下，10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，觀察細胞生長情況，每2 d傳代1次，取對數生長期的細胞用于實驗。

2.2 CCK-8檢測細胞增殖 取對數生長期的人肝癌細胞HepG2和Bel-7402，胰酶消化后制成細胞懸液，調整細胞密度至4×107·L-1，細胞懸液移至96孔板，每孔100 μL，預培養(yǎng)12 h待細胞貼壁。培養(yǎng)板加入10 μL不同濃度的甲基蓮心堿，設5個濃度梯度，分別為0、0.75、1.5、3、6 μmol·L-1，處理0、12、24 h，每孔加入10 μL CCK-8反應液，孵育1 h，酶標儀測定各組在450 nm處吸光度值(OD 450)。取最佳用藥時間和用藥濃度繼續(xù)如下實驗。

Tab 1 Effect of neferine on proliferation of HepG2 and Bel-7402 ±s，n=4)

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

2.3 Transwell細胞體外侵襲實驗 冰上將融化后的BD Matrigel用冰的高糖DMEM稀釋4倍，混勻，往預冷的Transwell板上室加稀釋后的Matrigel，每孔50 μL，均勻鋪平，并置于細胞培養(yǎng)箱中孵育3～4 h。消化已用無血清高糖DMEM饑餓的HepG2和Bel-7402細胞，細胞計數，調整細胞濃度為4×108·L-1，離心，棄上清液后，分別用100 μL 0.1% BSA培養(yǎng)液配制的甲基蓮心堿重懸細胞，加入Matrigel已成膠的Transwell上室中，下室加入600 μL 10%胎牛血清培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中孵育。24 h后取出Transwell板，移去培養(yǎng)液，PBS清洗Transwell小室，4%多聚甲醛固定，無水甲醛透化，0.1%結晶紫染色，棉簽輕輕擦拭沒有侵襲的細胞及基質膠，干燥后，倒置顯微鏡下隨機視野觀察并拍照。

2.4 蛋白免疫印跡法檢測Rho相關蛋白的表達 將對數生長期的細胞，每孔106個接種于6孔板，最佳濃度的甲基蓮心堿處理12 h后，收集細胞，裂解液裂解細胞，4℃、10 000 r·min-1離心10 min，獲得蛋白樣品。BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白變性后，30～50 ng蛋白樣品上樣，十二烷基硫酸鈉凝膠電泳2 h，濕法轉膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗(1 ∶500)4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗 (1 ∶5 000 HRP標記的羊抗兔IgG)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL曝光液發(fā)光，凝膠成像儀掃描拍照。

3 結果

3.1 甲基蓮心堿對HepG2和Bel-7402細胞增殖的影響 采用不同濃度甲基蓮心堿分別于12 h和24 h干預HepG2和Bel-7402細胞增殖，CCK-8實驗結果分析發(fā)現，甲基蓮心堿干預HepG2細胞12 h時，甲基蓮心堿濃度≥ 3 μmol·L-1明顯抑制細胞的增殖；作用24 h時，其濃度≥0.75 μmol·L-1明顯抑制細胞的增殖(Fig 1A、Tab 1)。甲基蓮心堿干預Bel-7402細胞12 h時，其濃度≥1.5 μmol·L-1明顯抑制細胞的增殖；作用24 h時，其濃度≥0.75 μmol·L-1明顯抑制細胞的增殖(Fig 1B、Tab 1)。采用甲基蓮心堿最低有效濃度和最短作用時間，當甲基蓮心堿3 μmol·L-1、作用12 h時，與對照組相比，差異具有顯著性(P<0.01)，后續(xù)實驗均采用12 h為干預時間，3 μmol·L-1為干預濃度。

Fig 1 Effect of neferine on proliferation

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

3.2 甲基蓮心堿對HepG2和Bel-7402細胞侵襲能力的影響 Transwell侵襲實驗顯示，甲基蓮心堿干預HepG2和Bel-7402細胞后，細胞侵襲能力明顯減弱，甲基蓮心堿3 μmol·L-1時明顯抑制HepG2和Bel-7402細胞的侵襲(Fig 2)。

Fig 2 Analysis of invasion ability of HepG2 and Bel-7402 cells after neferine treatment

3.3 甲基蓮心堿對RhoA、RhoC和ROCK蛋白表達的影響 3 μmol·L-1甲基蓮心堿作用HepG2和Bel-7402細胞12 h后，蛋白印跡結果表明，3 μmol·L-1甲基蓮心堿即能明顯抑制HepG2和Bel-7402細胞RhoA、RhoC和ROCK蛋白的表達水平(Fig 3)。

Fig 3 Protein expression of RhoA, RhoC and ROCK after treatment HepG2 and Bel-7402 cells with neferine

4 討論

肝細胞癌是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，是全世界癌癥死亡的第三大原因，對經濟發(fā)展及相關人群的生活質量造成了極大的負面影響[7]。肝癌極高的轉移復發(fā)率是提高患者生存率的主要障礙，腫瘤的局部浸潤和遠處轉移是肝癌病人死亡的主要原因[8]。因此，尋找能抑制腫瘤侵襲和轉移的藥物具有重要的臨床意義。

