Ming Liu, Jinhong Sun, Jingqiu Cui, Wei Chen, Huan Guo, Fabrizio Barbetti, Peter Arvan, 崔景秋，劉銘校譯

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胰島素基因突變: 從遺傳學和β細胞生物學到臨床疾病

Ming Liu, Jinhong Sun, Jingqiu Cui, Wei Chen, Huan Guo, Fabrizio Barbetti, Peter Arvan, 崔景秋，劉銘校譯

近年來，越來越多新的胰島素基因突變開始吸引人們的注意，已證實突變位于胰島素基因的非翻譯區(qū)和前胰島素原的編碼區(qū)，包括信號肽、胰島素鏈、C肽和A鏈，以及信號肽酶和激素原轉換酶的蛋白水解剪切位點。這些突變影響胰島細胞中胰島素合成的不同步驟，引起胰島素原錯誤折疊和早發(fā)的常染色體顯性糖尿病，前胰島素原基因突變所致的前胰島素原加工缺陷、胰島素原錯誤折疊和內質網(wǎng)應激可能在糖尿病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

糖尿病；胰島β細胞；胰島素生物合成；胰島素基因突變；內質網(wǎng)應激；錯誤折疊的胰島素原

1 概述

胰島素的作用是調節(jié)機體代謝，維持血糖平衡，在胰島細胞中，需要30～150 min合成成熟且有生物活性的胰島素。

(1)胰島素前體——前胰島素原在細胞質中翻譯后，定向轉位跨過內質網(wǎng)膜，在內質網(wǎng)膜的腔內側被信號肽酶水解，形成胰島素原。(2)在氧化的內質網(wǎng)環(huán)境中，胰島素原發(fā)生氧化折疊，形成3個進化保守的二硫鍵(B7-A7，B19-A20和A6-A11)，使得胰島素原可以轉運出內質網(wǎng)。(3)胰島素原通過高爾基體的胞內運輸，被激素原轉換酶(PC)1/3和PC2和羧肽酶E(CPE)加工處理成C肽和成熟胰島素，儲存在胰島素分泌顆粒中，遇刺激后釋放(圖1)。在1967年胰島素原被發(fā)現(xiàn)之后，眾多研究聚焦于胰島素原的細胞內運輸、加工處理、儲存顆粒的形成和隨后的分泌。

圖1 胰島素基因突變對胰島素生物合成主要步驟的影響

胰島素病的概念最初是用來描述罕見的與胰島素基因突變相關的單基因成人發(fā)病糖尿病。那些突變位于胰島素或胰島素原的二元剪切位點，經(jīng)典胰島素基因突變損害了胰島素與受體的結合，導致胰島素原運輸?shù)絻Υ骖w粒的改變或者胰島素內源性蛋白分解、加工處理的缺陷。

2007年，Stoy首先報道了10個新的導致新生兒糖尿病的胰島素基因突變。截至目前，共有51個胰島素基因突變可引起單基因糖尿病(表1)，這些突變位于胰島素基因的非翻譯區(qū)、前胰島素原信號肽編碼區(qū)、信號肽酶的蛋白水解剪切位點、胰島素B鏈、C肽、A鏈和PC1/3和PC2的剪切位點。臨床表現(xiàn)譜廣泛，從嚴重的新生兒發(fā)病到溫和的成年人發(fā)病，表明不同的胰島素基因突變體等位基因表型不同，并通過不同的機制引發(fā)糖尿病。越來越多的證據(jù)表明致糖尿病胰島素基因突變的臨床嚴重性與突變特性以及它們所影響的胰島素生物合成途徑的步驟相關(圖1，表1)。

2 致糖尿病的胰島素基因突變

基于遺傳學結果，胰島素基因突變可分為兩大組：隱性和顯性。隱性胰島素基因突變是功能缺失的突變，包括胰島素基因缺失或截斷等，伴隨胰島素基因轉錄失敗、mRNA不穩(wěn)定或者由于缺乏天然起始密碼子造成的翻譯起始缺陷，從而影響胰島素的生物合成。這些突變可能導致突變體等位基因的胰島素產物減少。而其顯性遺傳模式表明剩余正常的胰島素等位基因足以維持正常的血糖。嚙齒類有兩個有功能的胰島素基因：Ins1和Ins2，研究顯示Ins1或Ins2的純合子缺失加上第二個胰島素基因的雜合子缺失并不能導致糖尿病，再次證明即使僅存一個有功能的胰島素等位基因，也足使血糖維持在正常范圍內(雖然有功能的胰島素等位基因缺失個體在成人時期發(fā)生糖尿病的風險可能大大增加)。大約80%(39/51)的胰島素基因突變以常染色體顯性方式遺傳，其中大多數(shù)(30/39)引起青少年發(fā)病型的胰島素基因突變糖尿病(MIDY)。對Akita鼠的研究顯示，胰島素原Ins2等位基因發(fā)生C96Y突變，導致內質網(wǎng)應激(ERS)和β細胞死亡。除C96Y突變外，其他導致MIDY的基因突變引起胰島素生成缺陷的原因可能是由于胰島細胞中共表達的突變和野生型胰島素原分子之間異常的相互作用，突變基因阻止了共表達的野生型胰島素原的轉運，并最終導致胰島素產量減少，表明在MIDY中，突變胰島素原對野生型胰島素原的顯性負效應是胰島素缺乏的關鍵點。

