劉龍海，李新圃，楊 峰，羅金印，張 哲，2，李宏勝

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070）

釀酒酵母菌生長特性的研究

劉龍海1，李新圃1，楊 峰1，羅金印1，張 哲1，2，李宏勝1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070）

為探究溫度和pH值對釀酒酵母菌生長特性的影響，采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，檢測了不同溫度、不同初始pH值對釀酒酵母菌生長的影響。結(jié)果表明，培養(yǎng)基pH值和溫度對釀酒酵母菌的生長具有明顯的影響，當(dāng)pH值為3.0或者8.0，溫度為20℃或高于40℃時，釀酒酵母菌的生長明顯受到抑制；釀酒酵母菌在培養(yǎng)基初始pH值為4.0～6.0，溫度在25～30℃時生長良好。

釀酒酵母；溫度；pH值；生長特性

釀酒酵母菌是一種與人們?nèi)粘Ｉ铌P(guān)系最為密切的酵母菌。釀酒酵母菌不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、核酸、維生素、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，而且部分酵母菌的培養(yǎng)液具有殺菌或抑菌作用［1-3］。研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛飼料中添加活性釀酒酵母菌可以改善奶牛食欲、促進(jìn)瘤胃蠕動、增強(qiáng)纖維消化能力、平衡瘤胃酸堿度、防止瘤胃酸中毒和提高奶產(chǎn)量和乳脂含量［4-8］。根據(jù)最新農(nóng)業(yè)部2013年公布的飼料添加劑品種目錄，釀酒酵母菌可直接作為飼料的活性添加劑，而釀酒酵母培養(yǎng)物、釀酒酵母提取物、釀酒酵母細(xì)胞壁等列入飼料原料品類，這表明釀酒酵母類產(chǎn)品在飼料產(chǎn)業(yè)中的比例將越來越大。

為提高釀酒酵母菌發(fā)酵的產(chǎn)量和效率，研究人員對釀酒酵母菌的生長特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度、pH值、水分含量、氧化應(yīng)激、滲透壓、產(chǎn)物濃度等因素能影響釀酒酵母菌的生長特性［9-11］。其中，培養(yǎng)基的pH值與培養(yǎng)溫度是影響釀酒酵母生長最重要的因素之一，它們可通過影響釀酒酵母菌內(nèi)的生化反應(yīng)進(jìn)而影響釀酒酵母菌的生長。

在前期實(shí)驗(yàn)中，從奶牛飼草飼料中分離出一株有抑菌活性的釀酒酵母菌，為了在臨床上使用，本實(shí)驗(yàn)采用單因素設(shè)計(jì)，進(jìn)行了培養(yǎng)溫度和pH值對此酵母菌生長特性的影響，旨在為該釀酒酵母菌產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 釀酒酵母菌菌株Y11，分離自甘肅省某奶牛場采集的飼草飼料樣本，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所奶牛乳房炎課題組分離、鑒定和保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 YEPD培養(yǎng)基購自北京吉美生物技術(shù)有限公司；瓊脂粉購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 菌種的活化

將凍存的釀酒酵母菌菌株接種至裝有30 mL YEPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置28℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱，120 r/min培養(yǎng)48 h。鏡檢純粹后接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基，置恒溫培養(yǎng)箱，28℃培養(yǎng)48 h，取出后4℃冰箱中保存。實(shí)驗(yàn)前，挑取單菌落接種至2 mLYEPD液體培養(yǎng)基的試管中，置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.3 釀酒酵母菌活菌計(jì)數(shù)

本實(shí)驗(yàn)釀酒酵母菌計(jì)數(shù)方法采用稀釋平板計(jì)數(shù)法。對培養(yǎng)的釀酒酵母菌菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，取3個合適稀釋濃度的菌液各100 μL，分別涂布至YEPD固體培養(yǎng)基，置恒溫培養(yǎng)箱中，28℃培養(yǎng)48 h，每個稀釋度做3個平行試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出平板，觀察菌落生長情況，選取菌落數(shù)目在30～300之間的平板進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，計(jì)算得出釀酒酵母菌的活菌數(shù)量，記錄數(shù)據(jù)并取平均值。

1.4 釀酒酵母菌液濃度測定

本實(shí)驗(yàn)通過測定酵母菌培養(yǎng)液的OD值來估算釀酒酵母菌的濃度。對培養(yǎng)的酵母菌菌液進(jìn)行5倍、10倍、15倍、20倍稀釋，取合適濃度釀酒酵母菌菌液加入比色管，以無菌YEPD液體培養(yǎng)基作空白對照，用分光光計(jì)在450 nm波長進(jìn)行OD值測定，3次測定取平均值。

