胡 佳，鄒曉英，莊 姮△，高學(xué)軍

(1. 北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院，牙體牙髓科 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實驗室 口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點實驗室， 北京 100081； 2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科， 福州 350002)

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·論著·

根管封閉劑對牙周膜細(xì)胞生物相容性的影響

胡 佳1,2，鄒曉英1，莊 姮1△，高學(xué)軍1

(1. 北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院，牙體牙髓科 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實驗室 口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點實驗室， 北京 100081； 2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科， 福州 350002)

目的：研究氧化鋅丁香油類(zinc oxide and eugenol based sealers，ZOE)、環(huán)氧樹脂類(epoxy resin sealers，ERS)、硅酮基類(silicone based sealers，SBS)根管封閉劑對牙周膜細(xì)胞(human periodontal ligmant cells, hPDLCs)的增殖和礦化潛能的影響。方法：選用3顆不同人牙齒來源的hPDLCs進行重復(fù)實驗，采用酶消化法+組織塊培養(yǎng)法進行hPDLCs體外原代培養(yǎng)，按照培養(yǎng)基的不同成分分組：(1)ZOE固化 24 h 浸提液培養(yǎng)基組；(2)ZOE固化 1周浸提液培養(yǎng)基組；(3)ZOE固化 2周浸提液培養(yǎng)基組；(4)ERS固化 24 h 浸提液培養(yǎng)基組；(5)ERS固化 1周浸提液培養(yǎng)基組；(6)ERS固化 2周浸提液培養(yǎng)基組；(7)SBS固化 24 h 浸提液培養(yǎng)基組；(8)SBS固化 1周浸提液培養(yǎng)基組；(9)SBS固化 2周 浸提液培養(yǎng)基組；(10)不含浸提液培養(yǎng)基組(對照組)。采用倒置顯微鏡觀察hPDLCs細(xì)胞形態(tài)的變化，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(methyl-thiazol-diphenyltetrazolium，MTT)法測定細(xì)胞增殖能力，試劑盒法測定堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性。選取固化2周的各組材料制備礦化誘導(dǎo)浸提液，不含浸提液的礦化培養(yǎng)基為陽性對照組,采用茜素紅染色法及氯化十六烷基吡啶半定量法分析礦化物形成情況。結(jié)果：比較相對增殖率( relative growth rate，RGR)，ZOE固化2周內(nèi)均具有中度或嚴(yán)重細(xì)胞毒性(RGR為13.6%～39.9%)；ERS固化24 h具有輕微細(xì)胞毒性(RGR為63.6%～76.4%)，固化1周后輕微或無細(xì)胞毒性(RGR為87.6%～95.3%)；SBS固化后無明顯細(xì)胞毒性(RGR為91.8%～106.7%)。比較ALP活性,SBS不同固化時間組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.397，P=0.053)，且均高于ZOE和ERS組。半定量法檢測數(shù)據(jù)顯示，ZOE：D562 nm= 0.180±0.050,ERS：D562 nm= 2.968±0.201,SBS：D562 nm=3.623±0.039,對照組：D562 nm=3.477±0.102，即ZOE

根管封閉劑；牙周膜；細(xì)胞，培養(yǎng)的；細(xì)胞增殖；牙再礦化

將根管封閉劑充填于根管壁與牙膠之間的不規(guī)則空間，對于形成良好的根尖封閉至關(guān)重要。然而由于解剖、病理以及醫(yī)源性等因素可能發(fā)生根管封閉劑超填充,即便在恰填充的情況下，封閉劑的溶出物、降解物仍然可能滲透、擴散出根尖孔[1]。人牙周膜細(xì)胞(human periodontal ligament cells，hPDLCs)在有根尖病變的患牙中，是組織愈合的主要細(xì)胞來源[2]，在沒有根尖病變的患牙中，直接與根管封閉劑的溶出物、降解物或者超出根尖的部分接觸，因此，根管封閉劑對hPDLCs生物活性的影響與根管治療的效果密切相關(guān)。

