陳國寶，鄭艷萍，嚴(yán)國俊，宋桂萍，柳　佳，蔡　廷（.江陰市中醫(yī)院，江蘇江陰　4400；.南京海昌中藥集團(tuán)有限公司，南京　006；.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京　009；4.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京0009）

HPLC法同時(shí)測(cè)定小兒感冒顆粒中4種成分的含量Δ

陳國寶1＊，鄭艷萍2，嚴(yán)國俊3，宋桂萍1，柳佳1，蔡廷4#（1.江陰市中醫(yī)院，江蘇江陰214400；2.南京海昌中藥集團(tuán)有限公司，南京210061；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京210029；4.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京210009）

目的：建立同時(shí)測(cè)定小兒感冒顆粒中（R，S）-告依春、綠原酸、木犀草苷和異綠原酸A含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Hedera C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254、330、370 nm，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為5 μl。結(jié)果：（R，S）-告依春、綠原酸、木犀草苷和異綠原酸A的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為6.6～105 μg/ml（r= 0.999 9）、9～140 μg/ml（r=0.999 9）、9～144 μg/ml（r=0.999 8）、9～138 μg/ml（r=0.999 6）；定量限分別為330、450、450、450 ng，檢測(cè)限分別為66、90、90、90 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜3%；加樣回收率分別為95.01%～98.77%（RSD=1.48%，n=6）、95.14%～98.91%（RSD=1.52%，n=6）、95.11%～97.54%（RSD=0.93%，n=6）、95.58%～99.63%（RSD=1.73%，n= 6）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于測(cè)定小兒感冒顆粒中（R，S）-告依春、綠原酸、木犀草苷和異綠原酸A的含量。

小兒感冒顆粒；（R，S）-告依春；綠原酸；木犀草苷；異綠原酸A；高效液相色譜法

小兒感冒顆粒收載于2015年版《中國藥典》（一部）中，由廣藿香、菊花、板藍(lán)根、大青葉、石膏等10味藥物組成［1］，具有疏風(fēng)解毒、清熱解毒之功效，可用于治療小兒風(fēng)熱感冒，發(fā)熱重、頭脹痛，咳嗽痰黏、咽喉腫痛，流感等。木犀草苷、綠原酸和異綠原酸A是菊花中的指標(biāo)性成分，具有散風(fēng)清熱、平肝明目、清熱解毒等藥理作用，可用于風(fēng)熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花、瘡癰腫毒等證，有明顯的抗炎、解熱及肉毒素中和作用［2-3］。（R，S）-告依春是板藍(lán)根抗病毒的有效成分之一，是衡量板藍(lán)根質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，同時(shí)也是反映感冒顆粒質(zhì)量的重要指標(biāo)，具有清熱解毒、涼血利咽等藥理作用，可用于溫疫時(shí)毒、發(fā)熱咽痛、溫毒發(fā)斑、痄腮、爛喉丹痧、大頭瘟疫、丹毒、癰腫［4-5］。目前，小兒感冒顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中載有用薄層色譜法來鑒定大青葉和板藍(lán)根中均含有的靛玉藍(lán)，卻并沒有控制板藍(lán)根質(zhì)量的專屬標(biāo)準(zhǔn)［6-8］。因此，本課題組采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定小兒感冒顆粒中的木犀草苷、綠原酸、異綠原酸A以及（R，S）-告依春的含量，以期為該藥的質(zhì)量控制提供參考。

1　材料

1.1儀器

LC-20AB型HPLC儀，包括二極管陣列檢測(cè)器（日本Shimadzu公司）；FA1104型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：350 W，頻率：40 kHz）；TGL-16C型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2藥品與試劑

小兒感冒顆粒（江陰市中醫(yī)院，編號(hào)：S1、S2、S3，規(guī)格：6 g/袋）；（R，S）-告依春對(duì)照品（批號(hào)：111753-201103，純度：100.0%）、異綠原酸A對(duì)照品（批號(hào)：111782-200801，純度≥98%）、綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-200413，純度：96.2%）和木犀草苷對(duì)照品（批號(hào)：111720-200905，純度：96.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為去離子水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Hedera C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254、330、370 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5 μl。

表1　梯度洗脫程序Tab 1　Conditions of gradient elution

2.2溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液分別精密稱?。≧，S）-告依春、綠原酸、木犀草苷和異綠原酸A對(duì)照品21.00、7.19、7.46、14.29 mg，分別置于10 ml量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得（R，S）-告依春、綠原酸、木犀草苷和異綠原酸A的質(zhì)量濃度分別為2.100、0.692、0.720、1.400 mg/ml的單一對(duì)照品溶液。分別取上述單一對(duì)照品溶液各0.5、1、1、0.5 ml，置于同一5 ml量瓶中，加甲醇定容，即得。

