彭程 張磊 饒維 費(fèi)舟 (第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

·腦血管疾病研究·

線粒體分裂抑制劑通過抑制自噬加重OGD/R損傷

彭程 張磊 饒維 費(fèi)舟*
(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

目的探討線粒體分裂抑制劑(Mdivi-1)處理對原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元缺血再灌注損傷的作用及其機(jī)制研究。方法在原代培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元上建立氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖(OGD/R)模型模擬體內(nèi)缺血再灌注損傷，根據(jù)再灌注時間長短檢測自噬的發(fā)生情況，并進(jìn)一步選取自噬發(fā)生最明顯的時間點。然后分別采用自噬抑制劑-3-MA、自噬激動劑-雷帕霉素(rapamycin)、Mdivi-1以及聯(lián)合rapamycin和Mdivi-1進(jìn)行干預(yù)，分別從mRNA以及蛋白水平檢測自噬相關(guān)分子的改變，并同時檢測神經(jīng)元損傷情況。結(jié)果OGD/R處理后，神經(jīng)元自噬隨再灌注時間增長而上調(diào)，在OGD 2 h/R 24 h時，Beclin 1以及微管相關(guān)輕鏈蛋白3 II/I(LC3 II/I)比值均達(dá)峰值(P<0.001，P<0.01)。細(xì)胞活力結(jié)果顯示，rapamycin可減輕OGD/R損傷(P<0.01)，Mdivi-1則會加重OGD/R損傷(P<0.05)，但rapamycin可通過增加自噬來減輕Mdivi-1造成的損傷(P<0.05)。蛋白檢測結(jié)果顯示，OGD/R處理后，Mdivi-1可明顯降低神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Beclin 1和LC3 II的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論Mdivi-1可能通過抑制自噬的發(fā)生，從而加重神經(jīng)元OGD/R損傷。

腦缺血再灌注損傷; 線粒體分裂; 自噬

線粒體作為細(xì)胞的能量工廠，在機(jī)體生理以及病理條件下都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。其一直處于不斷分裂以及融合的動態(tài)平衡之中，而這種平衡一旦失調(diào)就會引起線粒體形態(tài)以及功能的損傷，從而導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生各種病理性改變[1]。目前已有文獻(xiàn)研究表明，線粒體的動態(tài)平衡失調(diào)在腦缺血再灌注I/R損傷中發(fā)揮重要作用，但其具體的調(diào)控機(jī)制仍不明確。近來，自噬作為神經(jīng)退行性疾病中的研究熱點，不但被證實在腦I/R損傷中具有一定的保護(hù)性作用，而且大量研究發(fā)現(xiàn)其與線粒體分裂過程密切相關(guān)[2]。自噬是通過自噬小體-自噬溶酶體系統(tǒng)對自身細(xì)胞內(nèi)異常的細(xì)胞器和代謝產(chǎn)物進(jìn)行吞噬降解的生理過程，對維持細(xì)胞生長以及機(jī)體發(fā)育具有重要作用，并被認(rèn)為是細(xì)胞進(jìn)行自我保護(hù)的一種重要機(jī)制[3]。為進(jìn)一步研究線粒體動態(tài)平衡在腦I/R損傷中的具體作用機(jī)制，本次研究利用小鼠的原代神經(jīng)元細(xì)胞建立氧糖剝奪后再復(fù)氧模型(oxygen-glucose deprivation/reperfusion, OGD/R)，采用線粒體分裂抑制劑進(jìn)行干預(yù)，并進(jìn)一步結(jié)合自噬相關(guān)抑制劑和激動劑，分別提取RNA和蛋白質(zhì)，檢測Beclin 1、 微管相關(guān)輕鏈蛋白3 II (microtubule-associated protein light chain 3 II, LC3 II) 等自噬相關(guān)分子的表達(dá)改變，進(jìn)而通過研究自噬探討線粒體分裂在腦I/R損傷中過程發(fā)揮的作用，闡明自噬是否可作為線粒體動態(tài)平衡與腦I/R損傷的研究橋梁。

材料與方法

一、主要試劑及抗體

NeurobasalTM、B27、谷氨酰胺、雙抗(100 IU/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)、改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)、無糖培養(yǎng)基(Gibco)；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)、雷帕霉素(rapamycin)、Mdivi-1(Sigma)；兔源性LC3 II抗體、兔源性Beclin 1抗體、鼠源性β-actin抗體(cell signaling technology)；Trizol、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量 PCR試劑盒(Takara)；Cell counting kit-8(上海生工)。

二、小鼠原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)