臨床上常用的根管封閉劑有氧化鋅丁香油制劑、含鈣制劑、玻璃離子制劑以及聚合物類制劑。氧化鋅丁香油類根管封閉劑(zinc oxide and eugenol based sealers，ZOE)具有親水性，研究報道對細(xì)胞刺激性較大[3]。環(huán)氧樹脂類根管封閉劑(epoxy resin sealers，ERS)具有良好流動性和臨床可操作性，與牙本質(zhì)有弱粘接的特性提高了封閉性，然而是否存在細(xì)胞毒性評價不一[4]。硅酮基類根管封閉劑(silicone based sealers，SBS)具有良好的流動性和加壓觸變性，同時也增加了超填充的風(fēng)險。許多文獻報道SBS僅有輕微或無細(xì)胞毒性[4-5]，然而對于hPDLCs細(xì)胞分化及其礦化潛能的影響并無相關(guān)研究，因此，本研究評價3種常用根管封閉劑對hPDLCs的細(xì)胞毒性和礦化潛能的影響，為探討根管封閉劑對根尖周組織修復(fù)的影響提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 主要材料和儀器

改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco modified Eagle’s medium/ F12, DMEM/F12)、Ⅰ型膠原酶、胎牛血清(fatal bovine serun，F(xiàn)BS)、青霉素、鏈霉素、L-谷氨酰胺、0.25% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶-EDTA購自美國Gibco公司，維生素C、β-甘油磷酸鈉、地塞米松購自英國Sigma-Aldrich公司，MTT粉末購自美國Amresco公司，BCA蛋白定量試劑盒(PC0020)購自北京索萊寶科技有限公司，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性檢測試劑盒購自南京建成科技有限公司，茜素紅溶液購自美國Sigma公司，氯化十六烷基吡啶購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，倒置顯微鏡購自日本Nikon公司，酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司，超聲細(xì)胞破碎儀購自美國Branson公司，ZOE購自美國SybronEndo公司，ERS購自美國Dentsply公司，SBS購自德國ColteneWhaledent 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

本研究經(jīng)北京大學(xué)口腔醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：PKUSS-IRB-201310064)，實驗開始前獲得研究對象的知情同意。收集11～19歲因阻生或正畸拔除的健康前磨牙或第三磨牙，采用酶消化法+組織塊培養(yǎng)法[6-7]，實驗細(xì)胞來源于3顆牙齒。在超凈臺內(nèi)刮取根中部1/3牙周膜組織，加入0.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的Ⅰ型膠原酶37 ℃消化30 min。1 000 r/min離心3 min，將組織塊均勻接種于25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，倒置培養(yǎng)瓶，加入5 mL含20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))FBS和雙抗的DMEM/F12，于5%(體積分?jǐn)?shù))CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，4 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶。繼續(xù)培養(yǎng)5 d，之后每2～3天換液一次。細(xì)胞生長至80%～90%匯合時，用0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶-EDTA消化傳代培養(yǎng)，第3代用于實驗。

1.3 浸提液制備

浸提液樣本的制備依據(jù)《醫(yī)療器械生物學(xué)評價——第12部分：樣品制備與參照樣品》，標(biāo)準(zhǔn)號ISO 10993-12:2007。取 ZOE、ERS、SBS 3種根管封閉劑制備成直徑 4 mm 、厚3 mm的圓柱體，37 ℃，5%CO2條件下固化24 h，于DMEM/F12培養(yǎng)基中浸提24 h(材料塊的表面積/培養(yǎng)液體積=0.125 m2/L)，得到固化24 h的浸提液，材料塊繼續(xù)置于DMEM/F12培養(yǎng)基中，隔周換液后分別浸提24 h，得到固化后1周、2周的浸提液，用0.22 μm濾膜過濾除菌，加入10% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))FBS，制備成浸提液。

1.4 分組情況和hPDLCs細(xì)胞增殖能力測定

實驗分組：(1)ZOE 24 h 浸提液培養(yǎng)基組；(2)ZOE 1周浸提液培養(yǎng)基組；(3)ZOE 2周浸提液培養(yǎng)基組；(4)ERS 24 h 浸提液培養(yǎng)基組；(5)ERS 1周浸提液培養(yǎng)基組；(6)ERS 2周浸提液培養(yǎng)基組；(7)SBS 24 h 浸提液培養(yǎng)基組；(8)SBS 1周浸提液培養(yǎng)基組；(9)SBS 2周浸提液培養(yǎng)基組；(10)DMEM/F12培養(yǎng)基組(對照組)。取對數(shù)生長期第3代hPDLCs以2×104個/孔密度接種于96孔板，37 ℃、5%CO2孵育過夜待其貼壁，記為第 0 天。每孔更換200 μL材料浸提液或DMEM/F12培養(yǎng)基，隔天換液。以接種后第 0、1、3、5、7、14 天為測定點，取各組細(xì)胞，每孔加入5 g/L 的MTT 溶液20 μL，4 h后棄原液，每孔加入 150 μL DMSO，振蕩 10 min，用酶標(biāo)儀測定各孔光密度值(D492 nm)。實驗重復(fù)6次。

