董 柱，鐘亨任，羅文杰，宋彥亭，鄧世明，張英霞

(海南大學(xué) 海洋學(xué)院，熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228)

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海南產(chǎn)沼蛙皮膚temporin家族抗菌肽抗菌活性及穩(wěn)定性研究

董 柱，鐘亨任，羅文杰，宋彥亭，鄧世明，張英霞

(海南大學(xué) 海洋學(xué)院，熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 570228)

用化學(xué)合成法合成了4種抗菌肽，并測定了其抗菌活性及溫度、熱處理時間和pH值等不同因素對抑菌活性的影響，結(jié)果表明：temporin-GHa～GHd對革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant S. aureus，MRSA)；革蘭氏陰性菌：大腸桿菌(Escherichia coli，D 31)；真菌：白色念珠菌(Monilia albican)均具有抗菌活性.對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度最低，分別為6.8，6.8，12.9和12.7μmol·L-1.除temporin-GHb對溫度稍敏感外，temporin-GHa，temporin-GHc和temporin-GHd在25～100 ℃范圍內(nèi)，均具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，即使在80 ℃加熱80 min，100 ℃加熱20 min，其抗菌活性仍基本保持不變.4種抗菌肽在pH 2～10范圍內(nèi)穩(wěn)定，即使在極端pH條件下(pH 2～3或9～10)，其抗菌活性仍變化不大.

沼蛙； 抗菌肽； 抗菌活性； 穩(wěn)定性

抗菌肽是廣泛存在于動植物中的一類小肽，它在生物免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用.研究表明，抗菌肽具有多種生物活性[1-2]，它對細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲和癌細(xì)胞具有抑制或殺滅作用，且不易產(chǎn)生耐藥性[3]，因此，它很有可能成為新一代的抗菌藥物[4]，目前，國外已經(jīng)有抗菌肽應(yīng)用于治療人皮膚感染的報(bào)道[5].

沼蛙(Hylarana guentheri)常見于中國南部各省，沿低海拔的農(nóng)田、溪流、池畔分布.有報(bào)導(dǎo)表明：不同地域的沼蛙其分泌物中的活性組分存在差異[6-7].抗菌肽的來源非常豐富，但是其在個體中的含量較少，相對分子質(zhì)量也較低，其分離純化的過程較復(fù)雜.本文以海南產(chǎn)沼蛙為材料，參考了已知的抗菌肽保守序列設(shè)計(jì)引物，并利用RT-PCR法在沼蛙皮膚mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中快速篩選出4條temporin家族的抗菌肽序列，分別命名為temporin-GHa，temporin-GHb，temporin-GHc和temporin-GHd，通過化學(xué)方法合成并測定了其抗菌活性及在不同條件下的穩(wěn)定性.

1 材料和方法

1.1 沼蛙皮膚總RNA提取 沼蛙采集于海南?？谑薪紖^(qū)，將其用乙醚麻醉后置于冰上，然后迅速取其背部皮膚投于液氮中，快速將其研磨成粉末.根據(jù)Trizol Reagent (Invitrogent)說明書步驟來提取皮膚總RNA，并用cDNA第一鏈合成試劑盒PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara, 中國)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈.

1.2 篩選抗菌肽序列 以合成的cDNA 第一鏈為模板擴(kuò)增編碼抗菌肽的cDNA序列.正向引物5′-GAWYYAYYHRAGCCYAAADATGTTCA-3′(W=A or T；Y=C or T；H=A, C or T；R=A or G；D=A, G, or T), 反相引物5′-GCTAAATGATATACCACATC-3′[8-9].PCR總體積為50 μL，條件為: 95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，46 ℃退火30 s，72 ℃適溫延伸 30 s，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后延伸10 min.目標(biāo)產(chǎn)物約300 bp.用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0 (Takara, 中國) 試劑盒回收目標(biāo)條帶，并克隆到載體pMD18-T Vector (Takara, 中國)上，所篩選的陽性克隆在上海生工生物股份有限公司測定序列.

1.3 數(shù)據(jù)分析 推導(dǎo)測定的核酸序列所編碼的氨基酸序列，并在NCBI上進(jìn)行Protein-Blast檢索，同時選擇PSI-Blast模式，其他以默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行.用軟件DNAMAN比較多個序列的相似性.

