羅梓垠， 陳海娥， 宋 冬， 項冰倩， 應(yīng) 磊， 王萬鐵

(溫州醫(yī)科大學缺血-再灌注損傷研究所， 浙江 溫州 325035)

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促紅細胞生成素通過JNK通路對再灌注損傷肺細胞凋亡的影響*

羅梓垠， 陳海娥， 宋 冬， 項冰倩， 應(yīng) 磊， 王萬鐵△

(溫州醫(yī)科大學缺血-再灌注損傷研究所， 浙江 溫州 325035)

目的：探討促紅細胞生成素(EPO)后處理是否通過抑制C-Jun氨基末端激酶(JNK)活化來減輕再灌注損傷肺細胞的凋亡。方法：雄性SD大鼠40只，隨機分成5組(n=8)：對照組(C組)、肺缺血/再灌注組(I/R組)、促紅細胞生成素干預(yù)組(EPO組)、促紅細胞生成素+溶劑對照組(P組)、促紅細胞生成素+SP600125組(SP組)。各組分別于再灌注2 h留取左肺組織，電鏡檢測超微結(jié)構(gòu)損傷；免疫組化法測定Bax、Bcl-2蛋白的表達。結(jié)果：與C組相比，I/R組肺組織超微結(jié)構(gòu)損傷明顯，Bcl-2蛋白表達、Bcl-2/Bax比值明顯降低，Bax蛋白表達明顯升高(P<0.01)；EPO組、P組、SP組與I/R組相比，組織損傷有所減輕，Bcl-2蛋白表達、Bcl-2/Bax比值明顯升高，Bax蛋白表達明顯降低(P<0.01)；SP組與EPO組相比，組織損傷明顯減輕，Bcl-2蛋白表達、Bcl-2/Bax比值明顯升高，Bax蛋白表達明顯降低(P<0.01)。結(jié)論：I/R通過激活JNK導(dǎo)致大鼠肺泡結(jié)構(gòu)嚴重破壞，肺內(nèi)細胞大量凋亡；EPO可通過抑制JNK的激活而減輕I/R損傷。

缺血/再灌注；促紅細胞生成素；細胞凋亡；C-Jun氨基末端激酶；SP600125；Bcl-2；Bax；大鼠

ischemia/reperfusion; erythropoietin; cell apoptosis; JNK; SP600125; Bcl-2; Bax；rats

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.024

促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種含唾液酸的酸性蛋白，對改善機體供氧狀況發(fā)揮重要的調(diào)控作用。近年來研究表明，EPO是一種低氧誘導(dǎo)造血因子，它主要表達在腎臟，可與機體各處的 EPO受體結(jié)合，發(fā)揮對心、腦、腎等 IR器官的保護作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，EPO具有多種保護作用，如促進紅細胞生成、抗氧化、抗炎、抗凋亡的作用。但是，EPO是否能對肺缺血/再灌注損傷(lung ischemia/reperfusion injury, LIRI)產(chǎn)生作用，目前尚未見詳細報道。SP600125是一種C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase，JNK)抑制劑，具有高選擇性和特異性，能有效阻斷JNK細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[2]，常用于JNK通路的研究。本實驗應(yīng)用EPO模擬后處理，意在探明在LIRI中EPO是否可以對其發(fā)揮保護效應(yīng)以及這種保護作用是否與JNK有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級40只雄性SD大鼠，體重200～250 g。由溫州醫(yī)科大學動物實驗中心提供(實驗動物使用許可證號：SCXK(浙)2010-0150)。將動物隨機分為5組(n=8)：對照組(C組)，缺血/再灌注組(I/R組)，促紅細胞生成素干預(yù)組(EPO組)，促紅細胞生成素+溶劑對照組(PPCES溶液)(P組)，促紅細胞生成素+SP600125組(SP組)。C組游離左肺門后不夾閉肺門，觀察2.5 h，即為假手術(shù)對照組。EPO組在大鼠造模前尾靜脈注射3 000 U/kg促紅細胞生成素[3]，其余操作同I/R組；P組是在大鼠造模前經(jīng)尾靜脈給予同體積的PPCES溶液，余同EPO組。SP組中，SP600125用藥劑量為10 mg/kg體重，將10 mg SP600125充分溶解于7.5 ml PPCES溶液(30%聚乙二醇，20%聚丙烯乙二醇，15%聚氧乙烯蓖麻油，55%乙醇，30%生理鹽水)中[4]，在造模前給藥，余同EPO組，實驗畢，處死大鼠，留取左肺組織。

1.2 動物模型的制備

根據(jù)已發(fā)表文獻復(fù)制大鼠原位左肺I/R模型[5]。大鼠稱重后，經(jīng)腹腔注射按8 ml/kg體重劑量的5%水合氯醛進行麻醉。頸部備皮后，用組織剪逐層分離組織，暴露氣管，進行氣管插管，連接小動物呼吸機進行機械通氣，設(shè)置呼吸機參數(shù)。消毒左側(cè)胸部皮膚，備皮，鈍性分離筋膜和肌肉，將第3、4根肋骨斷開，打開胸腔，充分暴露左肺于視野內(nèi)，用動脈夾夾閉左肺門30 min，此即為缺血期，繼之松開動脈夾，恢復(fù)左肺血流灌注2 h，此即為再灌注期。

1.3 各組肺組織電鏡檢測

實驗畢，處死動物，各組取左肺近肺門處組織，切成約1 mm×1 mm×1 mm大小的若干小塊，立即置于2.5%戊二醛前固定，再依次經(jīng)1%鋨酸后固定，1%醋酸鈾塊染，酒精梯度脫水，丙酮浸透，Epon 812包埋聚合，行半薄切片定位，超薄切片，經(jīng)醋酸鈾和硝酸鉛雙重染色后，在電鏡下觀察各組標本超微結(jié)構(gòu)的改變。