表1 胰島素基因突變及其對胰島素生物合成的影響

除了導致MIDY的突變外，少數(shù)(9/39)常染色體顯性胰島素基因突變與遲發(fā)型糖尿病有關，包括先前證實的經(jīng)典的胰島素病和新近發(fā)現(xiàn)的兩個前胰島素原信號肽突變。不像導致MIDY的基因突變，與遲發(fā)型糖尿病有關的突變似乎與內質網(wǎng)中的胰島素原折疊無關，筆者描述了這一獨特的胰島素基因突變群體，大多基于已經(jīng)實驗證實的胰島素生物合成過程中的細胞生物學缺陷，未經(jīng)實驗證實的突變則整合入與突變相關聯(lián)的預測缺陷群組(圖1，表1)。

3 來自胰島素基因突變的啟示：生物學缺陷和糖尿病臨床表型的聯(lián)系

致糖尿病的胰島素基因突變表現(xiàn)出廣泛的臨床譜，從新生兒發(fā)生的嚴重胰島素缺乏型糖尿病到遲發(fā)的輕型糖尿病，一個攜帶C43G突變的家族病例顯示，此突變破壞了關鍵的鏈間二硫鍵，導致內質網(wǎng)中胰島素原錯誤折疊，攜帶突變的先證者43周齡時發(fā)生了很嚴重的糖尿病，然而，其父親雖然攜帶同樣突變，卻在30歲時才確診輕微的2型糖尿病。因此，臨床表現(xiàn)的異質性依賴于胰島素基因突變本身的生物學行為和其他遺傳環(huán)境因素。

3.1 影響基因轉錄和翻譯的胰島素基因突變 在胰島細胞中，胰島素的生物合成在轉錄和翻譯水平上得到調節(jié)。經(jīng)葡萄糖刺激后，總蛋白合成增加2～6倍，而前胰島素原的生物合成在1 h內增加30倍，表明可能存在特殊的調控機制。幾個新發(fā)現(xiàn)的影響轉錄和翻譯的胰島素基因突變從遺傳學上證實了胰島素基因非翻譯區(qū)調控元件的病理生理學重要性。共12個突變以隱性方式進行遺傳，其中5個位于啟動子區(qū)，導致肌腱膜纖維肉瘤癌基因同系物A和神經(jīng)源性分化因子-1(NEUROD1)調節(jié)的啟動子區(qū)缺失或者額外的DNA結合蛋白結合位點的斷裂，導致啟動子活性降低90%。表明胰島素順式調節(jié)元件是調節(jié)胰島素生物合成所必需的條件。位于胰島素mRNA 3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)的c.*59 A>G突變，可以導致胰島素mRNA嚴重的不穩(wěn)定性，在調節(jié)胰島素生物合成過程中起重要作用。位于前胰島素原起始密碼子第3個核苷酸的兩個突變(c.3G>T和c.3G>A)破壞了前胰島素原本身的翻譯起始位點，雖然前胰島素原第5個殘基處還有另一個編碼甲硫氨酸的ATG，可作為備選的起始密碼子，但ATG上游的核苷酸序列并不支持翻譯的起始，導致了胰島素產量減少約80%。

圖2 與糖尿病相關的前胰島素原信號肽突變及其3個功能區(qū)

3.2 影響前胰島素原內質網(wǎng)定位和轉位的胰島素基因突變 胰島素生物合成的第一步包括新合成的前胰島素原從細胞質轉位入內質網(wǎng)，此過程由前胰島素原N端信號肽引導。前胰島素原的信號肽有24個氨基酸，包括3個區(qū)：正電荷的n區(qū)，中央疏水的h區(qū)和一個極性的含有信號肽酶剪切位點的c區(qū)。目前，已經(jīng)報道4個位于信號肽區(qū)的新突變可以引發(fā)糖尿病，分別位于3個區(qū)(圖2)，它們的臨床表型差異很大，包括L13R/A24D引起的新生兒發(fā)病的嚴重胰島素缺乏糖尿病和R6C或R6H相關的成人發(fā)病的輕型糖尿病，這些患者糖尿病的發(fā)生、發(fā)展可能存在不同的細胞學缺陷和分子機制。筆者近期發(fā)表的信號肽剪切位點A24D突變不僅導致無效的信號肽剪切，而且由于剪切發(fā)生在其他候選位點產生了異常的胰島素原，因此雖然A24D突變前胰島素原的胰島素原部分具有與野生型相同的序列，未剪切和不適當剪切的前胰島素原均可導致內質網(wǎng)錯誤折疊。凸顯了信號肽剪切與下游胰島素原折疊協(xié)調性的重要意義。