2.2.2供試品溶液精密稱取樣品5 g，置于50 ml具塞三角瓶中，加甲醇10 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，置于1.5 ml離心管中，以半徑為0.5 cm、12 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得［7］。

2.2.3陰性對(duì)照溶液按樣品的制備工藝和配方比例，制備不含菊花和板藍(lán)根的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3系統(tǒng)適用性和專屬性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以（R，S）-告依春、綠原酸、木犀草苷和異綠原酸A峰計(jì)算均＞5 000；保留時(shí)間分別為13.90、21.15、47.31、53.59 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無干擾。

2.4線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，精密量取4、2、1、0.5、0.25、0.125 ml，分別置于8 ml量瓶中，用甲醇定容，得系列線性溶液。分別取上述系列線性溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍詳見表2。

2.5定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限（LOQ）；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限（LOD），結(jié)果詳見表3。

2.6精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定3 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果，（R，S）告依春、綠原酸、木犀草苷和異綠原酸A峰面積的日內(nèi)精密度的RSD分別為0.96%、0.92%、0.60%、0.43%（n=6），日間精密度的RSD分別為0.85%、0.86%、0.45%、0.34%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，（R，S）告依春、綠原酸、木犀草苷和異綠原酸A峰面積的RSD分別為2.11%、1.77%、0.85%、1.52%（n=5），表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

圖1　高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品（254 nm）；B.混合對(duì)照品（330 nm）；C.混合對(duì)照品（370 nm）；D.供試品（254 nm）；E.供試品（330 nm）；F.供試品（370 nm）；G.陰性對(duì)照（254 nm）；H.陰性對(duì)照（330 nm）；I.陰性對(duì)照（370 nm）；1（.R，S）-告依春；2.綠原酸；3.木犀草苷；4.異綠原酸AFig 1　HPLC chromatogramsA.mixed reference substance（254 nm）；B.mixed reference substance（330 nm）；C.mixed reference substance（370 nm）；D.test sample（254 nm）；E.test sample（330 nm）；F.test sample（370 nm）；G.negative control（254 nm）；H.negative control（330 nm）；I.negative control（370 nm）；1.R，S-goitrin；2.chlorogenic acid；3.luteoloside；4.isochlorogenic acidA

表2　回歸方程與線性范圍Tab 2　Regression equations and linear ranges

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（編號(hào)：S1）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果詳見表4。由表4可知，本方法重復(fù)性良好。

表3　定量限與檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果（ng）Tab 3　Determination results of quantitation limit and detection limit（ng）

表4　重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab 4　Results of reproducibility tests（n=6）

2.9加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取樣品（編號(hào)：S1）5 g，置于50 ml具塞三角瓶，再精密加入一定量（R，S）-依春綠原酸、木犀草苷和異綠原酸A對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果詳見表5。

表5　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab 5　Result of recovery tests（n=6）

2.10樣品含量測(cè)定

取3個(gè)編號(hào)樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各成分含量，結(jié)果詳見表6。

3　討論

本試驗(yàn)參考了相關(guān)文獻(xiàn)中（R，S）-告依春、綠原酸和異綠原酸A、木犀草苷含量測(cè)定時(shí)的檢測(cè)波長(zhǎng)［9-12］，同時(shí)采用190～800 nm全波長(zhǎng)進(jìn)行掃面驗(yàn)證。結(jié)果，在200～265 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)（R，S）-告依春具有紫外吸收，木犀草苷、綠原酸和異綠原酸A分離度不好；在330 nm波長(zhǎng)處綠原酸和異綠原酸A有很好的分離，但是（R，S）-告依春卻沒有吸收峰；在370 nm波長(zhǎng)處木犀草苷的分離效果最好，而（R，S）-告依春、綠原酸、異綠原酸A吸收峰卻很低。為得到更好的各成分峰，綜合考慮，本試驗(yàn)中（R，S）-告依春、綠原酸和異綠原酸A、木犀草苷的檢測(cè)波長(zhǎng)分別選用254、330、330、370 nm。

表6　樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3，μg/g）Tab 6　Results of content determination of samples（n=3，μg/g）

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于測(cè)定小兒感冒顆粒中（R，S）-告依春、綠原酸、木犀草苷和異綠原酸A的含量［13-14］。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部［S］.2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：560.

［2］李其固，李振化，趙振宇，等.HPLC法測(cè)定抗病毒栓中的鳥苷，（R，S）告依春，百秋里和廣藿香酮［J］.中成藥，2014，36（6）：1 208.