1.4 免疫組化法檢測各組標本中Bax、Bcl-2蛋白的表達水平及其定位

操作方法遵循試劑盒所提供的說明書，Bcl-2、Bax蛋白的陽性表達是標本上呈棕褐色的部分。采用美國IPP6.0(Image-pro plus)彩色圖像分析系統(tǒng)對Bcl-2、Bax蛋白陽性部位及背景的光密度值進行測定。陽性部位的吸光度(optical density, OD)值是陽性部位的光密度值減去背景的光密度值。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠實驗?zāi)Ｐ统晒β?/p>

共使用大鼠48只，依據(jù)樣本排除標準，其中有40只納入正式實驗，每組大鼠8只，故實驗?zāi)Ｐ蛷?fù)制成功率為83.3%。

2.2 電鏡下各組肺組織超微結(jié)構(gòu)的變化

C組各型細胞胞膜、胞內(nèi)細胞器完整，細胞核清晰可見，核染色質(zhì)分布均勻；I/R組各型細胞間連接疏松，胞內(nèi)染色質(zhì)邊集、細胞器水腫，偶可見核固縮、碎裂甚至溶解；EPO組和P組超微結(jié)構(gòu)損傷較I/R組有所減輕；SP組各型細胞結(jié)構(gòu)完整，胞核染色質(zhì)呈均勻分布(圖1)。

Fig. 1 Ultrastructure changes of type Ⅱalveolar epithelial cells in each group observed by electron microscopy(×10 000)

A： Control group; B： LIRI group; C： LIRI+EPO group; D： EPO+solution control group; E： EPO+SP600125 group; LIRI: Lung ischemia/reperfusion injury; EPO: Erythropoietin

A： Control group; B： LIRI group; C： LIRI+EPO group; D： EPO+solution control group; E： EPO+SP600125 group; LIRI: Lung ischemia/reperfusion injury; EPO: Erythropoietin

**P<0.01vsC;##P<0.01vsI/R;△△P<0.01vsEPO

2.3 各組肺組織 Bax、Bcl-2蛋白的表達水平的變化及定位

Bcl-2蛋白在C組、I/R組、EPO組、P組、SP組表達量分別為0.32±0.02、0.18±0.01、0.27±0.01、0.27±0.01、0.29±0.01。Bax蛋白在各組表達量分別為0.15±0.01、0.33±0.01、0.23±0.01、0.22±0.01、0.19±0.01。各組的Bcl-2/Bax分別為2.18±0.12、0.55±0.02、1.20±0.03、1.21±0.01、1.53±0.03。與C組比較，I/R組Bax表達上升明顯，Bcl-2表達明顯下降，Bcl-2和Bax的比值降低(P<0.01)；EPO組、P組、SP組Bax蛋白相比于I/R組表達減弱，Bcl-2表達上升，Bcl-2和Bax比值增高(P<0.01)，與EPO組比較，Bax表達明顯下降，SP組Bcl-2表達顯著上升，同時Bcl-2/Bax的比值升高(P<0.01，圖2)，Bax、Bcl-2蛋白陽性表達主要分布在：支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞的胞漿(圖3、圖4，圖3-4見彩圖頁Ⅵ)。

3 討論

促紅細胞生成素(EPO)是由成年期腎臟、胎兒期肝臟分泌的一種酸性糖蛋白類激素，體內(nèi)不能儲存EPO，在組織缺氧應(yīng)激下產(chǎn)生和分泌[6]。據(jù)研究報道EPO可以使促凋亡基因Bax、DP5的表達下降，抗凋亡基因Bcl-2的表達上升，從而抑制缺氧缺血性腦損傷引起的細胞凋亡[7]。本研究中電鏡下的超微結(jié)構(gòu)表明，LIRI時肺泡內(nèi)各型細胞、細胞器均發(fā)生明顯的損傷，EPO處理后這種損傷明顯減輕，說明EPO減輕了LIRI所致組織損傷和細胞凋亡。

JNK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPKs)家族的重要成員，介導(dǎo)體內(nèi)多種內(nèi)源性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細胞外各種刺激因素作用下可被激活，如：某些細胞因子、紫外線、DNA損傷因子等[8]。已有研究表明其參與了多種組織器官的I/R損傷。本實驗室前期實驗也已經(jīng)證明LIRI時JNK過度激活，抑制JNK激活后可改善I/R損傷[9]。SP600125為JNK的特異性抑制劑，可通過C-Jun氨基末端活性區(qū)特異磷酸化位點Ser63 和Ser73以抑制JNK的表達與激活，從而減輕LIRI所致的細胞凋亡和組織損傷[2，4]。本研究中，SP組為EPO聯(lián)合SP600125使用，從結(jié)果來看，SP600125增強了EPO對LIRI所致肺組織損傷和細胞凋亡的保護作用，換言之，EPO對LIRI的保護作用可能是通過抑制JNK的激活而產(chǎn)生的。

眾所周知，Bcl-2、Bax分別通過抗凋亡和促凋亡相互作用來參與細胞凋亡的調(diào)控[10]。Bcl-2被JNK磷酸化而降解，促使其與Bax解聚，Bax則誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑激活，從而使細胞凋亡[11]。本研究結(jié)果證實EPO可以使Bcl-2表達上升，Bax表達下降，從而減輕細胞凋亡，而應(yīng)用SP600125更是增強了這種作用。

綜上所述，EPO可通過抑制JNK的活化，減輕肺組織細胞的凋亡，從而對再灌注損傷肺發(fā)揮良好的保護效應(yīng)。

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