1.5 釀酒酵母菌的生長特性研究

1.5.1 不同pH值的培養(yǎng)基對釀酒酵母菌生長特性的影響 將配制好的YEPD液體培養(yǎng)基，分裝于9個150 mL三角瓶，每瓶50 mL，112℃、20 min高壓滅菌，放涼后用無菌1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)整每瓶培養(yǎng)基pH值分別為3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和8.0。

將活化的釀酒酵母發(fā)酵液以1%的接種量分別接種到不同pH值的YEPD液體培養(yǎng)基中，置28℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱，120 r/min培養(yǎng)。分別于12、20、24和36 h取樣，進(jìn)行1∶20倍稀釋后，用分光光計(jì)在450 nm波長進(jìn)行OD值測定，同時取發(fā)酵液進(jìn)行pH值測定及平板活酵母菌計(jì)數(shù)。

1.5.2 不同溫度對釀酒酵母菌生長特性的影響 按1%的接種量將活化菌液分別接種到Y(jié)EPD液體培養(yǎng)基中，置恒溫振蕩培養(yǎng)箱，120r/min，分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并于24 h、36 h、48 h取樣進(jìn)行1∶5倍稀釋后在波長450 nm處測定OD值，同時取樣進(jìn)行平板活酵母菌計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH值對釀酒酵母菌生長的影響

2.1.1 釀酒酵母菌生長過程中培養(yǎng)基pH值的變化 從圖1可以看出，釀酒酵母菌在不同pH值的培養(yǎng)基中生長時，隨培養(yǎng)時間的增加，其培養(yǎng)液中的pH值逐漸降低，一般在培養(yǎng)20～24 h時培養(yǎng)基pH值下降到最低，在36 h時培養(yǎng)基pH值又有所上升。培養(yǎng)基初始pH值越高，釀酒酵母菌培養(yǎng)液中pH值下降的速度越快，當(dāng)下降至2.0～4.0時，培養(yǎng)液中的pH值趨于穩(wěn)定。詳見圖1。

2.1.2 培養(yǎng)基初始pH值對釀酒酵母菌生長的影響 從圖2可以看出，釀酒酵母菌培養(yǎng)基的初始pH值過低或過高均對酵母菌的生長有明顯影響。當(dāng)pH值為3.0或者8.0時，釀酒酵母菌的生長明顯受到抑制；當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值在4.0～6.0之間時，釀酒酵母生長情況較好，其中pH值為4.0時最適合該酵母菌生長。詳見圖2。

圖2 不同pH值的培養(yǎng)基對酵母菌生長的影響

2.2 不同溫度對釀酒酵母菌生長的影響

從圖3和圖4可以看出，溫度對釀酒酵母菌的生長有非常大的影響。釀酒酵母菌在30℃培養(yǎng)時生長最為迅速，對數(shù)生長期提前，36 h達(dá)到生長高峰期。而溫度過低（20℃）會造成酵母菌生長緩慢，生長高峰期延后。溫度過高（超過40℃）亦會抑制酵母菌生長，造成酵母菌生長緩慢及死亡。

綜合來看，該釀酒酵母菌的最佳生長溫度為25～30℃，其中以30℃為最佳。通過OD值檢測和活菌數(shù)量檢測發(fā)現(xiàn)，兩種檢測方法存在差異，在低溫時趨勢基本一致，而溫度超過40℃則會使酵母菌活菌數(shù)量減少，而OD值還可緩慢增加。

