王子超，趙麗娟

（遼寧醫(yī)學院1.研究生學院；2.附屬第三醫(yī)院消化內科，遼寧 錦州 121000）

·論著·

姜黃素對NAFLD大鼠肝組織PPAR-γ和NF-κB p65mRNA及蛋白表達的影響

王子超1，趙麗娟2

（遼寧醫(yī)學院1.研究生學院；2.附屬第三醫(yī)院消化內科，遼寧 錦州 121000）

目的 研究姜黃素對高脂誘導的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）中肝過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）和核因子κB（NF-κB）p65 mRNA及蛋白表達的影響。方法 建立大鼠NAFLD模型，按照隨機化原則分為5組：正常組、模型組、低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組。正常組給予普通飲食，其余4組給予高脂飲食，同時分別用羧甲基纖維素鈉（CMC）和低、中、高劑量姜黃素進行治療。持續(xù)治療12周后，處死各組大鼠并進行處理分析。血清生物化學方法檢測大鼠血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）的含量；HE染色對大鼠肝組織進行病理學觀察；免疫組織化學檢測大鼠肝組織PPAR-γ和NF-κB p65蛋白的表達情況；RT-PCR檢測PPAR-γ和NF-κB p65mRNA的表達情況。結果 治療組（低、中、高劑量）大鼠血清中ALT、AST、TG、TC含量較模型組明顯降低（P＜0.05）。治療組（低、中、高劑量）大鼠肝組織的脂肪變性程度較模型組明顯減輕。與正常組比較，模型組肝組織PPAR-γmRNA及蛋白的表達水平均明顯降低（P＜0.05），而NF-κB p65mRNA及蛋白的表達水平均明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，治療組（低、中、高劑量）大鼠肝組織PPAR-γ的表達明顯增加（P＜0.05），PPAR-γ的表達水平以高劑量治療組升高更加明顯（P＜0.01）；與模型組相比，治療組（低、中、高劑量）大鼠肝組織NF-κB p65的表達顯著減少（P＜0.05），NF-κB p65的表達水平以高劑量治療組降低更加明顯（P＜0.01）。結論 姜黃素可明顯減輕高脂誘導的大鼠NAFLD肝組織的脂肪變性和炎性反應，其抗脂肪變性和抗炎的機制可能與姜黃素激活PPAR-γ的表達，從而抑制NF-κB p65的活性有關。PPAR-γ和NF-κB p65的表達參與了NAFLD的發(fā)生發(fā)展，控制這些信號分子的表達可能是姜黃素治療NAFLD的重要機制之一。

姜黃素；非酒精性脂肪性肝病；過氧化物酶體增殖物激活受體γ；核因子κB p65

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指非過量飲酒所引起的一組肝臟疾病的總稱，通常與肥胖、2型糖尿病和代謝綜合征密切相關。NAFLD的發(fā)病機制復雜，涉及氧化應激、脂毒性、線粒體損傷、胰島素抵抗和炎性反應。過量的脂肪攝入會增加肝臟脂質大量生成和脂肪重新合成，影響胰島素信號通路，從而促進肝臟甘油三酯的積累，最終導致NAFLD的發(fā)生［1］。NAFLD的病理特征以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變?yōu)橹?，包括單純性脂肪性肝病、脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、脂肪性肝纖維化和肝硬化。在過去的20年里，NAFLD的患病率已明顯增加，它反映了一個重大的公共健康問題。流行病學［2］表明，NAFLD的患病率在成人和兒童中不斷增加，為3%～10%，尤其在肥胖兒童中，其患病率上升到了40%～70%。因此引起了研究者越來越多的關注。

姜黃素是一種從姜黃根莖中提取的天然黃色多酚，姜黃生長在地球熱帶和亞熱帶地區(qū)，在許多亞洲國家被廣泛用于食品制作。除了烹飪用途外，由于姜黃素有抗氧化、抗炎，抗突變，抗菌，抗癌等特性，因此在一些國家的傳統(tǒng)醫(yī)學中被認為是一種草藥。姜黃素已被證明是一種影響許多炎性分子靶點作用的多效性分子。姜黃素對各種疾病的作用性質已被許多研究所證實。體外和體內研究［3］表明姜黃素在許多慢性疾?。ㄈ缪装Y性腸病、關節(jié)炎、胰腺炎、慢性前葡萄膜炎和癌癥等）中可能是一種潛在的治療劑。先前的體內研究［4］也使用不同的動物模型證明姜黃素對NAFLD的保護和治療潛力。本實驗研究姜黃素對NAFLD大鼠肝組織PPAR-γ和NF-κB p65表達的影響，旨在為治療NAFLD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：普通級健康雄性SD大鼠36只，體質量（200±20）g，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于遼寧醫(yī)學院科技樓動物房，溫度20～25℃，12 h晝夜交替，按實驗要求飼養(yǎng)。