1.4 多肽合成 以固相合成法合成多肽(上海吉爾生化)，并以RP-HPLC進(jìn)行純化，當(dāng)純度大于95%時收集組分，凍干，用MALDI-TOF檢測合成的多肽.

1.5 抗菌活性的測定 實(shí)驗(yàn)菌株包括革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC 25923)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant S. aureus，MRSA，ATCC 43300)；革蘭氏陰性菌：大腸桿菌(Escherichia coli，D 31)；真菌：白色念珠菌(Monilia albican，ATCC 10231).調(diào)整革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌單位體積的活菌個數(shù)至106 cfu·mL-1，真菌至105 cfu/mL，分別加100 μL菌液至96孔板的各孔中，第1至第10孔中等量加入以2倍梯度稀釋的抗菌肽(終質(zhì)量濃度為1.25～0.002 mg·mL-1)，第11孔加等量2.5 mg·mL-1的卡那霉素，并將其作陽性對照，第12孔加等量的無菌水，作陰性對照.37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，用酶標(biāo)儀測定620 nm處的吸光值.以不長菌的孔所對應(yīng)的最小質(zhì)量濃度為該抗菌肽的最低抑菌質(zhì)量濃度(minimum inhibitory concentration，MIC).分別設(shè)置3個重復(fù)孔.

1.6 溫度對temporin家族抗菌活性的影響 分別取適量樣品(temporin-GHa，temporin-GHb，temporin-GHc，temporin-GHd )溶于水中，定容至終質(zhì)量濃度5 mg·mL-1.將樣品分別在40 ℃，60 ℃，80 ℃及100 ℃恒溫加熱20 min，8 000 r·min-1離心5 min，無沉淀產(chǎn)生.以上述方法測定其對金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)的抗菌活性.每孔等量上樣10 μL，以無菌水作為陰性對照，常溫下的樣品作為陽性對照.設(shè)置3組重復(fù)，觀察并測定其抑菌圈的平均直徑.

1.7 加熱時間對temporin家族抗菌活性的影響 將上述相同的樣品在恒溫80 ℃下分別加熱20 min，40 min，60 min及80 min，并以8 000 r·min-1離心5 min，無沉淀產(chǎn)生.同樣，檢測其對金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)的抗菌活性.每孔等量上樣10 μL，以無菌水作為陰性對照，并以常溫下的樣品為陽性對照.設(shè)置3組重復(fù)，觀察并測定其抑菌圈的平均直徑.

1.8 不同pH條件對temporin家族抗菌活性的影響 取適量的4種樣品，分別溶解于pH 2～10的水溶液，定容至終質(zhì)量濃度5 mg·mL-1.以上述方法測定不同pH對抗菌肽抗金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)活性的影響.設(shè)置3組重復(fù)，觀察并測定其抑菌圈的平均直徑.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 沼蛙皮膚抗菌肽cDNA克隆及序列分析 經(jīng)測定，所提取的總RNA OD260/OD280 = 2.01,說明其純度較高.RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)過w=1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，在300 bp處有清晰的亮帶出現(xiàn).對68個陽性克隆進(jìn)行測序，得到4條編碼不同于抗菌肽的cDNA序列.去除信號肽序列，4種成熟抗菌肽由13個氨基酸組成，與來源于其他兩棲動物的抗菌肽進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)這4種抗菌肽屬于temporin家族，分別將其命名為temporin-GHa，temporin-GHb，temporin-GHc和temporin-GHd，經(jīng)NCBI檢索沒有發(fā)現(xiàn)完全相同的序列.temporin-Gua及temporin-1Sc是分別從福建產(chǎn)沼蛙和北非蛙科動物Pelophylax saharicus中分離得到(圖1)[6,10]的.Temporin家族的成熟抗菌肽在C末端通常會被酰胺化，故在化學(xué)合成該類抗菌肽時C末端胺基化.

