李虎 劉洪 王百忍 鞏固

(1成都軍區(qū)總醫(yī)院麻醉科，四川 成都 610083; 2川北醫(yī)學(xué)院麻醉科，四川 南充 637000; 3第四軍醫(yī)大學(xué)全軍神經(jīng)科學(xué)研究所，陜西 西安 710032)

·論著·

單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂對急性低壓氧腦水腫后MMP9表達的影響

李虎1,2劉洪1,2王百忍3鞏固1*

(1成都軍區(qū)總醫(yī)院麻醉科，四川 成都 610083;2川北醫(yī)學(xué)院麻醉科，四川 南充 637000;3第四軍醫(yī)大學(xué)全軍神經(jīng)科學(xué)研究所，陜西 西安 710032)

目的觀察單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)對急性低壓氧后基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)表達的影響，探討MMP9在GM1預(yù)防低壓氧腦水腫中可能的機制。方法24只雄性C57BL/6小鼠隨機分成4組(n=6)：分別為對照(control)組、急性低壓氧(HH)組、GM1治療(GM1+HH)組、單純給藥( GM1)組。control組：置于低壓氧艙外的常氧艙內(nèi)；HH組：置于6 000 m海拔模擬艙內(nèi)24 h；HH+GM1組：連續(xù)腹腔注射GM1 3 d(30 mg/kg)，最后一次給藥后30 min行急性低壓氧處理，方法同HH組；GM1組：前期GM1處理同HH+GM1組，后期同control組處理。小鼠在急性低壓氧處理24 h后應(yīng)用免疫熒光和Western blot檢測MMP9蛋白表達水平，通過濕重比和伊文思藍定量評價腦水腫程度。結(jié)果GM1降低急性低壓氧24 h后血腦屏障損傷，減少濕重比(Plt;0.05)和伊文思藍滲出量(Plt;0.05)，并抑制MMP9表達上調(diào)(Plt;0.05)，減弱星形膠質(zhì)細胞MMP9熒光強度。結(jié)論GM1抑制MMP9表達上調(diào)，可能參與其預(yù)防急性低壓氧腦水腫的機制中。

單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂; 基質(zhì)金屬蛋白酶9; 急性低壓氧

高原腦水腫(high altitude cerebral edema, HACE)是機體近期抵達高原后，在低壓氧環(huán)境下迅速出現(xiàn)的一種特殊的急性重癥高原病[1]。目前多數(shù)學(xué)者認為HACE主要是血管源性腦水腫,其發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與血腦屏障通透性迅速變化密切相關(guān)[2]。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一類能降解細胞外基質(zhì)成分的蛋白水解酶，MMP9是其中的主要成員。低氧應(yīng)急環(huán)境下，MMP9通過降解細胞外基質(zhì)引發(fā)血腦屏障通透性增加，在腦水腫發(fā)展過程中扮演著重要角色[3,4]。

外源性神經(jīng)節(jié)苷脂神作為臨床一線藥現(xiàn)廣泛應(yīng)用于神經(jīng)退行性病變、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中。可自由穿過血腦屏障(blood brain barrier, BBB)，整合于神經(jīng)細胞膜上，通過增強神經(jīng)營養(yǎng)因子作用，維持線粒體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、減少自由基、降低興奮性氨基酸毒性等作用參與神經(jīng)保護[5]。前期研究證實單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(monosialotetrahexosylganglioside, GM1)在多種神經(jīng)損傷模型中通過抑制MMP9表達，維持血腦屏障完整性性來減輕腦水腫[6]。但是GM1能否通過抑制MMP9上調(diào)，減輕低壓氧腦水腫還不清楚。

因此，本研究擬探討GM1預(yù)防用藥對急性低壓氧腦損傷后MMP9表達變化，從而探索MMP9在GM1預(yù)防低壓氧腦水腫中的潛在作用。

材料與方法

一、動物實驗

1.時間點選擇實驗：健康成年雄性C57BL/6小鼠24只，質(zhì)量22～25 g，第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。按隨機數(shù)字表法分為四組(n=6)，分別為對照組、低壓低頻6 h組、低壓低氧12 h組、低壓低氧24 h組，對照組置于低壓氧艙外常氧艙中，并于24 h后斷頭取腦。低壓低氧6 h組、低壓低氧12 h組、低壓低氧72 h組分別置于低壓氧艙中處理6 h、12 h、24 h后斷頭取腦后，通過Western blot檢測MMP9蛋白表達。實驗結(jié)果示低壓低氧24 h組MMP9表達量明顯增加(圖1)，故取此時間點進行下步實驗。

