何平，閔柳暢，張蓓茹，楊旭，蘇曉曉，李德天

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽(yáng) 110004）

·論著·

氯沙坦減輕梗阻性腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化及腎小管上皮細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究

何平，閔柳暢，張蓓茹，楊旭，蘇曉曉，李德天

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽(yáng) 110004）

目的 探討氯沙坦對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型腎小管上皮細(xì)胞凋亡和腎間質(zhì)纖維化的影響及其可能機(jī)制。方法通過結(jié)扎并離斷大鼠單側(cè)輸尿管制作梗阻性腎病模型，對(duì)照組進(jìn)行假手術(shù)。留取術(shù)后第3，5，7及14天腎臟組織及血尿標(biāo)本。結(jié)果 單側(cè)輸尿管梗阻使α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)水平明顯增加，并導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化和腎組織細(xì)胞凋亡明顯增加。腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展伴隨著STAT3的磷酸化和2種凋亡相關(guān)蛋白（Bax和Bcl-2）的表達(dá)改變。氯沙坦干預(yù)治療可以減少這些變化。結(jié)論 在單側(cè)輸尿管梗阻的大鼠模型中，氯沙坦能緩解腎臟纖維化及腎小管細(xì)胞的凋亡程度。這種療效可能是通過部分阻滯STAT3信號(hào)通路完成的。

腎間質(zhì)纖維化；細(xì)胞凋亡；氯沙坦；STAT3信號(hào)通路；凋亡相關(guān)蛋白

腎小管間質(zhì)纖維化是終末期腎病的共有階段，特點(diǎn)是腎臟成纖維細(xì)胞的增生與異常激活［1～4］。上尿路梗阻對(duì)腎臟的影響巨大，并且是兒童及成年人腎功能不全的一個(gè)重要原因［5］。即使及時(shí)的手術(shù)治療尿道梗阻仍然可能有不可逆的腎單位損傷。腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)的抑制劑是否可以減輕腎間質(zhì)的纖維化及腎小管上皮細(xì)胞的凋亡仍有爭(zhēng)議。本研究的目的在于評(píng)估梗阻性腎病大鼠模型中氯沙坦對(duì)腎纖維化進(jìn)展及腎小管細(xì)胞凋亡的影響并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 單側(cè)輸尿管梗阻模型制作和氯沙坦治療

飼養(yǎng)在盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心的健康成年雄性大鼠，在恒溫、相同光照下（光照周期為7時(shí)至18時(shí)），食物和水隨機(jī)提供。通過中線切口暴露腹腔，分離左側(cè)輸尿管并結(jié)扎離斷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為2部分。第1部分實(shí)驗(yàn)分為5組。對(duì)照組（Sham組）的動(dòng)物用同樣的手術(shù)步驟但不結(jié)扎輸尿管。另外4組（統(tǒng)稱模型組）大鼠分別在結(jié)扎輸尿管后的第3，5，7，14天被處死（分別為UUO3 d組，UUO5 d組，UUO7 d組和UUO14 d組）。第2部分實(shí)驗(yàn)分為4組。對(duì)照組（Sham組），Sham+氯沙坦組，UUO7 d組，UUO7 d+氯沙坦組。氯沙坦溶解在水中通過灌胃法給予大鼠［4］。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有大鼠麻醉后留取腎臟做免疫印跡分析或者組織學(xué)檢查。

1.2 腎臟的形態(tài)學(xué)觀察

標(biāo)本固定后脫水，石蠟包埋，切片（4 μm），馬松三色染色后，光鏡下觀察腎臟形態(tài)。藍(lán)色顆粒和線性沉淀為膠原蛋白染色陽(yáng)性。染色結(jié)果采用計(jì)算機(jī)圖像定量分析。

1.3 免疫印跡分析

組織樣本等量上樣。凝膠電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉后，分別加入STAT3、p-STAT3一抗（1∶1 000稀釋，Cell Signaling公司）、Bcl-2（1∶500稀釋，Santa Cruz公司）、Bax（1∶500稀釋，Santa Cruz公司）、α-SMA及Ⅰ型膠原蛋白（1∶1 000稀釋，Sigma公司）4℃搖床孵育過夜。加入相應(yīng)二抗，進(jìn)行ECL反應(yīng)。一次性完成定影、顯形、圖像分析系統(tǒng)測(cè)定條帶的灰度值。