細(xì)胞毒性反應(yīng)依據(jù)相對增殖率 (relative growth rate，RGR)分為嚴(yán)重(<30%)、中度(30%～60%)、輕微(60%～90%)、無細(xì)胞毒性(≥90%)[8]。RGR(%)=(D實驗組/D對照組)×100%

1.5 hPDLCs堿性磷酸酶活性檢測

取第3代hPDLCs細(xì)胞，以5×104個/孔密度接種到24孔板中，置于 37 ℃、5%CO2孵育過夜待細(xì)胞貼壁，更換2 mL材料浸提液或DMEM/F12培養(yǎng)基，記為第 0 天。隔天換液，連續(xù)培養(yǎng)7 d和10 d后，按照試劑盒說明書進行ALP定量檢測。實驗重復(fù)3次。

1.6 礦化染色及半定量實驗

選取固化2周的材料，用礦化誘導(dǎo)液[含10% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10-4mmol/L地塞米松、50 mg/L維生素C的高糖DMEM培養(yǎng)液]制備各組礦化浸提液，以不含浸提液的礦化誘導(dǎo)液為陽性對照組。取第3代hPDLCs細(xì)胞，以5×104個/孔密度接種到24孔板中，待細(xì)胞生長至60%匯合后，換各組礦化誘導(dǎo)液培養(yǎng)。此后隔 3 天換各組培養(yǎng)液1次。分別于第 14、 28 天， 用95%乙醛固定15 min，室溫下加入等量pH 4.2 的茜素紅溶液37 ℃染色30 min，去離子水沖洗去除非特異性染色，倒置顯微鏡下觀察、拍照。將茜素紅染色(第28 天)后的孔板徹底晾干，加入 1 mL 100 mmol/L 氯化十六烷基吡啶溶液，室溫下 100 r/min 輕搖，各孔分別吸取150 μL紫色溶液轉(zhuǎn)移入96孔板內(nèi)，用酶標(biāo)儀測各孔光密度值(D562 nm)。實驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差及Turkey法分析，假設(shè)檢驗為雙側(cè)檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常hPDLCs細(xì)胞的形態(tài)

原代培養(yǎng)的第6 天開始，即有細(xì)胞從組織塊周圍游出，細(xì)胞為星形或長梭形，約14 d細(xì)胞鋪滿瓶底的80%，細(xì)胞生長旺盛。用于實驗的第3代細(xì)胞呈漩渦狀、柵欄狀、放射狀外觀。高倍鏡下觀察(圖1)，細(xì)胞呈星形、長梭形，周圍有數(shù)個長短不同的突起，胞體豐滿，胞漿均勻，核圓形或卵圓形，核仁清晰。

圖1 正常hPDLCs形態(tài)(×200)
Figure 1 Normal morphology of hPDLCs (×200)

2.2 各組細(xì)胞形態(tài)變化

倒置顯微鏡下觀察，在ZOE各固化時間的浸提液作用下細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。ERS固化早期(24 h)組可見部分細(xì)胞圓縮，細(xì)胞間間隙增大。ERS固化1周、2周組以及SBS各組細(xì)胞未見明顯形態(tài)變化(圖2)。

2.3 各組細(xì)胞增殖情況及毒性評級

固化24 h時比較各組浸提液培養(yǎng)下hPDLCs細(xì)胞增殖情況。ZOE浸提液組培養(yǎng)下，短時間內(nèi)(1 d)即出現(xiàn)細(xì)胞密度減低，第3 天降至最低，細(xì)胞基本無增殖。ERS浸提液組經(jīng)歷了遲緩期、對數(shù)增殖期，第7 天開始生長速度減慢。SBS組細(xì)胞增殖曲線與對照組一致，均較早進入對數(shù)期，第7 天時，細(xì)胞密度最高(D492 nm= 0.457±0.059)，分別為ERS(D492 nm= 0.326±0.023)的1.3倍，ZOE(D492 nm= 0.014±0.008)的32.6倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