圖3 溫度對釀酒酵母菌生長的影響（活菌計(jì)數(shù)）

圖4 溫度對釀酒酵母菌生長的影響（OD值）

3 討論

Woo等［11］研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母的生長速率明顯受到環(huán)境變化的影響，其中溫度和pH值是主要的兩個方面。溫度是一種幾乎可以影響細(xì)胞內(nèi)所有生物化學(xué)進(jìn)程的因素［12］。高溫可使一些蛋白、DNA、RNA變性，并且會影響細(xì)胞生物膜的結(jié)構(gòu)和功能［11］，而低溫會抑制細(xì)胞內(nèi)參加代謝反應(yīng)酶的活性，從而影響釀酒酵母的生長。釀酒酵母最適生長溫度為28～30℃，培養(yǎng)溫度若高于45℃，釀酒酵母會對溫度非常敏感；培養(yǎng)溫度若在50℃持續(xù)5 min，釀酒酵母菌株99%會死亡［13］。本研究結(jié)果表明，該釀酒酵母的最適生長溫度為25～30℃，若溫度高于40℃，就會大量死亡，此結(jié)果與Molon M等［13］的研究結(jié)果基本一致。Jong等［14］研究了溫度對從獼猴桃中分離的釀酒酵母菌生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最佳發(fā)酵溫度為35℃。此結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果略有差異，產(chǎn)生此結(jié)果的原因在于其評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為乙醇產(chǎn)量而不是釀酒酵母的活菌數(shù)量。這與Ji等［11］的研究，隨著溫度高于38℃，釀酒酵母的生長速率會降低，而乙醇的生成量會緩慢升高的結(jié)果基本一致。

研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)釀酒酵母能在pH值為2.5～8.0的培養(yǎng)基中生長，由于釀酒酵母有嗜酸性，根據(jù)培養(yǎng)溫度、氧化應(yīng)激、培養(yǎng)基和菌株的不同，最佳生長pH值約在4～6之間［15-16］。培養(yǎng)基初始pH值過高或過低均會影響酵母菌的生長。Liu等［17］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值低于3時，酵母菌的停滯期會延長，最大OD值會降低；當(dāng)pH值在2.5時，酵母菌生長完全被抑制；Antonio等［18］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值為8時酵母菌生長速度顯著降低，pH值為9時生長完全停止。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此酵母菌最適的pH值范圍為4.0～6.5，以pH值為4.0時最適合該酵母菌生長；初始培養(yǎng)基pH值為3.0時，可明顯看出該酵母生長緩慢，最大OD值明顯低于其他組。該結(jié)果與上述Narendranath等［16］、Liu等［17］、Antonio等［18］的研究結(jié)果基本一致。

溫度和pH值還可通過影響發(fā)酵副產(chǎn)物進(jìn)而影響釀酒酵母菌的生長。乙酸是釀酒酵母發(fā)酵過程產(chǎn)生的主要酸性物質(zhì)，它可以作為誘導(dǎo)物引發(fā)細(xì)胞的程序化死亡［19］，而高溫可增加釀酒酵母菌發(fā)酵液中的乙酸含量［11］。因此，高溫和低pH值是影響釀酒酵母生長的原因之一。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激、培養(yǎng)基組成、滲透壓等因素均會影響釀酒酵母的生長［4-6］，這些因素對本實(shí)驗(yàn)的釀酒酵母菌是否有影響有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

4 結(jié)論

培養(yǎng)基初始pH值和培養(yǎng)溫度均會影響此釀酒酵母菌的生長特性，研究表明，此釀酒酵母菌的最適生長溫度在25～30℃之間，最適pH值在4.0～6.0之間，超出此范圍，釀酒酵母菌的生長會受到抑制。

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Effects of Temperature and pH on the Growth of Saccharomyces cerevisiae

Liu Longhai，Li Xinpu，Li Hongsheng，et al
（KeyLaboratoryofNewAnimal DrugProject ofGansu Province，KeyLaboratoryofVeterinaryPharmaceutical Discovery，MinistryofAgriculture，Lanzhou Institute ofAnimal Husbandryand Pharmaceutical Sciences，Chinese AcademyofAgricultural Sciences，Lanzhou 730050，China）

To investigate the effects of temperature and pH on the growth of Saccharomyces cerevisiae，the influence of different temperature and pH were determined on Saccharomyces cerevisiae growth by single factor design.The results indicated that the temperature and pH of mediu would significantly affected the growth characteristics of Saccharomyces cerevisiae.The Saccharomyces cerevisiae growth would be inhibited when exceed the temperature（20-40℃）or the pH（3.0-8.0）.In this study，the optimum growth temperature of Saccharomyces cerevisiae is 25-30℃，the optimum growth pH is 4.0-6.0.This study laid a foundations for the application offermentation process.

Saccharomyces cerevisiae；temperature；pH；growth characteristics

S816.6

A

2095-3887（2016）03-0038-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.03.010

2016-01-21

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃（2012BAD12B03）；甘肅省科技支撐計(jì)劃（144NKCA240）；甘肅省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（GNCX－2013－59）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛疾病創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2004-LIHPS-03）

劉龍海（1990-），男，碩士，主要從事奶牛乳房炎疫苗研究。

李宏勝（1964-），男，研究員，博士，主要從事奶牛乳房炎免疫及預(yù)防研究。