黑色陰影部分表示完全保守序列，灰色陰影表示相對保守序列

2.2 抗菌肽對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度 通過微量稀釋法在96孔板上測得temporin家族抗菌肽對不同菌種的MIC值(見表1).4種抗菌肽對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌均具有抗菌活性.金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)對抗菌肽最敏感，其最低抑菌濃度分別為6.8，6.8，12.9，12.7 μmol/L.和其他3種抗菌肽比較，temporin-GHb的抗菌活性更強(qiáng)，其對不同菌株的最低抑菌濃度均相對較低.

表1 沼蛙抗菌肽最低抑菌濃度的測定 μmol/L

A: 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (ATCC 43300)；B: 金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)；C: 大腸桿菌 (D 31)；D: 白色念珠菌(ATCC 10231)

2.3 溫度對抗菌肽抗菌活性的影響 在40 ℃，60 ℃，80 ℃及100 ℃分別加熱處理4種抗菌肽20 min后，分別以8 000 r·min-1離心5 min，無明顯沉淀，取上清檢測其抗菌活性.結(jié)果顯示，temporin-GHb對溫度的耐受性相對稍差，經(jīng)80 ℃及100 ℃處理后，其抗菌活性有所降低，抗菌圈直徑由9 mm降至5 mm，而40 ℃及60 ℃處理對其抗菌活性無影響(見圖 2).其他3種抗菌肽經(jīng)幾種溫度處理后，其樣品抑菌圈的直徑變化不大(見表 2)，即使在100 ℃加熱20 min，仍基本保持其最初的抗菌活性，說明海南產(chǎn)沼蛙皮膚temporin家族的抗菌肽具有極佳的熱穩(wěn)定性.

A: temporin-GHa; B: temporin-GHb; C: temporin-GHc; D: temporin-GHd；1 ：無菌水，常溫；

mm

2.4 加熱時間對抗菌活性的影響 在80 ℃下，分別加熱4種抗菌肽(temporin-GHa～d)20 min，40 min，60 min和80 min，并以8 000 r·min-1離心5 min，無明顯沉淀產(chǎn)生，取上清檢測其抗菌活性.圖 3 和表 2顯示，temporin-GHa，temporin-GHc及temporin-GHd在80 ℃加熱 80 min，其抑菌圈的直徑變化不明顯，在高溫條件下其仍表現(xiàn)出良好的抗菌活性，具有突出的熱穩(wěn)定性.temporin-GHb在80 ℃經(jīng)不同時間處理，其抑菌圈直徑維持在5 mm左右.

A: temporin-GHa; B: temporin-GHb; C: temporin-GHc; D:temporin-GHd； 1: 無菌水；2: 80 ℃處理20 min；3: 80 ℃處理40 min；4: 80 ℃處理60 min；5: 80 ℃處理80 min

表3 加熱不同時間后temporin-GHa～d抗金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑 mm

2.5 不同pH條件對抗菌肽活性的影響 將抗菌肽在不同pH條件下處理，測定其對pH的耐受性，結(jié)果如圖 4所示，4種temporin家族的抗菌肽在pH 2.0～10條件下，其抗菌活性基本未受影響，即使在強(qiáng)堿性條件下(pH=10)，仍能保持最初的抗菌活性，說明該抗菌肽有較強(qiáng)的耐堿性，在強(qiáng)酸性條件下(pH=2)，其抗菌活力也沒有降低(表4)，說明該抗菌肽在極端pH條件下仍可保持較好的穩(wěn)定性.

A: temporin-GHa; B: temporin-GHb; C: temporin-GHc; D: temporin-GHd; 1: pH=2; 2: pH=3; 3: pH=4; 4: pH=5; 5: pH=6; 6: pH=7; 7: pH=8; 8: pH=9; 9: pH=10; 10:無菌水; 11: pH=2 的無菌水; 12: pH=10的無菌水