固化1周和2周時，ZOE浸提液組培養(yǎng)第1 天均出現(xiàn)細(xì)胞密度減低，細(xì)胞總體生長緩慢，無典型的生長周期。ERS浸提液組和SBS浸提液組細(xì)胞增殖曲線與對照組一致，大約在培養(yǎng)7 天后達到最高生長速度，第14 天時，各組間細(xì)胞密度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(ERS：D492 nm= 0.580±0.027,SBS：D492 nm= 0.619±0.023,P=0.226)。

比較RGR，ZOE固化2周內(nèi)均具有中度到嚴(yán)重細(xì)胞毒性(RGR為13.6%～39.9%)。ERS 24 h浸提液對hPDLCs的生長有輕微細(xì)胞毒性(RGR為63.6%～76.4%)， 固化1周后輕微或無細(xì)胞毒性(RGR為87.6%～95.3%)，固化2周后無細(xì)胞毒性(RGR為92.8%～99.0%)。SBS各組均無明顯細(xì)胞毒性(RGR為91.8%～106.7%)，見表1。

A, control group； B, zinc oxide and eugenol based sealers ；C, epoxy resin sealers；D, silicone based sealers.

圖2 固化24 h浸提液作用下各組細(xì)胞形態(tài)(×100)
Figure 2 Cell morphology of hPDLCs cultured with medium containing 24 h extract fluids (×100)

表1 根管封閉劑浸提液對hPDLCs細(xì)胞毒性分級

Table 1 Cytotoxicity rate of different sealer extractions to hPDLCs

Items24h1week2weeksZOE++++++++/+++ERS++/--SBS---

-, not cytotoxic；+, slightly cytotoxic；++, modetately cytotoxic； +++, severe cytotoxic ; ZOE, zinc oxide and eugenol based sealers；ERS, epoxy resin sealers；SBS, silicone based sealers.

2.4 各組細(xì)胞的堿性磷酸酶活性

隨著固化時間的延長，ZOE各組浸提液培養(yǎng)hPDLCs的ALP活性有升高趨勢，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=17.983，P=0.003)。ERS各組ALP活性隨固化時間延長而增加，固化1周和2周組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，兩組均顯著高于固化24 h組(F=6.750，P=0.041)。SBS各組間ALP活性無明顯差異(F=3.397，P=0.053)， 均高于ZOE和ERS組，見圖3。

A, extraction from sealers left to set for 24 h; B, 1 week; C, 2 weeks; *P<0.05, vs. control group; ▲per gram protein; ZOE, zinc oxide and eugenol based sealers；ERS, epoxy resin sealers；SBS, silicone based sealers；Con, control group；ALP, alkaline phosphatase.

圖3 培養(yǎng)第7 天和第 10 天 的ALP測定結(jié)果
Figure 3 ALP activity of hPDLCs cultured with different medium at day 7 and 10

2.5 各組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成情況

礦化培養(yǎng)第14 天，陽性對照組細(xì)胞開始復(fù)層生長，周圍出現(xiàn)許多顆粒樣改變，并逐漸連接成片，孔板底部出現(xiàn)肉眼可見的針尖大小灰白色小結(jié)節(jié)，并逐漸增大，顯微鏡下見灰黑色小結(jié)節(jié)聚集成簇。ZOE礦化組無小結(jié)節(jié)形成，局部出現(xiàn)無細(xì)胞區(qū)。ERS礦化組鏡下可見少量散在灰黑色小結(jié)節(jié)。SBS礦化組形成多處片狀灰白色結(jié)節(jié)，密度較對照組高，顯微鏡下見灰黑色小結(jié)節(jié)聚集成簇，茜素紅染色顯示為鈣結(jié)節(jié)。

礦化培養(yǎng)第28 天肉眼和鏡下觀察(圖4)，ZOE礦化組內(nèi)僅有散在礦化結(jié)節(jié)形成，ERS礦化組有中等量礦化結(jié)節(jié)形成，陽性對照組和SBS礦化組染色和鏡下觀察均可見大量紅染結(jié)節(jié)。用氯化十六烷基吡啶對礦化第28 天各組封閉劑礦化結(jié)節(jié)充分溶解染色后進行半定量法檢測(圖5)，數(shù)據(jù)分析顯示ZOE和ERS組鈣化低于陽性對照組(ZOE：D562 nm= 0.180±0.050,ERS：D562 nm= 2.968±0.201)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，SBS組略高于陽性對照組(SBS：D562 nm= 3.623±0.039,陽性對照組：D562 nm= 3.477±0.102)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。3種封閉劑浸提液對hPDLCs礦化結(jié)節(jié)形成的作用為ZOE