在哺乳動物細胞中，大多數(shù)新合成的分泌蛋白以共翻譯的方式轉位進入內質網(wǎng)，在此過程中，當新生多肽鏈的信號肽進入核糖體后，首先被信號肽識別顆粒(SRP)識別并結合，形成信號肽-核糖體-新生多肽鏈復合體，接著復合體通過SRP錨定到內質網(wǎng)膜上的SRP受體而定位于內質網(wǎng)膜上，隨后信號肽與轉位子Sec61相互作用，剩余多肽鏈的轉位借此定向。至少有3個因素決定了信號肽序列在Sec61內的定向：h區(qū)的長度、h區(qū)側面信號序列的電荷梯度和跨越內質網(wǎng)膜的轉位子的電荷梯度。因為Sec61具有相對于內質網(wǎng)腔保守的正電荷梯度，信號肽的n區(qū)正電荷易于形成一個環(huán)，使得信號肽的N端面向胞質，C端面向內質網(wǎng)腔，即所謂的“正電荷在里面”法則。然而，雖然此法則是公認的前蛋白通過內質網(wǎng)膜轉位過程中信號肽的定位原則，但分泌膜蛋白的信號肽中n區(qū)正電荷的病理生理學意義僅僅在近來才得到驗證。

前胰島素原R6C或R6H突變影響分泌蛋白的定位、轉位，但其定位到胰島素顆粒的過程并未發(fā)現(xiàn)缺陷，筆者研究小組也分別檢測了帶有大GFP(248個氨基酸)標簽、小Myc標簽(10個氨基酸)或者無標簽的R6C或R6H突變的前胰島素原的轉位效率，結果證實帶有GFP標簽的R6C/H突變胰島素原在胰島素定位、轉位過程中沒有缺陷，而至少50%新合成的Myc標簽/無標簽的R6C/H突變胰島素原在定位到內質網(wǎng)膜后不能有效地轉位，提示與小分泌蛋白相比，大的分泌蛋白對信號肽n區(qū)正電荷缺失敏感性小。這個長度依賴的潛在機制，以及是否該行為是前胰島素原所特有的，尚不明確。最近一項研究顯示，多肽鏈的長度決定分泌蛋白通過共翻譯方式還是翻譯后方式進行轉位，全長合成完成之前，小分泌蛋白的信號肽可能不易被SRP以共翻譯的方式識別和定位。因此，定位和轉位的后翻譯模式可能提供一個重要的備份機制，以增強包括前胰島素原在內的小分泌蛋白的轉位效率。

在一個宮內發(fā)育遲緩女嬰體內發(fā)現(xiàn)L13R突變前胰島素原，其出生后次日就發(fā)生了嚴重的糖尿病。此突變位于前胰島素原信號肽的h區(qū)，帶電荷的精氨酸取代了疏水的亮氨酸，從而打破了h區(qū)的疏水核，可能影響分泌蛋白的SRP識別、內質網(wǎng)靶向定位和轉位。因此，L13R突變影響新合成的前胰島素原進入內質網(wǎng)的最早期步驟，然而它導致β細胞功能衰竭和糖尿病的細胞內缺陷仍然需要進一步實驗驗證。

3.3 影響內質網(wǎng)中胰島素原折疊的胰島素基因突變 在所有常染色體顯性胰島素基因突變中，超過70%(30/39)可影響內質網(wǎng)中胰島素原正常的折疊途徑(表1)。目前證實，大約半數(shù)突變可以導致內質網(wǎng)中胰島素原的錯誤折疊，其中研究最多的是C96Y突變，由于其最初在Akita鼠中發(fā)現(xiàn)，故又稱Akita突變。研究顯示，兩個Ins2等位基因中的一個攜帶C96Y突變，使小鼠斷乳后不久即發(fā)生糖尿病，胰島素原6個保守的半胱氨酸殘基中的一個發(fā)生突變，可阻斷二硫鍵B7-A7的形成，產生一個未配對的B7位半胱氨酸，體內、外研究均證明C96Y突變引起內質網(wǎng)中胰島素原的錯誤折疊，誘發(fā)ERS，最終導致β細胞死亡。另一個攜帶C95S突變的Munich糖尿病鼠是由于N-乙基N-亞硝基脲化學誘變產生的。C95S和C96Y突變都已經(jīng)在人類中被發(fā)現(xiàn)并可引起MIDY，所以這兩種鼠都可用于研究錯誤折疊的胰島素原在體內引發(fā)細胞缺陷和應激的研究。此外，還有16個突變也可產生新的未配對的半胱氨酸殘基，這些突變位于本身的半胱氨酸位點，或者是突變產生了新的半胱氨酸殘基，因為半胱氨酸殘基中天然二硫鍵的形成是內質網(wǎng)胰島素原折疊途徑的關鍵步驟，所有具有未配對半胱氨酸殘基的突變都可能嚴重影響二硫鍵的形成，導致胰島素原的錯誤折疊。