冰上頸椎脫臼處死孕15 d左右的C57BL/6小鼠，分離、剪開子宮，取出胎鼠并放于空培養(yǎng)皿中。顯微鏡下取胎鼠腦皮層組織，置于含有預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)的小培養(yǎng)皿中，剪碎后用0.25%胰蛋白酶37℃消化30 min后終止消化。玻璃滴管火焰拋光后，輕柔吹打。用DMEM培養(yǎng)基稀釋成5×105/mm3的密度接種到經(jīng)多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中，孵育4～6 h后，顯微鏡下觀察神經(jīng)元貼壁后，改用含B27和谷氨酰胺的Neurobasal繼續(xù)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。以后每3 d半量換液一次，培養(yǎng)10～12 d左右，待神經(jīng)元成熟后用于實驗。整個過程中注意不用劇烈晃動神經(jīng)元，否則可能造成軸突斷裂，影響神經(jīng)元狀態(tài)。

三、OGD/R模型的制備

取成熟的原代神經(jīng)元，將培養(yǎng)液更換為無糖培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于缺氧孵箱中，通入5% CO2和95% N2的混合氣，使孵箱內(nèi)氧濃度低于1%。培養(yǎng)2 h后，將培養(yǎng)基換為含B27和谷氨酰胺的Neurobasal培養(yǎng)液，再置于正常孵箱內(nèi)孵育不同指定時間。

四、細(xì)胞活力檢測(cell counting kit-8, CCK-8)

同時種植于兩個96孔板培養(yǎng)的神經(jīng)元一板為OGD/R(-)組，另一板為OGD/R(+)組。按指定分組加入相應(yīng)藥物，藥物濃度如下：Mdivi-1 (100 μM)、3-MA (10 mM)、rapamycin (100 nM)。OGD 2 h后加入相應(yīng)藥物，再進(jìn)行復(fù)氧(R)。復(fù)氧24 h后，每100 μl培養(yǎng)基中加入10 μl CCK-8工作液。2～4 h后，酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測各孔的吸光度值。按照公式計算神經(jīng)元細(xì)胞活力：細(xì)胞活力=(實驗組-空白組)/(對照組-空白組)× 100 %。

五、實時定量 PCR檢測

按照Trizol RNA提取試劑盒說明書，提取神經(jīng)元細(xì)胞總RNA，并用紫外分光光度儀測量RNA濃度。以總RNA為模板，按照說明書步驟逆轉(zhuǎn)錄為合成cDNA，再以cDNA為模板按Tap酶說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物均由Takara設(shè)計合成，Map1lc3上游引物：5-GCG CTT GCA GCT CAA TGC TA-3，下游引物：5-GTA CAC TTT CGG AGA TGG GAG TGG-3；Beclin 1上游引物：5-GGG TCA CCA TCC AGG AAC TCA-3，下游引物：5-CAC CAT CCT GGC GAG TTT CA-3；GAPDH上游引物：5-GGG TCA GAA GGA TTC CTA TG-3，下游引物：5-GGT CTC AAA CAT GAT CTG GG-3。結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行比較，計算各個基因mRNA水平的改變。

六、蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(Western blot)

輕輕吸凈培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，并用PBS洗1～2遍，然后加入混有1%蛋白酶抑制劑的裂解液充分裂解細(xì)胞，12 000 r/min離心25 min后吸上清。用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)定量后于12% SDS凝膠上電泳分離，上樣量為20 μg，再轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1～2 h，然后分別用LC3 II一抗 (1 ∶1 000 )、Beclin 1 (1 ∶2 000) 一抗和β-actin(1 ∶5 000)一抗4℃孵育過夜。用含0.1%Tween20的PBS充分洗膜，然后二抗室溫孵育1 h，再用PBS充分洗膜，最后用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光液發(fā)光。用Gel-pro分析軟件進(jìn)行分析各個條帶的灰度值，并以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行比較，得出各個基因蛋白水平的改變。

七、統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間多重比較采用LSD-t檢驗。所有數(shù)據(jù)比較，P< 0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié) 果

一、在原代培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元中，OGD/R處理后自噬發(fā)生上調(diào)

原代培養(yǎng)的小鼠腦皮層神經(jīng)元OGD/R處理后，觀察到的結(jié)果與國外學(xué)者研究相一致，發(fā)現(xiàn)原代神經(jīng)元內(nèi)Beclin 1蛋白表達(dá)水平隨復(fù)氧處理的時間延長而顯著升高，在本研究中復(fù)氧時長最長觀察到24 h，此時Beclin 1蛋白水平升高至峰值(P<0.001)(圖1 A, B)[4]。同樣，在OGD/R處理下，LC3 II/I比值在復(fù)氧6 h 后開始顯著升高，并在12 h和24 h 時達(dá)到峰值(P<0.01)(圖1 A, C)。進(jìn)一步通過實時定量 PCR檢測Beclin 1和Map1lc3在mRNA水平的改變，發(fā)現(xiàn)兩者的變化趨勢與各自蛋白表達(dá)的變化趨勢基本一致，也均有顯著改變(圖1 D, E)。結(jié)果提示，OGD/R處理后，神經(jīng)元自噬上調(diào)。