1.4 TUNEL檢測(cè)

圖1 模型組腎臟α-SMA及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)Fig.1 Effect of UUO on the expression levels of renal typeⅠcollagen and α-SMA in the kidneys of rats subjected to UUO

腎組織石蠟切片厚約3 μm，按試劑盒所示步驟進(jìn)行操作。凋亡細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)：每張切片隨即選10個(gè)高倍視野（×400），分別檢測(cè)每個(gè)高倍視野內(nèi)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，求出平均每個(gè)高倍鏡視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，比較其均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 單側(cè)輸尿管梗阻導(dǎo)致腎臟細(xì)胞凋亡及α-SMA及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)增加

Sham組大鼠腎臟的α-SMA表達(dá)水平可忽略不計(jì)。在模型組的表達(dá)水平明顯增加，第3天是Sham組的3倍，第14天是Sham組的9倍，見圖1。Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)水平也呈時(shí)間依賴性遞增的趨勢(shì)。Sham組腎臟無細(xì)胞凋亡。單側(cè)輸尿管梗阻3 d與Sham組相比，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多。TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)隨著梗阻時(shí)間的增長(zhǎng)而持續(xù)增加，見圖2。

圖2 單例輸尿管梗阻導(dǎo)致腎臟細(xì)胞凋亡 ×400Fig.2 UUO lead to renal cell apoptosis×400

2.2 氯沙坦抑制梗阻性腎病STAT3的磷酸化

圖3 模型組腎臟STAT3的磷酸化水平Fig.3 Effect of UUO on the phosphorylation levels of STAT3

模型組腎臟中STAT3的磷酸化水平隨著時(shí)間的增加而提高，見圖3。其磷酸化水平在第14天的時(shí)候是對(duì)照組的9倍。氯沙坦的干預(yù)治療在第7天很大程度上降低了STAT3的磷酸化水平，見圖4。

圖4 氯沙坦干預(yù)后STAT3的磷酸化水平Fig.4 Effect of losartan on the expression and phosphorylation levels of STAT3 following UUO

2.3 氯沙坦抑制腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展

圖5 氧沙坦抑制腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展 ×400Fig.5 Effect of losartan on renal fibrosis×400

Masson染色（圖5）顯示，第7天的單側(cè)輸尿管梗阻的腎臟與Sham組相比間質(zhì)纖維化水平明顯增加。氯沙坦的治療顯著降低了纖維化水平。定量分析顯示，Sham組的腎間質(zhì)纖維化體積為（1.5± 0.5）%，模型組的腎間質(zhì)纖維化體積為（15.7±3.2）%，氯沙坦干預(yù)后腎間質(zhì)纖維化體積減少為（10.1± 1.8）%。α-SMA及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平也被氯沙坦部分抑制，見圖6。

2.4 氯沙坦抑制梗阻性腎病腎小管細(xì)胞的凋亡和凋亡蛋白的表達(dá)

氯沙坦的應(yīng)用能部分減輕腎小管上皮細(xì)胞凋亡，見圖7。同Sham組相比，梗阻7 d后Bax的表達(dá)水平明顯增高，Bcl-2的表達(dá)水平有所下降。應(yīng)用氯沙坦干預(yù)治療后，Bax的表達(dá)水平較前下降，Bcl-2的表達(dá)水平有所上升，見圖8。

圖6 氯沙坦抑制α-SMA及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)Fig.6 Effect of losartan on the expression levels of α-SMA and typeⅠcollagen

圖7 氯沙坦抑制梗阻性腎病腎小管細(xì)胞凋亡 ×400Fig.7 Effect of losartan on the levels of renal tubular cell apoptosis×400

圖8 氯沙坦抑制梗阻性腎病凋亡蛋白Bax，Bcl-2的表達(dá)Fig.8 Effect of losartan on the levels of Bax，Bcl-2

