季瑋 李長棟 荔志云 孫建軍 付亞杰(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院神經(jīng)外科，甘肅 蘭州 730050)

異甘草素對PC12細胞缺氧前后LDH和SOD活性的影響

季瑋 李長棟 荔志云*孫建軍 付亞杰
(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院神經(jīng)外科，甘肅 蘭州 730050)

目的觀察異甘草素對缺氧誘導神經(jīng)細胞損傷過程中乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)的影響。方法采用體外培養(yǎng)PC12細胞；建立細胞缺氧損傷模型。將細胞分為C(對照組)、H(模型組，即單純?nèi)毖踅M)、H1 (異甘草素低劑量組)、H2(異甘草素中劑量組)、H3(異甘草素高劑量組)。即H1、H2、H3加入對應濃度的異甘草素后與H一同放入缺氧環(huán)境中，培養(yǎng)時間結束后，再進行統(tǒng)一處理。光學顯微鏡觀察PC12細胞形態(tài)；測定上清液中LDH、SOD的含量。結果PC12細胞在缺氧后乳酸脫氫酶(LDH)顯著升高，超氧化物歧化酶(SOD)明顯減低，而經(jīng)異甘草素(ISL)干預后，細胞上清液中LDH水平明顯下降，SOD含量有所提高。結論缺氧對PC12細胞的增殖具有一定的抑制作用，使超氧化物歧化酶(SOD)活性降低，乳酸脫氫酶(LDH)漏出增加。異甘草素(ISL)能夠逆轉(zhuǎn)缺氧對PC12細胞的抑制作用，可能通過提高培養(yǎng)液中SOD活性，防止脂質(zhì)過氧化，穩(wěn)定細胞膜，降低LDH的釋放，而起到細胞保護作用。

缺氧; PC12細胞; 異甘草素

缺氧(hypoxia)是指因組織的氧氣供應不足或用氧障礙，而導致組織的代謝、功能和形態(tài)結構發(fā)生異常變化的病理過程。缺氧是臨床各種疾病中極常見的一類病理過程，腦的缺氧也是導致機體死亡的重要原因之一。腦缺氧的原因可能與氧自由基的產(chǎn)生、細胞內(nèi)Ca2+超載、神經(jīng)遞質(zhì)的毒性作用、相關酶類的變化、炎癥反應、線粒體功能的異常、細胞凋亡等因素相關[1]。異甘草素(ioshquiritigenin, ISL)為甘草中有效成分之一。大量文獻報道，異甘草素具抗脂質(zhì)過氧化[2]、有松弛血管[3]、抑制血小板聚集、抗病毒、抗腫瘤[4]及雌激素樣活性[5]、抗細胞凋亡[6]等多種藥理作用。本研究采用體外培養(yǎng)PC12細胞；建立細胞缺氧損傷模型。測定上清液中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的含量。探討其對缺氧神經(jīng)細胞保護作用機制。

材料與方法

一、實驗細胞

PC12細胞為蘭州大學基礎醫(yī)學院惠贈，本實驗室傳代培養(yǎng)。

二、主要儀器和試劑

二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Revco, USA)；超凈工作臺(美國Sigma公司)；低溫高速臺式離心機(UNIVERSAL116型, 德國Hetaeus公司)：倒置相差顯微鏡(CKX41-A32PH型, 日本Olympus公司)；紫外分光光度(Heraeus,German)；酶標儀(Bio-Tek公司)；異甘草素(天津馬克生物技術有限公司產(chǎn)品, 批號：GC-20120203)；雙染細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit, 南京凱基)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)檢測試劑盒(南京凱基)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)檢測試劑盒(南京凱基)。

三、分組與缺氧模型建立

細胞處理后分為C(對照組)、H(模型組，即單純?nèi)毖踅M)、H1 (異甘草素低劑量組2 μg/ml)、H2(異甘草素中劑量組4 μg/ml)、H3(異甘草素高劑量組8 μg/ml)，每組 5個復孔，待細胞貼壁后，按下表加入對應濃度的異甘草素，加藥完成后放入缺氧環(huán)境中培養(yǎng)，開始計時，按缺氧后6 h、12 h、24 h收取細胞，同時實驗。缺氧裝置為自制三氣通氣箱，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)中，其內(nèi)充以95%N2+5%CO2混合氣體，外接傳感器來來控制氧含量，進氣口裝有過濾膜，以此裝置制備PC12細胞缺氧模型。