圖1 Western blot和RT-PCR檢測OGD/R后自噬相關(guān)分子表達(dá)

Fig 1 Autophagy related molecules were detected by Western blot and RT-PCR

A: Beclin 1, LC3 II/I and β-actin were detected by Western blot; B: Quantity of Beclin 1 detected by Western blot (aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001,dP<0.001, all of themvsnormal group); C: Quantity of LC3 II/I detected by Western blot (aP<0.05,bP<0.01,cP<0.01, all of themvsnormal group); D: Quantity of Beclin 1 detected by RT-PCR (aP<0.05,bP<0.05,cP<0.01,dP<0.01,eP<0.01, all of themvsnormal group); E: Quantity of Map1lc3 detected by RT-PCR (aP<0.05,bP<0.01,cP<0.01, all of themvsnormal group).

圖2 檢測各不同處理組的細(xì)胞活力和Mdivi-1對自噬相關(guān)分子的影響

Fig 2 Detection of cellular vitality in all groups and role of Mdivi-1 on autophagy related molecules

A: Cellular vitality in different groups were detected by CCK-8 (aP<0.01, Mdivi-1(-): NvsOGD/R;bP<0.01, Mdivi-1(-): OGD/RvsOGD/R-Rapa;cP<0.05, Mdivi-1(-): OGD/RvsOGD/R-3-MA;dP<0.05, OGD/R: Mdivi-1(-)vsMdivi-1(+);eP<0.05, Mdivi-1(+): OGD/RvsOGD/R-Rapa); B: Beclin 1 and LC3 II/I were detected by Western blot after treatment of Mdivi-1 and OGD/R；C: Quantity of Beclin 1 detected by Western blot (aP<0.001, N-ConvsN-OGD/R;bP<0.05, OGD/RvsOGD/R-Mdivi-1); D: Quantity of LC3 II/I detected by Western blot (aP<0.01, NvsOGD/R;bP<0.05, OGD/RvsOGD/R-Mdivi-1).

二、線粒體分裂抑制劑通過抑制自噬發(fā)生，進(jìn)而加重OGD/R損傷

Mdivi-1是線粒體分裂抑制劑，它抑制了線粒體分裂蛋白(dynamin-related protein 1, Drp1)向線粒體遷移，從而抑制了Drp1介導(dǎo)的線粒體分裂功能。在本研究中，選取自噬最為活躍的時間點OGD 2 h/R 24 h作為OGD/R的處理條件，觀察研究神經(jīng)元損傷情況以及Mdivi-1對其影響。CCK-8結(jié)果顯示：OGD/R處理后，神經(jīng)元細(xì)胞活力下調(diào)(P<0.01)，在添加自噬抑制劑3-MA后，細(xì)胞活力下調(diào)更為明顯(P<0.05)；然而當(dāng)自噬激動劑rapamycin存在時，細(xì)胞活力有明顯改善(P<0.01)。采用Mdivi-1干預(yù)后，結(jié)果顯示：OGD/R處理后，添加Mdivi-1組神經(jīng)元活力較未添加Mdivi-1組明顯下調(diào)(P<0.05)；但是研究發(fā)現(xiàn)，在添加rapamycin后，Mdivi-1組細(xì)胞活力上調(diào)(P<0.05)。上述結(jié)果提示，OGD/R處理后，Mdivi-1對神經(jīng)元活力的影響與3-MA相似，同時其對細(xì)胞活力的影響可被rapamycin改善。

為進(jìn)一步研究Mdivi-1是否通過影響自噬進(jìn)而參與OGD/R損傷機(jī)制，利用Western blot檢測了其對自噬相關(guān)分子的影響。結(jié)果顯示：在OGD/R損傷中，Mdivi-1可明顯降低Beclin 1(P<0.05, 圖2 B,C)和LC3 II的表達(dá)(P<0.05, 圖2 B,D)。上述Western和CCK-8結(jié)果共同提示，OGD/R處理后，Mdivi-1可通過降低自噬從而加重?fù)p傷。