2.GM1預(yù)防急性低壓氧腦水腫效果評價：健康成年雄性C57BL/6小鼠24只，質(zhì)量22～25 g，第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，按隨機數(shù)字表法分為四組(n=6)，分別為對照組、急性低壓氧組、神經(jīng)節(jié)苷脂治療組、單純給藥組。通過伊文思藍定量和濕重比評價BBB通透性，通過Western blot和免疫熒光檢測MMP9表達。

二、急性低壓氧模型建立

C57BL/6小鼠置于密閉低壓氧艙(風(fēng)雷，中國)后以50 m/s上升速度在5 min內(nèi)達到模擬6 000 m海拔(350 mmHg，6%～7% O2)；低壓氧艙內(nèi)濕度維持在40%～50%，溫度控制在22～24℃；小鼠在低壓氧艙中自由飲水、攝食，光暗周期控制在24 h。

三、主要試劑

GM1(TRB公司, 阿根廷)兔抗小鼠MMP9(Abcam公司, 美國)，兔抗小鼠β-Tubulin(康為試劑, 中國)，山羊抗兔辣根過氧化物酶二抗(科昊生物, 中國)，山羊抗小鼠星形膠質(zhì)細胞抗體(glial fibrillary acidic protein, GFAP)(Santa公司, 美國)，兔抗山羊、小鼠抗兔熒光二抗(Millipore公司, 美國)，伊文思藍染料(恒遠, 中國)，BCA法蛋白濃度檢測試劑盒(碧云天, 中國)。

四、觀察指標和檢測方法

1.蛋白檢測：使用Western blot方法檢測腦組織MMP9蛋白含量。小鼠急性低壓氧24 h后4%水合氯醛麻醉后端頭取腦，腦組織稱重后置于裂解液中溶解30 min，4℃ 16 000 r/min離心5 min，提取上清后定量，加入蛋白上樣緩沖液95℃進行變性。相同蛋白量(30 μg/孔)加入10%聚丙烯酰氨凝膠電泳膠中電泳后轉(zhuǎn)膜，5%牛奶室溫封閉1 h后加入MMP9(1 ∶1 000)，β-Tubulin(1 ∶1 500)一抗，4℃搖床過夜。洗滌10 min×3次，然后加入山羊抗兔二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育2 h。再次洗滌10 min×3次，每條帶加入200 μl顯影液進行發(fā)光，Image J軟件灰度值測定，以β-Tubulin為內(nèi)參，計算MMP9條帶與其的灰度值比值。

2.免疫熒光檢測：急性低壓氧處理24 h后立刻深度麻醉，暴露心臟，自心尖部插入灌注針至升主動脈，剪開右心耳，快速推入20 ml生理鹽水，沖洗干凈血液后，換入100 ml含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)進行快速固定，然后慢滴250 ml上述相同液體，灌畢后立即斷頭取腦，標本放入含20%、30%蔗糖的PBS液內(nèi)梯度脫水，進行冰凍切片。自視交叉每隔5張切片取一張切片，厚度為10 μm，貼于明膠處理過的載玻片上。冰凍切片復(fù)溫并晾干，畫圈筆標記， 1% Triton X-100的PBS洗片，5 min×3次，甩干，每片加入20 μl MMP9及GFAP抗體的混合抗體，4℃孵育24 h后，PBS 5 min×3次，加入熒光二抗，室溫孵育2 h，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察(Olympus,日本)。

3.腦組織含水量檢測：采用脫頸椎法處死小鼠后，小心游離、取出整個大腦，去除小腦及腦干。用濾紙小心擦拭腦組織表面血跡后，在精密電子天平上迅速稱量并記錄組織塊濕重。然后在 70℃干燥箱中烘烤，72 h后稱量干重，達恒重后(兩次稱量干重誤差小于0.002 g)記錄組織塊干重。按Elliot公式計算腦組織含水百分比。 Elliot 公式：WC(%)=(濕重一干重)/濕重×100%。