除了產生未配對半胱氨酸外，還有12個突變可導致內質網(wǎng)胰島素原的錯誤折疊，其中11個位于B鏈，1個位于前胰島素原信號肽剪切位點，需要進一步研究點突變如何影響胰島素原在內質網(wǎng)中的折疊。值得關注的是，幾乎所有突變都位于前胰島素原分子高度保守的殘基，一些對胰島素自身折疊至關重要，參與B鏈和A鏈的排列，以利于天然胰島素原二硫鍵的配對。因此，即使這些突變并不直接改變參與胰島素原正常二硫鍵配對的半胱氨酸殘基，但A24D，H29D，L30P，G32R，L35P，R46Q和G47V突變后新合成的胰島素原，都存在二硫鍵形成缺陷，導致未配對的二硫化物同分異構體增加。

3.4 影響胰島素原加工處理和運輸?shù)囊葝u素基因突變 胰島素原經(jīng)過內質網(wǎng)內的氧化折疊和二聚化離開內質網(wǎng)至高爾基體。當跨高爾基體網(wǎng)絡腔內Zn2+濃度開始升高時，胰島素原發(fā)生Zn2+依賴的六聚化，進入不成熟的分泌顆粒，經(jīng)過PC1/3和PC2以及CPE的內源性蛋白水解剪切作用，胰島素原六聚體被加工為成熟的胰島素和C肽，5個胰島素基因突變位于胰島素原B鏈和C肽的連接處，或者C肽和A鏈之間，分別與PC1/3優(yōu)先和PC2優(yōu)先的剪切位點相對應。這些剪切位點突變的臨床表型依據(jù)不同的殘基取代而變異很大。特別是C肽和A鏈連接處的精氨酸被亮氨酸、組氨酸或脯氨酸所取代，可導致胰島素原加工的缺陷，與相對無癥狀的高胰島素原血癥、交界性葡萄糖耐量或者遲發(fā)的輕微糖尿病相關。相反，如果在C肽-A鏈或C肽-B鏈連接處用半胱氨酸取代精氨酸，則可導致早發(fā)的嚴重胰島素缺陷型糖尿病，亮氨酸R89L突變可以使胰島素原有效地從細胞中分泌出去，而半胱氨酸R89C突變則引起胰島素原的錯誤折疊并儲留在內質網(wǎng)，因此，雖然R89C突變發(fā)生在PC2剪切位點，其致糖尿病的潛在機制并不是由于PC2介導的胰島素原加工處理缺陷，主要是由于胰島素原的錯誤折疊和內質網(wǎng)應激。這更彰顯了內質網(wǎng)中胰島素原錯誤折疊引發(fā)的嚴重病理結果。

而另一個引起高胰島素原血癥的突變源于34位天門冬氨酸取代了保守的組氨酸而發(fā)生的H34D突變，對應于B鏈第10個殘基。對表達這一突變的轉基因鼠的研究顯示，超過50%的H34D突變胰島素原可以正常轉運到分泌顆粒并加工成胰島素。然而，約15%新合成的胰島素原從細胞中分泌，20%在β細胞降解。對短暫表達H34D突變胰島素原的At-T20細胞的研究也獲得類似的結果，在β細胞中幾乎所有轉運出內質網(wǎng)的新合成胰島素原最終都可進入分泌顆粒，H34D突變的胰島素原排序缺陷表明胰島素原的結構信息在β細胞內排序、運輸和儲存過程中起重要作用。

3.5 影響胰島素與受體結合的胰島素基因突變 20世紀80年代早期就已經(jīng)證實F48S、F49L和V92L[即F(B24)S、F(B25)L和V(A3)L]突變均可導致經(jīng)典胰島素病，這些突變位于胰島素與其受體結合重要的區(qū)域。上述突變胰島素與其受體的結合效率從野生型的0.2%到14%不等。這些突變胰島素與其受體結合受損使胰島素清除率顯著受損，進而導致其半衰期增加，使循環(huán)中胰島素/C肽的比例升高。這些發(fā)現(xiàn)證實，受體介導的胰島素生理降解是胰島素體內清除的主要途徑。