圖4 pH對temporin-GHa～d抗金黃色葡萄球菌抗菌活性的影響

3 討 論

隨著不同菌株對傳統(tǒng)抗生素藥物產(chǎn)生耐藥性，亟待開發(fā)新型的抗菌藥物.由基因編碼的抗菌肽由于其具有廣譜的抗菌活性、抗病毒、抗腫瘤、抗真菌、低毒等特點(diǎn)而備受關(guān)注.Temporin家族抗菌肽為首次從蛙科動物Rana temporaria的皮膚中分離得到[11]，到目前為止，temporin類抗菌肽是自然界中所發(fā)現(xiàn)的分子質(zhì)量最小的抗菌肽，該類抗菌肽通常含有10～14個氨基酸殘基，并且在其C末端氨基酸被酰胺化[12].從海南沼蛙皮膚中克隆得到的抗菌肽temporin-GHa，temporin-GHb，temporin-GHc及temporin-GHd均含有13個氨基酸殘基，經(jīng)過分析，其不含堿性氨基酸，凈電荷為零.經(jīng)微量稀釋法檢測發(fā)現(xiàn)，這4種抗菌肽對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及真菌均具有抗菌性活，說明其具有廣譜抗菌活性.其中，對革蘭氏陽性菌和金黃色葡萄球菌最敏感，最低抑菌濃度分別為6.8，6.8，12.9，12.7 μmol/L.在這4種抗菌肽中，temporin-GHb對不同菌株的最低抑菌濃度均相對較低，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗菌活性.

在對其穩(wěn)定性的研究中，于80 ℃ 處理temporin-GHb 20 min后，其抑菌圈從9 mm縮小至5 mm；在熱處理時間對抗菌肽活性影響的研究中，于80 ℃及100 ℃加熱t(yī)emporin-GHb 80 min也能檢測到其抗菌活性，其抑菌圈大小均為5 mm，說明溫度對temporin-GHb的抗菌活性有一定的影響，但80 ℃是其抗熱臨界溫度，在此溫度其活性有所降低，超過此溫度后抗菌活性仍保持；Temporin-GHa，temporin-GHc和temporin-GHd對溫度具較強(qiáng)耐受性，在25～100 ℃范圍內(nèi)，均具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，即使在100 ℃加熱80 min，其抑菌圈大小無顯著變化，抗菌活性仍基本保持不變.temporin-GHa～d對pH變化不敏感，在極端pH條件下(pH 2～3或pH 9～10)，其抗菌活性變化不大.

從海南沼蛙皮膚中克隆得到的抗菌肽temporin-GHa～d對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及真菌都表現(xiàn)出抗菌活性，尤其對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌也具有較好的抗菌活性，說明其抗菌譜廣.這4種抗菌肽具有較好的熱穩(wěn)定性和耐酸堿性，有一定的應(yīng)用前景，本研究為其可能的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).

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Antimicrobial Activities and Influential Factors of Temporin Family Antimicrobial Peptides Derived fromHylaranaguentheriof Hainan

Dong Zhu, Zhong Hengren, Luo Wenjie, Song Yanting, Deng Shiming, Zhang Yingxia

(Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education, College of Marine Science, Hainan University, Haikou 570228, China)

In our report, the chemical synthesis method were performed to synthesis four antimicrobial peptides, temporin-GHa，temporin-GHb，temporin-GHc, and temporin-GHd, their antimicrobial activities were determined, and the effects of temperature, heat-treated time, and pH value on antimicrobial activities were analyzed. The results indicated that temporin-GHa～GHd has the antimicrobial activities against Gram-positive strains, Staphylococcus aureus, methicillin-resistant S. aureus (MRSA), Gram-negative strains Escherichia coli (D 31), and fungus, Monilia albican; S. aureus was the most sensitive strains, and the minimum inhibitory concentration (MIC) of four temporin family antimicrobial peptides against S. aureus is 6.8, 6.8, 12.9, and 12.7 μM, respectively; temporin GHa，temporin GHc和temporin GHd were stable over a broad range of temperatures (25-100 ℃), and pH (2-10).

Hylarana guentheri; antimicrobial peptides; antimicrobial activity; stability

2016-02-29

國家自然科學(xué)基金(31560593)

董柱(1990-)，男，湖南衡陽人，海南大學(xué)海洋學(xué)院2013級碩士研究生，E-mail：dongzhuhd@163.com

張英霞(1973-)，女，吉林集安人，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：動物活性蛋白與多肽，E-mail：yingxiazhang@hotmail.com

1004-1729(2016)03-0250-07

Q 71

A DOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2016.0038