四、異甘草素對正常PC12細胞形態(tài)及活力的影響

取對數(shù)生長期、突起較多的細胞，胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用含10%血清的改良的Eagle培養(yǎng)基( Dulbecco's modified Eagle medium, DMEM)重懸細胞，細胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整密度為l×l05個/ml，隨機接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl，四周邊孔加200 μl PBS填充，過夜，待細胞貼壁。將實驗組分為對比組，模型組， ISL 4 μg/ml，ISL 8 μg/ml，每組5個復孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學改變，甲基噻唑藍(methyl thiagolyl tetragolium, MTT)法測不同濃度ISL對PC 12細胞的影響。

五、指標檢測

1.MTT法檢測異甘草素對缺氧PC12細胞活力的影響：各時間點培養(yǎng)結束后，取出前述處理的96孔板，吸去培養(yǎng)液，換新鮮培養(yǎng)液后每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，小心吸棄溶液(注意勿將結晶吸除)，加二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO) 150 μl/孔，震蕩溶解，酶標儀490 nm處測定各孔吸光值，存活率=(各孔吸光度值/對照組吸光度值)×100。細胞活性用存活率或光密度(optical density, OD)值表示。

2.LDH活性測定：各時間點培養(yǎng)結束后，吸取培養(yǎng)液上清；按照SOD試劑盒進行加樣；混勻，室溫放置3 min，440 nm，測各管吸光度。

3.SOD活性測定：各時間點培養(yǎng)結束后，吸取培養(yǎng)液上清；按照SOD試劑盒進行加樣；混勻，室溫放置10 min，于波長550 nm處比色。

六、統(tǒng)計學處理

結 果

一、PC12細胞的形態(tài)學觀察

正常狀態(tài)下分化的PC12表現(xiàn)出神經(jīng)元的特性，細胞形態(tài)為梭形、多角形，細胞突起長，細胞胞膜光滑，細胞間建立突觸連接交聯(lián)成網(wǎng)狀(圖1)，傳代4 h后細胞貼壁生長，細胞分裂迅速，每2～3 d即可傳代，生命力旺盛，適于實驗。

二、異甘草素對正常PC12細胞形態(tài)及活力旳影響

實驗表明，異甘草素濃度在10 μg/ml以下的實驗組細胞存活率與正常組之間沒有統(tǒng)計學差異，而20 μg/ml、40 μg/ml及80 μg/ml劑量組對PC12細胞有一定的毒性作用(圖2)。因此我們選擇10 μg/ml以下的三個劑量，即2 μg/ml、4 μg/ml、8 μg/ml劑量作為給藥濃度并進行后續(xù)研究。

三、缺氧對PC12細胞活力的影響及ISL的作用

加入MTT培養(yǎng)4 h后細胞內(nèi)生成藍紫色結晶甲臜(圖3)。左為模型組缺氧24 h后，出現(xiàn)多量的圓形“空泡”(如箭頭所示)，此為死亡的細胞，而在右圖，異甘草素8 μg/ml組缺氧24 h后，幾乎未見空泡形成，而且多數(shù)細胞仍保持正常形態(tài)，有突起，未聚集成團。

MTT結果顯示，對照組細胞開始計時后即進入對數(shù)期生長，細胞隨時間不斷分裂增殖，活力隨時間增強；而模型組細胞活力明顯減弱；異甘草素組缺氧后細胞活力較模型組增強，細胞存活率增高，兩者之間有顯著性差異(圖4)。異甘草素8 μg/ml組缺氧24 h效果最為顯著。

四、異甘草素對PC12細胞缺氧前后LDH活性的影響

細胞受損時，LDH可由破壞的細胞膜釋放入上清，故上清中的LDH含量可以反應細胞膜受損程度。PC12細胞在缺氧后LDH漏出量明顯升高，異甘草素組與模型組比較LDH明顯降低(圖5)。