3 討論

影響材料生物相容性的原因包括組成成分、溶解成分、固化特性、固化后穩(wěn)定性、材料與根尖周組織接觸面積等。本研究中ZOE不同固化時間浸提液作用下均出現(xiàn)細(xì)胞不規(guī)則卷曲、死亡，相對增殖率低于30%，具有嚴(yán)重細(xì)胞毒性。ZOE主要由氧化鋅粉和丁香油調(diào)制而成，與組織液接觸后可逐漸溶解，并釋放甲醛、丁香油[3]。許多研究報道含有丁香油的根管封閉劑具有長期細(xì)胞毒性，其機制可能為芳香環(huán)上所含的極性基團與某些酶的活性基團結(jié)合，破壞細(xì)胞正常的代謝功能，從而影響了細(xì)胞的生長。此外，ZOE中持續(xù)發(fā)揮防腐、殺菌作用的納米銀成分，會對鼠成纖維細(xì)胞 L929 產(chǎn)生細(xì)胞毒性[9]。

ERS浸提液的細(xì)胞毒性結(jié)果顯示，僅固化24 h的浸提液具有輕微細(xì)胞毒性，結(jié)果與之前研究相符。ERS固化初期的毒性可能與其釋放微量甲醛、環(huán)氧樹脂(雙酚A-二環(huán)氧丙酯醚)及固化劑四氮六甲環(huán)(hexamethylenetetramine，HMT)有關(guān)。手工調(diào)和的封閉劑不可避免地會出現(xiàn)不均一或表面出現(xiàn)孔隙的情況，可能釋放部分樹脂單體，研究認(rèn)為樹脂單體具有細(xì)胞毒性和致突變性； HMT由甲醛和氨組成，混合在水溶液或酸環(huán)境下可再分解成甲醛和氨，在固化初期具有高細(xì)胞毒性[10]。隨著固化時間延長，可溶解、降解的成分減少，聚合轉(zhuǎn)化率增高，毒性影響亦隨之減弱消退相關(guān)。Eldeniz等[11]的研究得出ERS的甲醛釋放量隨固化后而降低，與材料毒性隨固化時間延長而減弱的趨勢一致。

硅酮類根管封閉劑SBS顯示出良好的生物相容性。本實驗結(jié)果顯示，其固化24 h、1周和2周的浸提液對hPDLCs的增殖均無明顯影響，甚至在某些測定點發(fā)現(xiàn)輕微促細(xì)胞增殖的作用，相似的結(jié)果也出現(xiàn)于對小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體(mouse embryo osteoblast precursor，MC3T3-E1)的研究和另一種硅酮類封閉劑GuttaFlow的體外實驗[12-14]。許多文獻亦報道SBS僅有輕微或無細(xì)胞毒性。A1-Awadhi等[15]從細(xì)胞凋亡方面進行研究，結(jié)果顯示SBS誘使MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的活性顯著低于其他封閉劑，提示暴露于自混型SBS浸提液中的細(xì)胞增殖機制未受影響。SBS不抑制細(xì)胞增殖的原因可能與其穩(wěn)定的性質(zhì)相關(guān)，其主要成分聚二甲硅氧烷是修復(fù)科的常用材料，具有良好的生物相容性；在室溫下發(fā)生硅氫交聯(lián)反應(yīng)無副產(chǎn)物生成；參照《牙科牙根管充填材料》，標(biāo)準(zhǔn)號ISO 6876-2001所進行的試驗結(jié)果顯示，溶解度僅為0%～0.5%，意味著溶解、降解到周圍組織中的成分少、濃度低[5]。