討 論

自噬是目前在退行性疾病中較為熱門的研究方向，其與阿爾茨海默病 (Alzheimer disease)、帕金森病(Parkinson's disease)以及腦缺血疾病的關(guān)系已有國內(nèi)外文章相繼報道[5]。目前，多數(shù)研究認(rèn)為自噬是維持細(xì)胞正常狀態(tài)的生理過程，但在一些外界刺激的作用下，自噬也會通過清除細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器或一些多余的代謝產(chǎn)物對細(xì)胞起到一定保護(hù)作用[6]。體內(nèi)和體外的研究均表明，在腦I/R損傷中，細(xì)胞會啟動自噬清除機(jī)制，從而減輕損傷[7]。線粒體在I/R損傷以及自噬中都發(fā)揮重要作用，而近來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，線粒體也可介導(dǎo)自噬(線粒體自噬，mitophagy)，其在自噬中占有很大比重，尤其是在缺血缺氧的病理疾病中，線粒體自噬發(fā)揮著重要作用[3]。然而，線粒體不僅能介導(dǎo)誘發(fā)線粒體自噬過程，而且其內(nèi)的特定分子還可參與自噬體膜的形成，從而促進(jìn)自噬發(fā)生[8]。無論是線粒體介導(dǎo)的線粒體自噬還是線粒體參與形成的自噬，兩者均與線粒體的正常功能密切相關(guān)。而線粒體的融合與分裂的動態(tài)平衡則是維持線粒體功能的基本過程，一旦這種平衡發(fā)生紊亂，線粒體功能就會受損，那么與線粒體相關(guān)的各種生理或病理進(jìn)程都將受到影響[9]。線粒體的融合與分裂是兩個相反的過程，而本研究的主要關(guān)注點是線粒體分裂相關(guān)過程。Mdivi-1是一種特異性的線粒體分裂抑制劑，其作用靶點就是調(diào)控線粒體分裂的重要蛋白-Drp1[10]。J Grohm等提出Mdivi-1可以減少OGD/R引起的凋亡，從而起到神經(jīng)保護(hù)性作用[11]。這一結(jié)果與本研究并不矛盾，在上述研究與本研究中，Mdivi-1的使用時間和濃度有顯著區(qū)別。Ikeda, Y等證實：長時間、高濃度量Mdivi-1可抑制Drp1向線粒體遷移，從而抑制線粒體分裂，其所起作用與Drp1敲除相似[2]。所以在本研究中，為了有效達(dá)到抑制Drp1的效果，從而使用的是較高濃度的Mdivi-1。

本研究在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元OGD/R模型中，通過聯(lián)合Mdivi-1與自噬抑制劑/激動劑進(jìn)行干預(yù)，探討自噬在Mdivi-1與OGD/R損傷中的機(jī)制。結(jié)果提示，首先證實在OGD 2 h/R 24 h處理條件下，自噬上調(diào)且對神經(jīng)元I/R損傷起適應(yīng)性保護(hù)作用；結(jié)合模型進(jìn)一步觀察到100 μM的Mdivi-1可加重神經(jīng)元OGD/R損傷，其機(jī)制可能為抑制了Drp1向線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)，使線粒體分裂功能受損，進(jìn)而抑制了自噬的發(fā)生，加重I/R損傷。因此，在OGD/R處理后，抑制線粒體分裂可通過抑制自噬發(fā)生，從而加重OGD/R損傷，為預(yù)防I/R損傷的進(jìn)一步損傷提供了新靶點。

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MitochondrialfissioninhibitoraggravatesOGD/R-inducedinjurythroughinhibitionofautophagy

PENGCheng,ZHANGLei,RAOWei,FEIZhou

DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveThe objective of the research is to study the roles and mechanisms of mitochondrial fission inhibitor (Mdivi-1) in primary cultured cortex neurons of mice after Oxygen-glucose deprivation/Reperfusion (OGD/R) injury.MethodsOccurrence of autophagy was detected after establishing OGD/R model in primary cultured cortex neurons. The mRNA and protein levels of autophagy-related genes were detected accompanied treatment with autophagy inhibitor (3-MA), autophagy agonist (rapamycin) and Mdivi-1. Moreover, the neural injury was measured.ResultsFollowing OGD/R treatment, autophagy was increased dependent on reperfusion times. And both levels of Beclin 1 and Microtubule-associated protein light chain 3 II (LC3 II) peaked at 24 h (P<0.001,P<0.01). Results of cell counting kit-8 (CCK-8) after OGD/R treatment showed that Mdivi-1 could aggravate the injury (P<0.05), however, rapamycin could reduce not only the OGD/R injury (P<0.01), but also the aggravating damage induced by Mdivi-1 (P<0.05). Furthermore, Mdivi-1 significantly reduced the levels of Beclin 1 and LC3 II following OGD/R injury (P<0.05).ConclusionMdivi-1 could aggravate the injury induced by OGD/R through inhibiting the occurrence of autophagy.

Cerebral ischemia/reperfusion injury; Mitochondrial fission; Autophagy

1671-2897(2016)15-101-04

R 651.15

A

國家自然科學(xué)基金資助項目(81430043)

彭程，醫(yī)師，博士研究生，E-mail: doctorpc@163.com

*通訊作者： 費(fèi)舟，教授、主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，E-mail: feizhou@fmmu.edu.cn

2015-09-14；

2015-12-20)