除了受體結合缺陷，近來研究發(fā)現(xiàn)，與V92L或引起MIDY的突變相比，F(xiàn)48S突變呈現(xiàn)出中間表型，包括內質網(wǎng)氧化折疊的中等缺陷、分泌有限的減少、未折疊蛋白反應(UPR)的適度激活以及對共表達的野生型胰島素原的部分顯性負效應。研究表明，胰島素B鏈第24位殘基苯丙氨酸在穩(wěn)定天然的疏水側鏈方面起重要作用，增加了B19-A20二硫鍵配對的效率。來自核磁共振分光鏡的計算機模型數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)48S突變導致B20-B30殘基結構的變異，與B19-A20二硫鍵配對干擾相符。相反，另一個經(jīng)典的V92L突變胰島素原的結構與野生型胰島素相同，卻僅引起輕微的熱穩(wěn)定性的降低。

4 胰島素基因突變引起β細胞功能衰竭和糖尿病的潛在分子機制

4.1 內質網(wǎng)中錯誤折疊胰島素原的細胞反應 一旦轉運到內質網(wǎng)腔，前胰島素原就立即經(jīng)過快速的氧化折疊，加工成胰島素原。導致常染色體顯性MIDY的胰島素基因突變，可以引起胰島素原在內質網(wǎng)中的錯誤折疊。錯誤折疊的分子與內質網(wǎng)分子伴侶相結合，可以被內質網(wǎng)質控系統(tǒng)所識別，免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)是與錯誤折疊的胰島素原和折疊中間體結合的主要分子伴侶之一。作為熱休克蛋白70(HSP70)超家族的一員，BiP是識別未折疊和錯誤折疊蛋白的主要分子伴侶，通過間接促進3個UPR信號通路包括蛋白激酶樣內質網(wǎng)激酶(PERK)、肌醇需求酶(IRE1)和活化轉錄因子6(ATF6)的激活，感受內質網(wǎng)環(huán)境變化，維持內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)平衡。在正常的β細胞，3個跨膜感受蛋白的腔內區(qū)均具有與BiP結合的能力，然而，在表達致MIDY的基因突變的β細胞，BiP優(yōu)先與錯誤折疊的胰島素原結合，協(xié)同IRE1、PERK和ATF6的激活，啟動UPR。近來研究表明，未折疊蛋白也能直接結合激活IRE1。UPR的急性活化是一種可能減輕ERS的防御機制，可以通過抑制蛋白質翻譯、選擇性上調內質網(wǎng)分子伴侶以及加速錯誤折疊蛋白質的逆轉位，使蛋白體降解，這一過程稱作內質網(wǎng)相關降解(ERAD)。然而，在Akita鼠(也可能在MIDY患者)中，錯誤折疊的胰島素原在內質網(wǎng)中的持續(xù)表達導致內質網(wǎng)擴大，UPR活化延長，打破內質網(wǎng)蛋白質的動態(tài)平衡，導致慢性ERS和凋亡信號的激活，促進β細胞死亡。ERS相關的凋亡可以被C/EBP同源蛋白(CHOP：基因名稱GADD153)的轉錄激活所介導。GADD153的靶向斷裂降低了β細胞的死亡率，使雜合Akita鼠糖尿病的發(fā)生延緩8～10周。

4.2 錯誤折疊的胰島素原對共表達的野生型胰島素原的旁觀效應 Akita鼠的糖尿病僅是由于ERS介導的β細胞死亡所引起的，然而如果通過阻斷GADD153的轉錄，減少Akita鼠的β細胞凋亡，僅可以延緩但并非阻止糖尿病的發(fā)生，表明可能還有除了β細胞數(shù)量減少之外的其他因素參與了錯誤折疊胰島素原導致糖尿病的發(fā)生過程。對β細胞共表達Akita突變和融合了GFP的胰島素原的雜合鼠進行研究，發(fā)現(xiàn)新生Akita鼠在出現(xiàn)高血糖時，其β細胞數(shù)量并沒有減少，Gupta等發(fā)現(xiàn)Akita鼠發(fā)生糖尿病時，胰島出現(xiàn)了β細胞增生。最近建立了一個Akita突變的轉基因豬模型，其出生后24 h內就表現(xiàn)出明顯的高血糖-胰島素缺乏的直接征象，然而與生后1周多的同窩對照仔相比，轉基因豬的β細胞數(shù)量并沒有實質差別。這些研究表明，在錯誤折疊的突變胰島素原導致糖尿病的過程中，胰島素缺乏先于β細胞數(shù)量減少。