在臨床運用中，固化材料的溶解、降解物與根尖周組織接觸的濃度隨時間逐漸降低的原因是由于體內(nèi)不同細(xì)胞類型的廣泛存在，并且機體自我免疫調(diào)節(jié)具有持續(xù)清除刺激的能力造成的[16]。本研究中選擇已無明顯細(xì)胞毒性的浸提液進行礦化實驗的原因為：(1)模擬臨床使用中材料經(jīng)機體自我免疫調(diào)節(jié)清除后處于非急性毒性的情況；(2)避免材料高細(xì)胞毒性導(dǎo)致細(xì)胞死亡而無法評價其對礦化的影響。Bryan等[17]觀察到ERS、鈣硅基質(zhì)封閉劑第6周的浸提液對MC3T3-E1細(xì)胞無細(xì)胞毒性，并進一步分析了其對MC3T3-E1細(xì)胞成骨潛能的影響。

ALP被普遍認(rèn)為是成骨細(xì)胞/成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化成熟和成骨、成牙骨質(zhì)功能的標(biāo)志酶[18]，hPDLCs其中一種亞型即是成骨樣細(xì)胞，因此ALP活性的改變可以衡量hPDLCs的細(xì)胞狀態(tài)及成骨能力，而礦化結(jié)節(jié)的形成是細(xì)胞具備成骨、成牙骨質(zhì)特性的另一有力證據(jù)，可用來衡量誘導(dǎo)后體外培養(yǎng)的hPDLCs的增殖分化和礦化潛能[2]。本研究中，ZOE組ALP活性低，持續(xù)時間短；礦化結(jié)節(jié)形成量顯著低于各組，且出現(xiàn)細(xì)胞衰減死亡，提示ZOE影響hPDLCs的細(xì)胞狀態(tài)，降低其向成骨或成牙骨質(zhì)方向轉(zhuǎn)化的能力，原因可能與ZOE溶解釋放甲醛相關(guān)。研究表明，甲醛顯著降低實驗鼠的ALP活性水平[19]，可釋放甲醛的根管封閉劑顯著抑制人成骨細(xì)胞的ALP的活性及 mRNA的表達，可能是根管封閉劑引起骨吸收的機制之一[20]。

A, positive control group；B, zinc oxide and eugenol based sealers osteogenic medium，arrow shows the dead zone；C, epoxy resin sealers osteogenic medium；D, silicone based sealers osteogenic medium .

圖4 礦化誘導(dǎo)第28天茜素紅染色結(jié)果(×200)
Figure 4 Alizarin red S staining of hPDLCs cultured with different medium at day 28(×200)

*P<0.05, vs. control group； ZOE, zinc oxide and eugenol based sea-lers； ERS, epoxy resin sealers； SBS, silicone based sealers；Con, control group.

圖5 礦化誘導(dǎo)第28 天半定量法測量結(jié)果
Figure 5 Quantitative detection of calcification deposition of hPDLCs cultured with different medium at day 28

ERS組ALP活性及礦化能力均低于對照組，表明牙周膜細(xì)胞的分化可能對微環(huán)境變化非常敏感，固化2周內(nèi)的ERS雖不抑制細(xì)胞增殖，但存活的細(xì)胞并非完全處于健康狀態(tài)，表現(xiàn)為ALP活性的降低，可能影響hPDLCs向成骨方向分化及礦化能力。本結(jié)果與以往有關(guān)ERS在組織礦化、修復(fù)中的影響的體內(nèi)研究有一定的相關(guān)性。Kim[21]的研究表明，ERS上調(diào)了MC3T3細(xì)胞的促炎細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β的水平，提高了骨炎性因子RANKL，COX-2的表達，降低了成骨相關(guān)分子BMP-2，BMP-7和Runx-2的水平。牙周膜細(xì)胞與成骨細(xì)胞在功能和特征上有著相似性，因此推測ERS在hPDLCs細(xì)胞分化及礦化中發(fā)揮類似作用，即通過上調(diào)促炎細(xì)胞因子及骨炎性因子的表達，降低成骨相關(guān)分子的水平，影響細(xì)胞向成骨方向分化，降低成骨標(biāo)志物ALP活性和礦化能力，從而延緩細(xì)胞外基質(zhì)的礦化[22]。對實驗犬的組織學(xué)研究顯示，ERS組根尖礦化組織的形成低于SBS組[23]。將ERS植入小型豬下頜骨4周后產(chǎn)生嚴(yán)重炎性反應(yīng)，觀察到壞死骨片[1]。對根尖周病變患牙進行回顧性分析，結(jié)果顯示6個月復(fù)查時ERS恰填充組和超填充組的成功率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，4年后復(fù)查差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示ERS超填不阻止但延緩根尖周組織的愈合[24]。