4.伊文思藍(Evans blue, EB)含量的測定：小鼠在急性低壓氧處理24 h后立即用 腹腔注射4%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，經(jīng)尾靜脈注入 2% EB 生理鹽水溶液(4 ml/ kg)1 h 后，開胸通過左心室灌注生理鹽水 ,直到右心房流出無色液體為止，斷頭取腦。樣品稱重并置入1.5 ml 50 %三氯乙酸溶液中。勻漿和離心(10 000 r/min , 20 min)后取上清液,四倍稀釋于無水乙醇中。熒光值通過熒光分光光度計檢測。根據(jù)光密度數(shù)值,從標準曲線上算出腦組織中 EB 含量，根據(jù)公式計算出 EB 含量：腦組織 EB 含量(ng/g濕腦組織)=標準品 EB 含量(ng/ml)×50 %三氯乙酸量(ml)/腦濕重(g)。

五、 統(tǒng)計學(xué)分析

分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，對計量資料使用mean±SD進行表示，計數(shù)資料則使用中位數(shù)±四分位間距表示。使用單因素方差分析法，即one-way ANOVA進行差異性統(tǒng)計，使用Tukey檢驗進行組間檢驗、校正。所有數(shù)據(jù)比較，Plt;0.05認為有統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié) 果

一、急性低壓氧24 h后MMP9表達上調(diào)

急性低壓氧6 h即出現(xiàn)MMP9蛋白表達上調(diào)，至24 h表達明顯高于control組(Plt;0.05, 圖1)。

二、GM1抑制急性低壓氧后MMP9表達上調(diào)

提前給予GM1處理，可以有效抑制急性低壓氧后MMP9表達上調(diào)(Plt;0.05, 圖2)。

三、GM1減弱星形膠質(zhì)細胞MMP9免疫熒光強度

圖3為MMP9與星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP的雙標免疫熒光，紅色為MMP9，綠色為星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP，黃色為二者共表達。結(jié)果顯示，與對照組相比，GM1組MMP9免疫熒光強度無明顯改變，低壓低氧組MMP9免疫熒光增強，且MMP9/GFAP共表達增加；與低壓低氧組相比，GM1+低壓低氧組顯著降低MMP9熒光強度，減少MMP9與星形膠質(zhì)細胞標記物重疊。

圖1 對照組、低壓低氧6 h組、低壓低氧12 h組及低壓低氧24 h組MMP9蛋白表達
Fig 1 The protein expression of MMP9 in control group, HH 6 h group, HH 12 h group and HH 24 h group.

aPlt;0.05,vscontrol group.

圖2 對照組、低壓低氧組及GM1+低壓低氧組、GM1組MMP9蛋白表達
Fig 2 The protein expression of MMP9 in control, HH, GM1+HH and GM1 groups

aPlt;0.05,vscontrol group;bPlt;0.05,vsHH group.

圖3 GM1對急性低壓氧后星形膠質(zhì)細胞MMP9免疫熒光強度的影響
Fig 3 GM1 decreased the number of MMP9 positive glial cells
A: No change of the number of MMP9 positive glial cells in control group; B: GM1 without HH did not change the number of MMP9 positive glial cells; C: HH increased the number of MMP9 positive glial cells; D: GM1 decreased the number of MMP9 positive glial cells.

Bars=20 μ.

圖4 對照組、低壓低氧組及GM1+低壓低氧組、GM1組濕重比
Fig 4 The wet/dry in control , HH, GM1+HH and GM1 groups

aPlt;0.05,vscontrol group;bPlt;0.05,vsHH group.

圖5 對照組、低壓低氧組及GM1+低壓低氧組、GM1組MMP9蛋白表達
Fig 5 The Evans blue extravasation in control, HH , GM1+HH and GM1 groups.

aPlt;0.05,vscontrol group;bPlt;0.05,vsHH group.