以往研究表明，甲基蓮心堿具有擴血管、降壓、抗心律失常、抗血小板聚集、抗血栓形成、抗氧化、抗有機磷農藥中毒、抗瘢痕形成、抑制肝纖維化的形成以及化療、增敏等藥理作用，近年來，甲基蓮心堿對腫瘤的抑制作用引起研究學者的關注[9]。本研究利用CCK-8法檢測細胞活性實驗發(fā)現甲基蓮心堿明顯抑制人肝癌細胞HepG2和Bel-7402的增殖，且呈濃度依耐性。Transwell細胞體外侵襲實驗利用Matrigel包被的小室來模擬人體內基質環(huán)境，研究腫瘤細胞的侵襲能力[10]，本實驗結果顯示，3 μmol·L-1甲基蓮心堿明顯抑制HepG2和Bel-7402細胞的侵襲。

Rho通路中的細胞黏附相關蛋白、細胞定位相關蛋白與腫瘤侵襲密不可分[11]。RhoA作為調節(jié)肌動蛋白骨架的關鍵分子，通過引發(fā)下游信號ROCK的激活，調節(jié)肌動蛋白和肌球蛋白收縮、影響肝星狀細胞遷移、基質代謝及細胞因子的調節(jié)，從而參與肝纖維化和肝癌的形成，促腫瘤侵襲與轉移。RhoC不參與腫瘤的形成，但可通過調節(jié)細胞肌動蛋白骨架、誘導肌動蛋白、整合素及相關蛋白聚集等途徑，調控腫瘤細胞的侵襲和轉移。RhoA和 RhoC還可通過 ROCK信號轉導通路促進腫瘤血管生成，同時協(xié)助腫瘤細胞穿越脈管內皮向遠處轉移[11]。本研究結果表明，3 μmol·L-1甲基蓮心堿明顯抑制HepG2和Bel-7402細胞RhoA、RhoC和ROCK蛋白的表達。本實驗結果提示，甲基蓮心堿抑制肝癌細胞侵襲的作用可能是通過抑制肝癌細胞Rho/ROCK信號通路而實現。甲基蓮心堿通過抑制肝星狀細胞的增殖活化，抑制肝纖維化[1]，而肝纖維化可發(fā)展成肝硬化乃至肝癌[12]。結合甲基蓮心堿抑制人肝癌HepG2和Bel-7402細胞增殖和侵襲的研究結果，說明甲基蓮心堿具抗肝癌的作用。在今后的研究中，我們將進一步選用不同惡性程度的多種肝癌細胞株，比較并研究甲基蓮心堿對其他肝癌細胞侵襲、轉移及黏附能力的影響及作用機制，并通過體內動物實驗來進一步探究其作用機制，為肝癌的治療提供新的思路。

(致謝：本文全部實驗均在深圳市第二人民醫(yī)院中心實驗室完成，特此致謝！)

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Effect of neferine on proliferation and invasion of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 and Bel-7402

ZHOU Ya-jun1,2，SHI Jing2，TIAN Geng2，ZHOU Han-xin2，GAO Guo-quan1

(1.ZhongShanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510000，China；2.theSecondPeople’sHospitalofShenzhen,ShenzhenGuangdong518000，China)

Aim To investigate the effect of neferine on proliferation and invasion of human hepatocellular carcinoma.Methods HepG2 and Bel-7402 cells were culturedinvitrowith different concentrations of neferine, then cell proliferation was observed by CCK-8 assay; cell invasion was observed by transwell invasion assay; the protein expression of RhoA, RhoC and ROCK was detected by Western blot.Results CCK-8 results showed that neferine could significantly inhibit cell proliferation in a dose-dependent manner compared with the control group. Transwell invasion assay showed that cell invasion was significantly decreased with neferine 3 μmol·L-1．Western blot results showed that RhoA, RhoC and ROCK protein expression was decreased when neferine was co-incubated with hepatocellular carcinoma cells.Conclusion Neferine can inhibit proliferation and invasion of HepG2 and Bel-7402 cells，which is mediated mainly by the inhibition of RhoA, RhoC and ROCK protein expression.

neferine; human hepatocellular carcinoma cell HepG2; human hepatocellular carcinoma cell Bel-7402; proliferation; invasion; RhoA; RhoC; ROCK

2016-07-12,

2016-08-13

深圳市科技計劃項目(No JCYJ20140414170821259)；深圳細胞生物技術轉化醫(yī)學重點實驗室項目(No ZDSY20130531165409949)

周雅君(1984-)，女，博士，研究方向：生化藥理學，E-mail:aquazhou@foxmail.com

高國全(1965-)，男，博士，教授，研究方向：腫瘤等病理性血管新生的發(fā)生機制和生物治療，通訊作者，Tel：020-87330634，E-mail: gaogq1@foxmail.com

時間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.024.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.012

A

1001-1978(2016)11-1539-04

R284.1；R329.24；R735.702.2；R977.6