SBS各組ALP活性與礦化結(jié)節(jié)形成量一致，均高于ERS 組，與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示SBS不抑制hPDLCs向成骨方向分化。研究表明，硅酮類根管封閉劑的炎性因子釋放量等同于陰性對照組[12]，提示其對細(xì)胞的增殖、分化無抑制作用，從而不影響ALP活性及礦化能力。Leonardo等[23]對實驗犬的32個牙根進行根備，用SBS和牙膠熱垂直加壓充填，90 d后觀察到43.8%的實驗牙根尖有礦化組織形成，56.2%的實驗牙根尖部分閉合，結(jié)締組織正常，牙周膜正常或輕微改變，無牙骨質(zhì)或骨組織吸收。SBS良好的生物相容性是hPDLCs礦化潛能實現(xiàn)的基礎(chǔ)，有利于根尖周組織的修復(fù)再生。

本體外研究結(jié)果表明：ZOE顯著抑制hPDLCs細(xì)胞增殖，且影響持續(xù)。ERS固化早期抑制細(xì)胞增殖，并可能影響hPDLCs的分化及礦化潛能。SBS固化后不抑制hPDLCs細(xì)胞增殖、分化及礦化潛能，與ZOE和ERS相比具有更好的生物相容性，全面的評價還有待體內(nèi)實驗的進一步研究。本研究提示在根管充填選擇根管封閉劑時，不僅要考慮材料的封閉性能，還要考慮到不同種類的材料對根尖周組織生物活性的影響，尤其是對于有根尖病變的病例。

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(2014-12-01收稿)

(本文編輯：劉淑萍)

Effect of root canal sealers on biocompatibility of human periodontal ligament cells

HU Jia1,2，ZOU Xiao-ying1，ZHUANG Heng1△，GAO Xue-jun1

(1. Department of Cariology and Endodontology, Peking University School and Hospital of Stomatology & National Enginee-ring Laboratory for Digital and Material Technology of Stomatology & Beijing Key Laboratory of Digital Stomatology, Beijing 100081, China; 2. School of Stomatology，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350002， China)

Objective：To compare the effects of three root canal sealers with respect to time on biocompatibility of human periodontal ligament cells (hPDLCs).The sealers included zinc oxide and eugenol based sealers (ZOE), epoxy resin sealers (ERS) and silicone based sealers (SBS). Methods: hPDLCs were primarily cultured,with the method combining of tissue explant and enzymatic digestion. The cells were then exposed to different extract fluids：(1)ZOE extracted for 24 h group ；(2)ZOE extracted for 1 week group；(3)ZOE extracted for 2 weeks group；(4)ERS extracted after 24 h group；(5)ERS extracted after 1 week group；(6)ERS extracted after 2 weeks group；(7)SBS extracted after 24 h group；(8)SBS extracted after 1 week group；(9)SBS extracted after 2 weeks group；(10)Dulbecco modified Eagle’s medium/F12(DMEM/F12)as negative control group. Cell morphology was observed under an inverted microscope.Cell proliferation was measured by methyl-thiazol-diphenyltetrazolium (MTT)assay.ALP assay kit was used for measuring alkaline phosphatase (ALP) activity. Sealers of 2 weeks’ setting time were then immersed in an osteogenic medium for examination of mineral nodules and calcium deposits. Results: Considering the relative growth rate(RGR),ZOE was severely to moderately cytotoxic(RGR:13.6%-39.9%),while ERS was slightly or not cytotoxic (RGR: 87.6%-95.3%).Only SBS did not show any cytotoxicity after setting (RGR: 91.8%-106.7%). The setting time influenced the cytotoxicity of ERS which decreased after 1 week. Considering the ALP activity,there was no difference between SBS group and control group(F=3.397，P=0.053). According to the results of calcium deposits, ZOE：D562 nm= 0.180±0.050,ERS：D562 nm= 2.968±0.201,SBS：D562 nm= 3.623±0.039,Control：D562 nm= 3.477±0.102,the ranking of ALP activity and calcium deposits was as follows: ZOE

Root canal sealer; Periodontal ligament; Cells, cultured; Cell proliferation; Tooth remineralization

時間：2016-05-12 13：41：03

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160512.1341.042.html

R783.1

A

1671-167X(2016)05-0871-07

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.05.023

△Corresponding author’s e-mail, doctorzhuang@163.com