［3］茅純，鄭娟，鄒耀華.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定桑菊感冒片中綠原酸、木犀草苷和3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷浚跩］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014，32（1）：193.

［4］安益強(qiáng).HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地板藍(lán)根中表告依春［J］.中草藥，2008，39（11）：1 739.

［5］王瑞，楊海英，楊琪偉，等.板藍(lán)根質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中草藥，2010，41（3）：478.

［6］姚文冰.HPLC法同時(shí)測(cè)定痰熱清注射液中木犀草苷和黃芩苷的含量［J］.中國藥房，2011，22（35）：3 311.

［7］孫汝明，李翔，曹紅，等.感冒清熱顆粒HPLC特征圖譜研究［J］.藥物分析雜志，2013，33（2）：335.

［8］李丹，閆靜.HPLC法測(cè)定感冒退熱顆粒中表告依春和連翹苷［J］.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，30（2）：164.

［9］韓桂茹，張淑萍，安麗娜，等.HPLC法測(cè)定金銀花及小兒咽扁顆粒中4種綠原酸［J］.中成藥，2013，35（3）：517.

［10］李向陽，屠萬青.HPLC法測(cè)定同時(shí)測(cè)定雙金連合劑中的11種成分含量［J］.藥物分析雜志，2015，35（3）：222.

［11］呂海鴻，王雪芹，劉乃強(qiáng)，等.HPLC-MS法測(cè)定雙黃連口服液中木犀草苷和綠原酸的含量并評(píng)價(jià)二者對(duì)成品質(zhì)量的影響［J］.中國藥房，2011，22（44）：4 204.

［12］寧科賢，黃燕萍.HPLC法同時(shí)測(cè)定雙黃連顆粒中綠原酸、木犀草苷、連翹苷和黃芩苷的含量［J］.中國藥房，2014，25（40）：3 819.

［13］范磊.小兒感冒顆粒的質(zhì)量控制方法研究［J］.中國醫(yī)藥指南，2013，35（11）：355.

［14］朱粉霞，張亞麗，汪晶，等.一測(cè)多評(píng)法測(cè)定金銀花復(fù)方制劑中新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸［J］.中成藥，2013，35（12）：2 666.

（編輯：劉柳）

Simultaneous Determination of 4Components in Xiaoer Ganmao Granule by HPLC

CHEN Guobao1，ZHENG Yanping2，YAN Guojun3，SONG Guiping1，LIU Jia1，CAI Ting4（1.Jiangyin TCM Hospital，Jiangsu Jiangyin 214400，China；2.Nanjing Haichang Chinese Medicine Group Co.，Ltd.，Nanjing 210061，China；3.School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210029，China；4.School of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of（R，S）-goitrin，chlorogenic acid，luteoloside and isochlorogenic acid A in Xiaoer ganmao granule.METHODS：HPLC was performed on the column of Hedera C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%formic acid aqueous at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 254 nm，330 nm and 370 nm，column temperature was 40℃，and the injection volume was 5 μl，RESULTS：The linear range was 6.6-105 μg/ml for（R，S）-goitrin（r=0.999 9），9-140 μg/ml for chlorogenic acid（r=0.999 9），9-144 μg/ml for luteoloside（r=0.999 8）and 9-138 μg/ml for isochlorogenic acid A（r=0.999 6）；the limits of quantitation were 330 ng，450 ng，450 ng and 450 ng，limits of detection were 66 ng，90 ng，90 ng and 90 ng，respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 3%；recoveries were 95.01%-98.77%（RSD=1.48%，n=6），95.14%-98.91%（RSD=1.52%，n=6），95.11%-97.54%（RSD= 0.93%，n=6）and 95.58%-99.63%（RSD=1.73%，n=6）.CONCLUSIONS：The method is simple and accurate，and suitable for the simultaneous determination of（R，S）-goitrin，chlorogenic acid，luteoloside and isochlorogenic acid A in Xiaoer ganmao granule. KEYWORDSXiaoer ganmao granules；（R，S）-goitrin；Chlorogenic acid；Luteoloside；Isochlorogenic acid A；HPLC

R917

A

1001-0408（2016）27-3836-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.27.30

江蘇省自然科學(xué)基金-青年基金項(xiàng)目（No.BK2012089）

＊副教授，碩士。研究方向：中藥制劑。E-mail：cgbjy@sina.com

教授，博士。研究方向：藥物制劑。電話：025-83271123。E-mail：tcai@cpu.edu.cn

（2015-10-03

2016-07-03）