敲除Ins1/Ins2的小鼠再與其他INS基因雜合，并不能引起糖尿病，如同人胰島素基因突變一樣，敲除其中一個胰島素等位基因，表現(xiàn)隱性。因此，β細胞數(shù)量減少或者一個正常的胰島素等位基因缺失可能都不是MIDY引發(fā)糖尿病的充分理由。如上所述，Akita鼠的β細胞并沒有因表達錯誤折疊的突變胰島素原而發(fā)生ERS。然而，與野生型相比，Akita鼠β細胞中所有的蛋白質包括特異的胰島素原合成均有所減少，表明胰島素產量的減少并非由于胰島素原合成減少所致。脈沖-追蹤實驗顯示，合成2 h后，大多數(shù)野生型胰島素原加工為成熟胰島素，而剩余部分卻沒被加工，發(fā)生降解，導致胰島素產量減少?？傊?，對Akita鼠的研究表明，胰島素缺乏是由于胰島素原到胰島素的生物合成途徑缺陷所引發(fā)的。

基于上述理由，MIDY突變引起的正常胰島素原加工過程的細胞缺陷發(fā)生在β細胞數(shù)量顯著減少之前，可能是它們致胰島素產量減少的原因。Akita鼠的大量野生型胰島素原錯誤折疊，可被內質網(wǎng)分子伴侶BiP識別，表明錯誤折疊的突變胰島素原能影響共表達的野生型胰島素原的正常折疊，原因可能是：(1)錯誤折疊的突變胰島素原引起的ERS能改變內質網(wǎng)環(huán)境，改變分子伴侶的利用率和氧化還原環(huán)境，甚至可能影響前胰島素原轉位的動力學以及信號肽在內質網(wǎng)膜的剪切，從而直接/間接影響野生型胰島素原在內質網(wǎng)的正常折疊通路。然而，在用低劑量衣霉素預處理16 h誘導ERS的細胞中，野生型胰島素原持續(xù)分泌出內質網(wǎng)，因此，輕微的急性ERS似乎不足以阻斷胰島素原的運輸(而長時間嚴重的ERS對胰島素原折疊和運輸?shù)挠绊懭匀挥写鞔_)。(2)錯誤折疊的突變胰島素原直接影響共表達的野生型胰島素原的內質網(wǎng)折疊信號通路。似乎包括了突變胰島素原半胱氨酸殘基對野生型分子間的巰基攻擊，形成分子間二硫鍵。因為胰島素原的全部6個半胱氨酸殘基通常都會形成分子內二硫鍵配對，因此任何分子間二硫鍵都是非天然的，并會給野生型帶來一個未配對的半胱氨酸殘基，進一步產生不適當?shù)南嗷プ饔茫虼擞绊懸吧鸵葝u素原的折疊，導致突變和野生型分子之間形成二硫鍵。這種異常蛋白復合體導致野生型胰島素原儲留在內質網(wǎng)中不能進一步轉運。因此Akita突變的β細胞也能持續(xù)合成正常量的胰島素原，只是野生型胰島素原的內質網(wǎng)輸出障礙直接導致了胰島素產量的減少，這是胰島素缺乏型糖尿病的始動因素。

錯誤折疊的突變胰島素原對共表達的野生型胰島素原的顯性負效應似乎呈劑量依賴性。雄性Akita Ins2雜合鼠斷乳后很快出現(xiàn)高血糖，而雄性Akita Ins2純合鼠出生后即發(fā)生更嚴重的糖尿病。相反，當人為控制Akita突變低水平表達時(內源性Ins2不多于4%)，糖尿病發(fā)生率很低(雄性低于10%)，但糖耐量實驗呈現(xiàn)糖尿病前期表現(xiàn)。同樣，Akita突變胰島素原水平低于內源性胰島素基因15%的轉基因豬，也沒有糖尿病表型。反之，當Akita突變胰島素原的表達繼續(xù)升高達到75%時，轉基因豬在生后24 h內即出現(xiàn)高血糖。細胞實驗中也呈現(xiàn)劑量依賴關系，隨著突變與野生型胰島素原表達的比例逐漸下調，野生型胰島素原的顯性負效應也逐漸減少。綜上，細胞和動物實驗均表明致MIDY的基因突變以劑量依賴的方式起作用。

4.3 內質網(wǎng)中突變胰島素原和共表達的野生型胰島素原的相互作用 最近研究不僅證實致MIDY的基因突變對野生型胰島素原呈劑量依賴的顯性負效應，而且證實野生型對突變胰島素原的雙向效應。同一突變轉染β細胞與非β細胞得到不同的結果。在轉染的β細胞中，由于存在大量內源性野生型胰島素原，研究者發(fā)現(xiàn)某些致MIDY基因(如R89C)的突變胰島素原可轉運出內質網(wǎng)，運輸?shù)揭葝u素分泌顆粒。相反，在缺乏野生型胰島素原的非β細胞，同一突變則無法轉運出內質網(wǎng)。