3 討論

本研究結(jié)果表明，氯沙坦能抑制輸尿管梗阻腎臟腎纖維化的增加，并減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)。之前的研究表明，α-SMA激活的肌纖維母細(xì)胞是主要的效應(yīng)細(xì)胞，是纖維化腎臟中細(xì)胞外基質(zhì)沉積的原因。本研究的數(shù)據(jù)表明，應(yīng)用氯沙坦能減輕單側(cè)輸尿管梗阻性腎病腎間質(zhì)纖維化和α-SMA及Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)水平。腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展是一個(gè)復(fù)雜的過程，與多種細(xì)胞的信號(hào)通路和分子因素有關(guān)［6］。本研究表明，在梗阻后的第3天，STAT3蛋白的磷酸化明顯增加，直到第14天達(dá)到頂峰。說明STAT3的磷酸化在介導(dǎo)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化和腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展中的重要性。數(shù)據(jù)還清楚地表明了氯沙坦干預(yù)治療能部分減弱STAT3信號(hào)通路活化及單側(cè)輸尿管梗阻造成的腎間質(zhì)纖維化。本研究也表明，與Sham組大鼠的腎臟相比，在單側(cè)輸尿管梗阻誘導(dǎo)的腎損傷的腎臟中Bax/Bcl-2的比率（促凋亡信號(hào)）增高，腎臟組織凋亡細(xì)胞明顯增加。

本研究證實(shí)了Manucha等［7］的研究結(jié)果，其研究結(jié)果表明在梗阻性腎病的大鼠模型中，氯沙坦有減少Fas配體的表達(dá)水平及抗細(xì)胞凋亡的療效。本研究的細(xì)胞凋亡結(jié)果也由氯沙坦對(duì)STAT3信號(hào)通路的影響證實(shí)。

慢性腎臟病的發(fā)病率和患病率在世界范圍內(nèi)不斷增加，其治療的主要目的是防止或減緩疾病的進(jìn)展［8］。本研究結(jié)果提供了血管緊張素受體拮抗劑在減緩慢性腎臟病進(jìn)展中作用的證據(jù)。結(jié)果表明在單側(cè)輸尿管梗阻的大鼠模型中氯沙坦能有效地減慢腎間質(zhì)纖維化和細(xì)胞凋亡的水平。氯沙坦的抗纖維化作用及抗凋亡與STAT3信號(hào)通路的抑制有關(guān)。

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（編輯 于 溪）

Mechanism ofLosartan on RenalInterstitialFibrosisand RenalTubular EpithelialCellApoptosisin Ratswith Obstructive Nephropathy

HE Ping，MINLiu-chang，ZHANGBei-ru，YANGXu，SUXiao-xiao，LIDe-tian
（DepartmentofNephrology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

Objective To investigate the effects of losartan on renal tubular cell apoptosis and renal fibrosis in a rat model of UUO，and explore the related mechanism.Methods Rats were subjected to UUO by ureteral ligation and treated with dimethyl sulfoxide（control）or losartan.Controls were given sham operations.Renaltissues were collected 3，5，7，and 14 days aftersurgery formeasurementofvarious indicators ofrenalfibrosis.Re?sults UUO increased the expression ofα-SMA and collagenⅠ，and improved the extentofrenaltubularfibrosis and apoptosis in a time-dependent manner.Losartan treatment partially reversed these effects.Progression of renal interstitial fibrosis was accompanied by phosphorylation of signal transducerand activatoroftranscription 3（STAT3）and altered expression oftwo-apoptosis-related proteins（Bax and Bcl-2）.Losartan treatmentalso partially reversed these effects.Conclusion Our results indicate that losartan attenuates renal fibrosis and renal tubular cell apoptosis in a rat modelofUUO.Thiseffectappears to be mediated by partialblockage ofSTAT3 phosphorylation.

renal interstitial fibrosis；cell apoptosis；losartan；STAT3 signal pathway；apoptosis-related proteins

R695.1

A

0258-4646（2016）02-0136-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.02.009

遼寧省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（L2013295）；遼寧省博士科研啟動(dòng)基金（201501005）

何平（1978-），女，副教授，博士.

李德天，E-mail：lidetian@sj-hospital.org

2015-05-05

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：