宋佳倫，楊 琦

(山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250000)

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轉(zhuǎn)錄因子扭曲基因表達(dá)異常在早期子宮頸癌發(fā)病中的意義及對預(yù)后的影響

宋佳倫，楊 琦

(山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250000)

目的 探討轉(zhuǎn)錄因子扭曲基因(Twist)表達(dá)異常在早期子宮頸癌發(fā)病中的意義及對預(yù)后的影響。方法 選取早期子宮頸癌患者87例，子宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)患者43例和正常子宮組織40例，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測早期子宮頸癌、CIN和正常子宮組織中Twist基因表達(dá)，早期子宮頸癌患者術(shù)后隨訪截止2015年5月31日，以早期子宮頸癌組織中Twist mRNA表達(dá)量中位值為界值，將患者分為高表達(dá)組(n=46)和低表達(dá)祖(n=41)，利用Kaplan-Meier生存分析法分析無進(jìn)展生存時(shí)間和生存時(shí)間。結(jié)果 早期子宮頸癌組織中Twist mRNA相對表達(dá)量(2.21±0.17)，高于CINⅡ和CIN Ⅲ組織中的(1.32±0.13)和(1.71±0.15)及正常子宮組織中的(1.06±0.11)，且CINⅢ>CINⅡ>正常子宮組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；早期子宮頸癌組織中Twist mRNA相對表達(dá)量與臨床分期、分化程度、病理類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(t值分別為27.721、18.047、18.213、19.483，均P<0.05)；低表達(dá)組患者中位無進(jìn)展生存時(shí)間49.43個(gè)月，高表達(dá)組患者中位無進(jìn)展生存時(shí)間37.52個(gè)月，Log Rank檢驗(yàn)顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.350，P=0.037)，低表達(dá)組患者中位生存時(shí)間53.8個(gè)3月，高表達(dá)組患者中位生存時(shí)間43.91個(gè)月，Log Rank檢驗(yàn)顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.381，P=0.036)。結(jié)論 Twist基因在早期子宮頸癌組織中呈高表達(dá)，高表達(dá)患者術(shù)后無進(jìn)展生存時(shí)間和生存時(shí)間縮短。

子宮頸癌；轉(zhuǎn)錄因子扭曲基因；表達(dá)；預(yù)后

子宮頸癌作為女性常見惡性腫瘤，具有惡性程度高、侵襲力強(qiáng)、易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，是第三位導(dǎo)致女性死亡的惡性腫瘤[1]。目前，該病發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。轉(zhuǎn)錄因子扭曲基因(twisted gene transcription factor，Twist)作為一種轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵性調(diào)控作用，具有癌基因的特質(zhì)，可通過調(diào)控死亡相關(guān)基因表達(dá)及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移及侵襲過程[2]。研究表明，Twist與多種腫瘤生長、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥等過程關(guān)系密切[3-4]。本研究嘗試?yán)脤?shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)分析Twist在早期子宮頸癌組織中表達(dá)，以及其與臨床病理特征之間的關(guān)系，利用生存分析法探討其與患者預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床實(shí)踐提供基礎(chǔ)資料。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2010年4月至2012年5月在山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院擇期行手術(shù)治療的早期子宮頸癌患者87例，年齡28～74歲，平均年齡(49.32±8.93)歲，根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)2009年臨床分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰa期5例，Ⅰb期54例，Ⅱa期28例；分化程度：低分化16例，中分化59例，高分化12例；病理類型：鱗癌72例，腺癌15例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例。同期，選取在我院行宮頸錐切術(shù)治療的子宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)患者43例，年齡27～75歲，平均年齡(50.84±9.31)歲，包括CIN Ⅱ 17例和CINⅢ26例；留取子宮肌瘤行子宮全切術(shù)患者正常子宮組織40例作為對照組，年齡27～73歲，平均年齡(48.82±8.71)歲。所有研究對象術(shù)前均未接受放化療治療，排除其他子宮腫瘤者。所有研究對象均留取子宮頸組織，保存于-70℃冰箱以備檢。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對象均行知情同意。

1.2方法

1.2.1主要試劑及器材

Trizol總RNA提取試劑盒購自美國Biomiga公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR反應(yīng)試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司，Twist及內(nèi)參引物序列均由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成，紫外分光光度計(jì)購自上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測早期子宮頸癌、子宮頸上皮內(nèi)瘤變和正常子宮組織中轉(zhuǎn)錄因子扭曲基因表達(dá)