四、GM1降低急性低壓氧BBB破壞，減輕腦水腫

血腦屏障的通透性主要通過濕重比(圖4)和伊文思藍定量(圖5)評價。濕重比結(jié)果顯示：與對照組相比，低壓低氧組濕重比明顯增加(Plt;0.05)；與低壓低氧組相比，GM1+低壓低氧組濕重比顯著降低(Plt;0.05)。伊文思藍定量顯示：與對照組相比，低壓低氧組伊文思藍大量滲出(Plt;0.05)；與低壓低氧組相比，GM1+低壓低氧組伊文思藍滲出明顯減少(Plt;0.05)。

討 論

本研究證實急性低壓低氧24 h后，MMP9表達上調(diào)，提前給予GM1腹腔注射可抑制MMP9表達上調(diào)，減輕急性低壓氧血腦屏障損破壞，減少伊文思藍滲出量和腦含水量。表明提前給予GM1抑制MMP9表達上調(diào)，可能參與其預(yù)防急性低壓氧后腦水腫的機制中。

HACE作為高原腦病的終末階段，主要表現(xiàn)為嚴重頭疼、嘔吐、共濟失調(diào)和進行性意識障礙。HACE可根據(jù)Lake Louise臨床診斷標準分為兩類：血管源性HACE是未經(jīng)AMS過程，而伴有相關(guān)精神癥狀和共濟失調(diào)；細胞毒性HACE是由急性高山病進一步發(fā)展而來，并伴有精神改變或者共濟失調(diào)[7]。HACE 具有起病急、進展速度快、病程變化復(fù)雜、并發(fā)癥多而重、治療不及時預(yù)后差、病死率高等臨床特點，已成為高原危重病中研究的熱點和難點[8]。最近研究報道急性低壓氧后神經(jīng)營養(yǎng)因子等明顯增加，給予一系列干預(yù)措施可通過上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達，可減輕急性低壓氧后腦損傷[9]。神經(jīng)節(jié)苷脂主要分布在神經(jīng)細胞膜上，在維持細胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和修復(fù)神經(jīng)細胞損傷中發(fā)揮著重要作用。外源性單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉可自由通過BBB，整合于神經(jīng)細胞膜上，并通過激活神經(jīng)營養(yǎng)因子下游保護通路，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[10,11]。前期研究表明，持續(xù)給予大劑量GM1可有效減輕神經(jīng)系統(tǒng)損傷后腦水腫[12]。本研究首次證實GM1通過保護BBB完整性有效預(yù)防急性低壓氧腦水腫。

BBB由腦毛細血管內(nèi)皮細胞及其間的緊密連接、基膜、周細胞與星形膠質(zhì)細胞的終足組成。其中內(nèi)皮細胞和緊密連接是維持血腦屏障功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。急性低壓氧環(huán)境下，一系列調(diào)節(jié)因子可影響內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和酶系統(tǒng)，從而改變了血腦屏障的通透性[13]。MMP9是MMPs家族中明膠酶的一種，目前研究發(fā)現(xiàn)MMP9參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展。近年來，研究認為MMP9與在早期腦水腫發(fā)生關(guān)系密切，但其具體機制目前尚不清楚。Guo等研究指出MMP9可能通過降解層粘連蛋白參與早期腦腦水腫[14]。Feiler等報道稱MMP9通過促進腦水腫形成，進而促進后早期腦損傷的發(fā)展[15]。本實驗結(jié)果顯示，急性低壓氧處理24 h后小鼠MMP9表達顯著增加，提前給予GM1有效抑制MMP9表達上調(diào)。這一結(jié)果證實了MMP9可能參與了GM1預(yù)防急性低壓氧腦水腫。

綜上所述，本研究證實提前給予GM1可通過抑制MMP9上調(diào)，減輕急性低壓氧腦水腫，表明下調(diào)MMP9可能是其腦保護的機制。

1Bailey DM, Bartsch P, Knauth M, et al. Emerging concepts in acute mountain sickness andhigh-altitude cerebral edema: from the molecular to the morphological [J]. Cell Mol Life Sci, 2009, 66(22): 3583-3594.

2Baneke A. What role does the blood brain barrier play in acute mountain sickness? [J]. Travel Med Infect Dis, 2010, 8(4): 257-262.

3Tang X, Zhong W, Tu Q, et al. NADPH oxidase mediates the expression of MMP-9 in cerebral tissue after ischemia-reperfusion damage [J]. Neurol Res, 2014, 36(2): 118-125.

4Wang Y, Jia J, Ao G, et al. Hydrogen sulfide protects blood-brain barrier integrity following cerebral ischemia [J]. J Neurochem, 2014, 129(5): 827-838.

5Cuello AC. Gangliosides, NGF, brain aging and disease: a mini-review with personal reflections [J]. Neurochem Res, 2012, 37(6): 1256-1260.