五、異甘草素對PC12細胞缺氧前后SOD活性的影響

缺氧處理后12 h，異甘草素8 μg/ml組SOD活性顯著高于模型組，缺氧24 h，異甘草素4 μg/ml組和8 μg/ml組SOD活性高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義。所有時間點異甘草素8 μg/ml組SOD活性與對照組比較無差異。自由基堆積可使脂質(zhì)過氧化，對細胞造成氧化損傷，ISL可提高SOD活性，減弱因SOD活性下降引起的細胞清除氧自由基能力的降低，以此保護神經(jīng)細胞。(見表1)

圖1 分化型PC12細胞的病理學特征(×400)

Fig 1 Pathological characteristics of differentiated PC12 cells (× 400)

圖2 MTT法測定ISL對正常PC12細胞活力的影響

Fig 2 Effect of ISL on normal PC12 cell activity was measured in MTT

bP<0.01,vsmodel group (the concentration of ISL in 10 g/ml) in the experimental group cells

圖3 加入MTT培養(yǎng)4 h后生成藍紫色結晶甲臜的情況(×400)

Fig 3 The blue violet crystal armour's accession to the MTT after 4 h culture (×400)

A: In ISL 8 μg/ml group, no void formation and most of the cells still maintained the normal morphology without projections or gathering into a mass at 24 h after hypoxia; B: In model group 24 h after hypoxia, a large number of circular “bubble” was observed.

圖4 缺氧對PC12細胞活力的影響及ISL的作用

Fig 4 Effect of hypoxia on PC12 cell activity and the role of ISL

aP<0.05,vscontrol;aP<0.05,vsmodel group;bP<0.05,vscontrol;bP<0.05,vsmodel group.

圖5 異甘草素對PC12細胞缺氧前后LDH活性的影響

Fig 5 Effect of isoliquiritigenin on activity of LDH in PC12 cells before and after hypoxia

aP<0.05,vscontrol;aP<0.05,vsmodel group.

Group0h6h12h24h Control8．41±0．229．26±0．6510．75±0．7211．91±0．88 Model8．56±0．468．47±0．358．08±0．497．76±0．57 ISL4μg/ml8．34±0．528．72±0．489．67±0．64a11．16±0．71a ISL8μg/ml8．47±0．589．09±0．5410．46±0．36b11．85±0．67b

aP<0.05,vscontrol;bP<0.05,vsmodel group.

討 論

甘草是一味應用廣泛的傳統(tǒng)中藥，也是我省四大名貴中草藥之一?，F(xiàn)代藥理表明，甘草除具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、抗炎、抗?jié)儭⒖棺儜B(tài)反應等[7]作用外還具有明顯的神經(jīng)保護作用[8]。在神經(jīng)保護方面主要有抗缺血再灌注損傷[2]，抗缺氧及改善學習[3]、記憶能力的作用[9]。異甘草素為甘草中有效成分之一。異甘草素通過改善腦的能量代謝，抗氧化的作用保護缺血再灌注損傷后的腦組織[10]。

腦缺血是由于血管狹窄，血栓形成等多種原因?qū)е戮植磕X組織血流下降。此時，氧自由基增多，線粒體功能障礙，神經(jīng)元凋亡，Ca2+超載等機制相互作用，相互影響，造成腦細胞功能障礙及形態(tài)學破壞。如上所述，甘草的多種活性成分能夠針對這些機制，對抗腦缺血再灌注損傷。腦血管疾病在我國的發(fā)病率高，是致死、致殘的重要原因之一。給家庭和社會造成了極大的負擔。預防腦血管疾病的發(fā)生，提高老年人生活質(zhì)量已經(jīng)成為當社會最為關注的熱點之一，對甘草及其活性成分的進一步研究，必將發(fā)現(xiàn)甘草中更多的活性物質(zhì)對防治腦血管疾病具有重要意義，有望將其開發(fā)成新型藥物應用于臨床。

本研究顯示, 異甘草素能夠顯著降低缺氧PC12細胞培養(yǎng)液上清中的LDH的含量，由此可以推測，異甘草素具有保護缺氧神經(jīng)細胞膜穩(wěn)定性，改善細胞膜的通透性，降低LDH的漏出量，從而穩(wěn)定細胞內(nèi)環(huán)境，提高神經(jīng)細胞的抗缺氧能力；異甘草素還能夠提高缺氧PC12細胞培養(yǎng)液中SOD的含量，減輕缺氧細胞的損傷程度，降低脂質(zhì)過氧化引起的細胞膜損傷，保護膜的穩(wěn)定性。

1Cabrerizo S, De La Cruz JP, Lopez-Villodres JA, et al. Role of the inhibition of oxidative stress and inflammatory mediators in the neuroprotective effects of hydroxytyrosol in rat brain slices subjected to hypoxia reoxygenation [J]. J Nutr Biochem, 2013, 24(12): 2152-2157.