取保存的子宮頸組織，研磨后，用細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，用Trizol總RNA提取試劑盒對總RNA進(jìn)行提取，用紫外分光光度計(jì)對獲得的總RNA進(jìn)行檢測，取A260/A280≥1.80樣本完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板單鏈，以cDNA為模板用PCR反應(yīng)試劑盒進(jìn)行PCR。Twist及內(nèi)參引物序列分別為：Twist引物：上游：5′-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3′，下游：5′-TCTGGAGGACC￣TGGTAGAGG-3′；GAPDH引物,上游：5′-GGGAAACTGT￣GGCGTGAT-3′，下游：5′-GTGGTCGTTGATTTCAAT-3′。PCR反應(yīng)條件：94℃ 60s，94℃ 30s，56℃ 20s，74℃ 15s，連續(xù)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)反應(yīng)復(fù)孔。以GAPDH為參照，用2-△△Ct法獲得不同組織中Twist mRNA相對表達(dá)量。

1.2.3病例隨訪

所有早期子宮頸癌入選患者均完成隨訪，隨訪形式包括門診和電話隨訪，平均每3個(gè)月隨訪一次，未出現(xiàn)失訪病例，隨訪截止2015年5月31日，以術(shù)后病情進(jìn)展、惡化或復(fù)發(fā)為終點(diǎn)事件，記錄無進(jìn)展生存時(shí)間，以死亡為終點(diǎn)時(shí)間，記錄生存時(shí)間。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1早期子宮頸癌、子宮頸上皮內(nèi)瘤變和正常子宮組織中轉(zhuǎn)錄因子扭曲基因表達(dá)

早期子宮頸癌組織中Twist mRNA相對表達(dá)量(2.21±0.17)，高于CINⅡ和CIN Ⅲ組織中的(1.32±0.13)和(1.71±0.15)及正常子宮組織中的(1.06±0.11)，CIN Ⅲ和CINⅡ均高于正常子宮組織，且CIN Ⅲ高于CINⅡ，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=69.835，P<0.05)，見圖1。

圖1 早期子宮頸癌、CIN和正常子宮組織中Twist基因表達(dá)

Fig.1 Expressions of Twist gene in early stage cervical cancer, CIN and normal tissues

2.2早期子宮頸癌組織中轉(zhuǎn)錄因子扭曲基因表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

早期子宮頸癌組織中Twist mRNA相對表達(dá)量與年齡無關(guān)(P>0.05)，而與臨床分期、分化程度、病理類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(t值分別為27.721、18.047、18.213、19.483，均P<0.05)，見表1。

注：與Ⅰa相比，*P<0.05；與Ⅰb相比，#P<0.05。

2.3早期子宮頸癌組織中轉(zhuǎn)錄因子扭曲基因表達(dá)對無進(jìn)展生存時(shí)間和生存時(shí)間的影響

以早期子宮頸癌組織中轉(zhuǎn)錄因子扭曲基因 mRNA相對表達(dá)量中位值為界值，將患者分為高表達(dá)組(n=46)和低表達(dá)祖(n=41)，低表達(dá)組患者中位無進(jìn)展生存時(shí)間49.43個(gè)月，高表達(dá)組患者中位無進(jìn)展生存時(shí)間37.52個(gè)月，Log Rank檢驗(yàn)顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.350，P=0.037)，見圖2；低表達(dá)組患者中位生存時(shí)間53.83個(gè)月，高表達(dá)組患者中位生存時(shí)間43.91個(gè)月，Log Rank檢驗(yàn)顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.381，P=0.036)，見圖3。

圖2 早期子宮頸癌組織中Twist基因表達(dá)對無進(jìn)展生存時(shí)間的影響

Fig.2 Influence of the expressions of Twist gene in early-stage cervical cancer tissues on progression-free survival time

圖3 早期子宮頸癌組織中Twist基因表達(dá)對生存時(shí)間的影響

Fig.3 Influence of the expressions of Twist gene in early-stage cervical cancer tissues on survival time

3討論

3.1轉(zhuǎn)錄因子扭曲基因可能與早期子宮頸癌發(fā)病有關(guān)