6Zhang Q, Furukawa K, Chen HH, et al. Metastatic potential of mouse Lewis lung cancer cells is regulated via ganglioside GM1 by modulating the matrix metalloprotease-9 localization in lipid rafts [J]. J Biol Chem, 2006, 281(26): 18145-18155.

7Zafren K. Prevention of high altitude illness [J]. Travel Med Infect Dis, 2014, 12(1): 29-39.

8Wilson MH, Newman S, Imray CH. The cerebral effects of ascent to high altitudes [J]. Lancet Neurol, 2009, 8(2): 175-191.

9Jain V, Baitharu I, Barhwal K, et al. Enriched environment prevents hypobaric hypoxia induced neurodegeneration and is independent of antioxidant signaling [J]. Cell Mol Neurobiol, 2012, 32(4): 599-611.

10 Cuello AC. Gangliosides, NGF, brain aging and disease: a mini-review with personal reflections [J]. Neurochem Res, 2012, 37(6): 1256-1260.

11 Stojanov K, Georgieva JV, Brinkhuis RP, et al. In vivo biodistribution of prion- and GM1-targeted polymersomes following intravenous administration in mice [J]. Mol Pharm, 2012, 9(6): 1620-1627.

12 Sano R, Annunziata I, Patterson A, et al. GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria- associated ER membranes links ER stress to Ca (2+)-dependent mitochondrial apoptosis [J]. Mol Cell, 2009, 36(3): 500-511.

13 Julian CG, Subudhi A W, Wilson MJ, et al. Acute mountain sickness, inflammation, and permeability: new insights from a blood biomarker study [J]. J Appl Physiol (1985), 2011, 111(2): 392-399.

4 Guo Z, Sun X, He Z, et al. Matrix metalloproteinase-9 potentiates early brain injury after subarachnoid hemorrhage [J]. Neurol Res, 2010, 32(7): 715-720.

15 Feiler S, Plesnila N, Thal SC, et al. Contribution of matrix metalloproteinase-9 to cerebral edema and functional outcome following experimental subarachnoid hemorrhage [J]. Cerebrovasc Dis, 2011, 32(3): 289-295.

EffectofgangliosideGM1onexpressionofMMP9afteracutehypobariccerebraledema

LIHu1,2,LIUHong1,2,WANGBairen3,GONGGu1

1DepartmentofAnesthesiology，GeneralHospitalofChengduMilitaryCommand,Chengdu610083;2DepartmentofAnesthesiology,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000;3DepartmentofNeuroimmunomodulation,InstituteofNeuroscienceofPLA,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveThe effect of monosialotetrahexosylganglioside (GM1) on expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP9) after acute exposure to hypoxia and hypobaric conditions was investigated.MethodsAdult male C57 mice were randomly divided into 4 groups (control, HH, GM1+HH, GM1,n=6). Mice in control group were kept under normal atmospheric pressure; mice in HH group were placed in a decompression chamber which simulated the environment of an altitude of 6 000 m ; mice in HH+GM1 group were exposed to acute hypoxia hypobaric after intra-peritoneal administration of GM1 (30 mg/kg/d) for 3 d; mice in GM1 group were kept outside the decompression chamber after intra-peritoneal administration of GM1 (30 mg/kg/d) for 3 d. The expression of MMP9 was analyzed by Western blot and immunofluorescence staining 24 h after acute hypoxia hypobaric. The integrity of the BBB was evaluated by using Evans blue extravasation and wet/dry ratio methods.ResultsAt 24 h after hypoxia hypobaric, the expression of MMP9 in HH group was increased (Plt;0.05), and in GM1+HH group MMP9 level was down-regulated compared with HH group (Plt;0.05). GM1 reduced the Evans blue extravasation (Plt;0.05) and wet/dry ratio (Plt;0.05).ConclusionGM1 plays a significant neuroprotection by suppressing expression of MMP9 after acute hypoxia hypobaric exposure.

Ganglioside GM1; Matrix metalloproteinase-9; Acute hypoxia hypobaric

1671-2897(2016)15-042-04

R 322.61

A

國家自然科學(xué)基金資助項目(0670666)

李虎，碩士研究生，E-mail: 418837376@qq.com

*通訊作者：鞏固，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail: gonggu68@163.com

2015-05-23；

2015-07-30)