更重要的是，這種營救效應似乎是蛋白特異性的，雖然野生型胰島素原營救了某些致MIDY的突變胰島素原，但卻不能營救共表達的突變甲狀腺球蛋白。相反，野生型甲狀腺球蛋白也不能營救共表達的致MIDY基因突變的胰島素原的分泌，而卻能促進兩個突變cog-Tg和rdw-Tg甲狀腺球蛋白的分泌。這種雙向效應在MIDY發(fā)生、發(fā)展中的病理生理意義仍然需要進一步評估但可能在某些遺傳疾病的發(fā)病機制中起重要作用。在常染色體顯性疾病如MIDY的雜合子中，占主導方向的是突變阻斷了共表達的野生型蛋白，有些導致MIDY的基因突變根本不能被野生型胰島素原營救，所以在這些雜合子患者中，沒有雙向效應。反之，在常染色體隱性疾病中，主導方向是野生型蛋白不僅有效地從內質網(wǎng)輸出，它們也可以促進其二聚體突變搭檔運出內質網(wǎng)，減輕這些錯誤折疊突變蛋白引起的潛在ERS。

4.4 未轉位/錯誤轉位的前胰島素原的細胞質反應 前述3個前胰島素原信號肽突變R6C、R6H和L13R會影響SRP的識別、內質網(wǎng)的靶向定位和(或)前胰島素原通過內質網(wǎng)膜的轉位。近來研究顯示靶向定位到內質網(wǎng)后，R6C/H突變前胰島素原不能有效地轉位通過內質網(wǎng)膜，在細胞內降解。研究表明，大多數(shù)新合成的未轉位R6C/H突變前胰島素原分子被降解，然而，也有一定比例的未轉位前胰島素原在細胞內重新定位，聚集在細胞質部分的核連接部位。

錯誤折疊和聚積傾向的蛋白在細胞質內表達，就會發(fā)生核連接孔的聚集，細胞質蛋白穩(wěn)態(tài)的紊亂和核連接處的聚集可以誘導細胞質應激，與內質網(wǎng)應激截然相反，R6C突變前胰島素原導致誘導細胞質應激的主要伴侶HSP70的表達，結合錯誤折疊的蛋白質，防止其聚集并促進降解，更重要的是，錯誤折疊的蛋白質在細胞質核連接處聚集，與亨廷頓病、帕金森病、阿爾茨海默病、朊病毒病等不同神經(jīng)變性疾病的發(fā)生、發(fā)展有關。R6C突變前胰島素原導致β細胞死亡增加，促進前胰島素原無效轉位引發(fā)遲發(fā)型糖尿病。因此，不像其他常染色體顯性胰島素基因突變引起的分泌通路的缺陷，R6C/H引起的前胰島素原細胞質的聚集似乎可以通過一個全新的機制導致β細胞功能衰竭和糖尿病。

L13R突變前胰島素原引起的細胞缺陷還沒有被實驗證實，與引起遲發(fā)型糖尿病的R6C/H突變不同，L13R突變引起宮內發(fā)育遲緩，并在出生后第2天即引發(fā)嚴重的胰島素缺乏型糖尿病。雖然推測L13R突變也可以影響前胰島素原的轉位，但還有其他機制參與β細胞功能衰竭和糖尿病發(fā)病。與R6C突變類似，阻斷依賴SRP蛋白的轉位，可誘導熱休克反應，抑制細胞生長，促進細胞死亡。既然L13R突變可以影響依賴SRP的轉位，L13R突變是否可導致β細胞生長停止。研究證實，同樣阻斷信號肽疏水核心的突變——前甲狀旁腺激素原preProPTH-C18R可以導致甲狀旁腺功能減退，由于突變的信號肽被SRP識別不佳而導致轉位缺陷，大部分定位于內質網(wǎng)，誘導ERS，促進細胞死亡，以此類推，前胰島素原L13R突變可能也通過ERS引起β細胞功能衰竭和糖尿病，但還需要進一步研究。

5 防止胰島素生物合成早期步驟缺陷引起糖尿病的方法和策略

一半以上胰島素基因突變(30/51)可以引起內質網(wǎng)中胰島素原的錯誤折疊和MIDY。在過去10余年里，有關錯誤折疊的胰島素原導致β細胞功能衰竭的分子機制研究取得了很大的進展，為研發(fā)防止或延緩糖尿病發(fā)病的策略奠定了基礎。如上所述，雖然ERS和β細胞死亡是MIDY的標志，但更早期的事件(例如在β細胞數(shù)量大量減少之前)包括錯誤折疊的突變胰島素原對野生型胰島素原的阻斷所導致的胰島素產量的減少，可能更易于誘發(fā)胰島素的缺乏。假定僅存一個正常的胰島素等位基因就足以產生足夠的胰島素維持血糖正常，那么營救野生型胰島素原不被阻斷，就可能恢復足夠的胰島素產量，以延緩/防止胰島素缺乏型糖尿病的發(fā)生。