隨著診療技術(shù)的進(jìn)展，子宮頸癌早期階段便可診斷發(fā)現(xiàn)，有效的手術(shù)治療極大的改善了患者預(yù)后及術(shù)后生活質(zhì)量[5-6]。但對患者治療后隨訪發(fā)現(xiàn)，子宮頸癌患者術(shù)后具有較高的復(fù)發(fā)率，且隨著復(fù)發(fā)、病情進(jìn)展惡化，死亡率隨之升高，不利于患者預(yù)后[7]。因此，對影響早期子宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)機(jī)制開展研究，對改善患者預(yù)后具有重要意義。Twist作為高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞重建中發(fā)揮重要調(diào)控作用，近年來發(fā)現(xiàn)，其在腫瘤細(xì)胞增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用[8]。有研究指出，Twist可能通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而使細(xì)胞失去極性，失去了與基底膜連接，而加速細(xì)胞侵襲與遷移過程[9]。Twist在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)，作為一個(gè)癌基因而參與腫瘤進(jìn)展及細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移過程[10]。本研究顯示，Twist基因在早期子宮頸癌和CIN組織中均出現(xiàn)不同程度表達(dá)，且早期子宮頸癌> CIN Ⅲ>CINⅡ>正常子宮組織，說明Twist基因隨著子宮頸病變嚴(yán)重程度而表達(dá)增加，可能與早期子宮頸癌發(fā)病有關(guān)，在子宮頸癌發(fā)病中發(fā)揮癌基因作用。

3.2轉(zhuǎn)錄因子扭曲基因表達(dá)水平可作為子宮頸癌患者預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)

本研究顯示，早期子宮頸癌組織中Twist mRNA相對表達(dá)量與臨床分期、分化程度、病理類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，進(jìn)一步說明Twist可能與早期子宮頸癌病情嚴(yán)重程度及侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，與丁婭妮等[11]研究結(jié)論相同。有研究指出，Twist在卵巢上皮性癌中呈高表達(dá)，且高表達(dá)患者無進(jìn)展生存時(shí)間及總生存時(shí)間均縮短[12]。本研究顯示，以早期子宮頸癌組織中Twist mRNA相對表達(dá)量中位值為界值，高表達(dá)組患者中位無進(jìn)展生存時(shí)間和中位生存時(shí)間均短于低表達(dá)組患者，說明Twist基因表達(dá)與早期子宮頸癌患者預(yù)后有關(guān)，Twist基因高表達(dá)預(yù)示患者預(yù)后不良，與Wang等[13]研究結(jié)論相同，提示Twist基因表達(dá)水平可作為子宮頸癌患者預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。

綜上所述，Twist基因在早期子宮頸癌組織中呈高表達(dá)，與子宮頸癌發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)，且Twist基因高表達(dá)患者術(shù)后無進(jìn)展生存時(shí)間和生存時(shí)間縮短，為下一步開展基因治療以改善患者預(yù)后提供了新的靶位。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：任慕蘭]

Significance of abnormal expression of twisted gene transcription factor in pathogenesis of early-stage cervical cancer and its influence on prognosis

SONG Jia-lun,YANG Qi

(Affiliated Reproductive Hospital of Shandong University, Shandong Jinan 250000, China)

Objective To investigate the significance of abnormal expression of twisted gene transcription factor (Twist) in pathogenesis of early-stage cervical cancer and its influence on prognosis. Methods Totally 87 cases of early-stage cervical cancer, 43 cases of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and 40 cases of normal uterine tissues were selected. The expressions of Twist gene in early-stage cervical cancer, CIN and normal tissues were detected by using real-time PCR. All patients with early-stage cervical cancer were postoperatively followed up till May 31, 2015. Taking the median of Twist mRNA expression level in early-stage cervical cancer tissues as cutoff value, the patients were divided into high expression group (n=46) and low expression group (n=41). The progression-free survival time and survival time were analyzed by using Kaplan-Meier survival analysis.Results The relative expression levels in early-stage cervical cancer tissues was 2.21±0.17, which was higher than that in CINⅡ and CIN Ⅲ tissues(1.32±0.13, 1.71±0.15) and that in normal uterine tissue (1.06±0.11). And it was higher in CIN Ⅲ than in CINⅡand than in normal uterine tissue with statistically significant differences (P<0.05). The relative expression levels of Twist mRNA in early-stage cervical cancer tissues were related with clinical stage, degree of differentiation, histological type and lymph node metastasis (tvalue was 27.721, 18.047, 18.213 and 19.483, respectively, allP<0.05). The median progression-free survival time in low expression group was 49.43 months, and in high expression group it was 37.52 months. Log Rank test showed significant difference (χ2=4.350,P=0.037). The median survival time in low expression group was 53.83 months, and in high expression group it was 43.91 months. Log Rank test showed significant difference (χ2=4.381,P=0.036). Conclusion Twist gene is highly expressed in early-stage cervical cancer tissue. The progression-free survival time and survival time of high expression patients after surgery are shortened.

cervical cancer; twisted gene transcription factor (Twist); expression; prognosis

2016-05-13

河南省2014科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(編號(hào)：142102310416)

宋佳倫(1978 -)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事婦產(chǎn)科工作。

楊 琦，副主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.09.012

R711.7

A

1673-5293(2016)09-1066-03