2Zhan C, Yang J. Protective effects of isoliquiritigenin in transient middle cerebral artery occlusion-induced focal cerebral ischemia in rats [J]. Pharmacol Res, 2006, 53(3): 303-309.

3詹春, 楊靜, 詹莉, 等. 異甘草素對腦缺血再灌注小鼠認知功能障礙及能量代謝的影響 [J]. 中國藥理學通報, 2005, 21(2): 213-216.

4張明發(fā), 沈雅琴. 甘草粗提物及其黃酮類成分的抗腫瘤作用 [J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2010, 25(2): 124-129.

5Hajirahimkhan A, Simmler C, Yuan Y, et al. Evaluation of estrogenic activity of licorice species in comparison with Hops used in botanicals for menopausal symptoms [J]. PLoS One, 2013, 8(7): 1-11.

6Hwang CK, Chun HS. Isoliquiritigenin isolated from licorice Glycyrrhiza uralensis prevents 6-hydroxydopamine-induced apoptosis in dopaminergic neurons [J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2012, 76(3): 536-543.

7Zhao X, Mei W, Gong M, et al. Antibacterial activity of the flavonoids from Dalbergia odorifera on Ralstonia solanacearum [J]. Molecules, 2011, 16(12): 9775-9782.

8Yang EJ, Min JS, Ku HY, et al. Isoliquiritigenin isolated from Glycyrrhiza uralensis protects neuronal cells against glutamate-induced mitochondrial dysfunction [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 421(4): 658-664.

9朱敏娟, 楊靜. 異甘草素對丙泊酚致小鼠學習記憶障礙的影響 [J]. 數(shù)理醫(yī)藥學雜志, 2011, 24(2): 170-172.

10付艷玲, 薛壽儒. 氧化應激與阿爾茲海默病以及抗氧化治療研究進展 [J]. 國際神經(jīng)病學神經(jīng)外科學雜志, 2010, 37(4): 336-340.

EffectofisoliquiritigeninonLDHandSODactivityinPC12cellsbeforeandafterhypoxia

JIWei,LIChangdong,LIZhiyun,SUNJianjun,FUYajie

DepartmentofNeurosurgery,GeneralHospitalofLanzhouMilitaryCommand,Lanzhou730050, China

ObjectiveEffect of isoliquiritigenin (ISL) on lactate dehydrogenase (LDH) and superoxide dismutase (SOD) in hypoxia-induced nerve cell damage was discussed.MethodsPC12 cells were cultured in vitro to establish hypoxic injury model. The cells were divided into C (control group), H (model group, namely the hypoxia group), H1 (isoliquiritigenin low dose group), H2 (isoliquiritigenin middle dose group), H3 (isoliquiritigenin high dose group). H1, H2, H3 with corresponding concentration of hormone and H were put in hypoxic environment for culture. Morphology of PC12 were observed under microscope. Lactate dehydrogenase and SOD in the supernatant lactate were determined.ResultsLDH in PC12 cells after hypoxia treatment was increased significantly, while SOD was significantly decreased. After adding isoliquiritigenin (ISL), LDH in the cell supernatant lactate was significantly decreased, but SOD was increased.ConclusionHypoxia inhibits the proliferation of PC12 cells to some extent, by reducing SOD activity and increasing lactate LDH leakage. ISL can reverse the inhibition of hypoxia on PC12 cells. It may protect the cells by improving the SOD activity in culture medium, preventing lipid peroxidation, maintaining membrane stability, and reducing LDH release.

Hypoxia; PC12 cells; ISL

1671-2897(2016)15-132-04

·論著·

R 651

A

季瑋，主治醫(yī)師，E-mail: 13919932236@163.com

*通訊作者： 荔志云，教授，碩士生導師，E-mail: lizhiyun456@l63.com

2014-03-21；

2014-10-28)