兩個特殊的方法可用于營救野生型胰島素原不被突變胰島素原所阻斷，首先突變胰島素原的顯性負效應是劑量依賴的，如果能靶向降解突變胰島素原，就可以使野生型胰島素原轉運出內質網(wǎng)。雖然泛素蛋白酶系統(tǒng)和自噬在Akita鼠的胰島素原降解中起重要作用，但調節(jié)錯誤折疊胰島素原降解的關鍵細胞內分子仍然未知。識別這些分子可能為調節(jié)錯誤折疊突變胰島素原降解提供潛在的靶點，以營救野生型胰島素原。

其次，設法改善野生型胰島素原的在內質網(wǎng)中的氧化折疊，因為突變和野生型胰島素原間異常的分子間二硫鍵利于突變胰島素原的顯性負效應，加速野生型胰島素原氧化折疊的方法可以促進其折疊，限制其與共表達的突變胰島素原相互作用，允許其在因突變儲留之前逃離內質網(wǎng)，蛋白質二硫化異構酶(PDI)和內質網(wǎng)oxidoreductin-1(ERO1)在維持氧化環(huán)境促進二硫鍵配對中起重要作用。近來研究顯示，ERO1的過度表達能改善野生型胰島素原的氧化折疊，即使它與導致MIDY的基因突變共表達，也可使野生型胰島素原從內質網(wǎng)中輸出顯著增加，并伴隨著胰島素產量的增加。

ERO1引起的內質網(wǎng)過度氧化可以導致ERS。然而研究顯示，在表達突變胰島素原的細胞中，盡管過度表達野生型或激活ERO1可增加內質網(wǎng)腔的氧化，但并不增加突變胰島素原誘導的ERS，甚至似乎還導致突變胰島素原誘導的ERS的顯著減少。原因可能源自胰島素原氧化折疊的改善和從內質網(wǎng)中輸出量的增加，但是增加內質網(wǎng)腔氧化對β細胞功能的長期效應仍然需要進一步體內實驗評估。

另外，PDI的過度表達并不能改善胰島素原的氧化折疊或者增加胰島素的產量。因為PDI不能調節(jié)胰島素原的營救，所以在胰島素原二硫鍵的形成過程中，PDI可能并不起作用。

6 結論

新的胰島素基因突變的發(fā)現(xiàn)重新激發(fā)了人們對胰島素在β細胞生物合成過程的興趣，這些突變?yōu)樘綄ぬ悄虿“l(fā)生、發(fā)展中分子和細胞缺陷提供了獨特的工具。雖然還有許多問題懸而未決，但已經(jīng)開始深入理解胰島素生物合成早期事件缺陷導致的β細胞衰竭和糖尿病的分子機制，包括前胰島素原的定位、通過內質網(wǎng)膜的轉位、胰島素原信號肽的剪切和新生胰島素原分子在內質網(wǎng)中的折疊(圖3)，仍然需要進一步研究胰島素原在β細胞內質網(wǎng)中的折疊途徑，因為研究表明錯誤折疊的胰島素原可能把它的錯誤折疊傳播給旁觀的野生型胰島素原分子。包括錯誤折疊和旁觀的野生型胰島素原的化學計量法、內質網(wǎng)腔的氧化還原環(huán)境以及β細胞中ERAD結構的活性等都是治療MIDY的新方法。與此同時，胰島素原的錯誤折疊可能發(fā)生在沒有任何突變的病理條件下，MIDY可能是2型糖尿病發(fā)生ERS的極端案例，可以為研究2型糖尿病ERS提供有力的工具，所有這些聯(lián)系有待進一步探索。

圖3 胰島素生物合成早期事件缺陷引發(fā)糖尿病和β細胞功能衰歇的模式圖

(本文譯自：INS-gene mutations:From genetics and beta cell biology to clinical disease. Mol Aspects Med, 2015,42:3-18.DOI:10.1016/j.mam.2014.12.001. 已取得期刊及原作者的授權)

國家自然科學基金資助項目(81370895，81570699)；天津市科委應用基礎與前沿技術研究重點項目(11JCZDJC185000)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.02.013

300052 天津醫(yī)科大學總醫(yī)院內分泌代謝科

劉銘，Email:ming165@hotmail.com

2015-09-28)