1.1.2 主要藥品與試劑：膽固醇（批號Y140306）購于安徽科寶生物工程有限公司，豬油于市場購買，三號膽鹽（批號20140416）購于北京奧博星生物技術有限責任公司，姜黃素購于天津市光復精細化工研究所，羧甲基纖維素鈉（CMC）購于天津市光復精細化工研究所，甲醛溶液購于沈陽天罡化學試劑廠，RT-PCR試劑盒（編號：RR047O）購于大連寶生物工程有限公司，PPAR-γ（sc-7273）抗體、NF-κB p65（ZS-8008）抗體購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器：PCR分析儀（型號：TC-512）購于英國TECHNE公司，全自動凝膠成像系統(tǒng)（型號：Gene Genius Match systems）購于英國SYNGENE公司。其他儀器有電子天平（型號MP200A）、離心機、高壓鍋、電磁爐、微波爐、萊卡DMI4000顯微鏡和電泳儀。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立與給藥：將36只大鼠用普通正常飼料適應性喂養(yǎng)1周后，對每只大鼠進行編號，按照隨機化原則分為5組，正常組（8只），普通正常飼料喂養(yǎng)；其余28只均分為4組：模型組和姜黃素低、中、高劑量治療組，此4組給予高脂飲食（高脂飼料組成：87.5%基礎飼料、10%豬油、2%膽固醇、0.5%膽鹽）。12周后，每組分別處死1只大鼠，觀察大鼠NAFLD造模情況，造模過程中正常組大鼠死亡1只。肝組織病理學方法證明造模成功后，各組大鼠繼續(xù)按照原方式喂養(yǎng)，同時治療組大鼠按不同藥物劑量［姜黃素（25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg）溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC）配成混懸液］分為低、中、高劑量組。每天在固定時間分別對低、中、高劑量治療組大鼠進行灌胃治療（按0.8 mL/100 g體質量給藥），正常組和模型組給予相應體積的0.5%CMC進行灌胃治療。持續(xù)治療12周，最后1次給藥后禁食不禁水，次日上午稱量體質量后，腹腔注射水合氯醛（0.3 mL/100 g體質量）麻醉。下腔靜脈取血后，將一部分肝組織經(jīng)液氮冷凍后保存于-80℃冰箱中備用，另一部分肝組織放于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色作病理形態(tài)學觀察和免疫組織化學染色。

1.2.2 血清生物化學指標測定：全自動生物化學分析儀檢測分析大鼠血清中的谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、甘油三酯（triglyceride，TG）和總膽固醇（total cholesterol，TC）。

1.2.3 組織病理學觀察：大鼠的肝組織10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色后用光學顯微鏡進行觀察。

1.2.4 免疫組織化學檢測肝組織中PPAR-γ和NF-κB p65的表達：Envision兩步法檢測肝組織中PPAR-γ和NF-κB p65的表達，方法如下，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；用pH6.0枸櫞酸緩沖液高壓修復抗原，PBS洗5 min，共3次；3%過氧化氫溶液滅活內源性過氧化物酶，PBS洗5 min，共3次；滴加適當濃度一抗（1∶100稀釋），4℃孵育過夜，PBS洗5 min，共3次；滴加二抗IgG多聚體，37℃孵育30 min，PBS洗5 min，共3次；DAB顯色；蘇木素復染，脫水，透明，封片，光鏡下觀察。根據(jù)陽性細胞的百分比和染色強度，參照文獻［5］的判定標準來測定。

1.2.5 RT-PCR方法檢測肝組織中PPAR-γ和NF-κB p65 mRNA的表達：每只大鼠取100 mg組織加入Ep管中，用剪刀剪碎，加入Trizol溶液（1 mL）提取總RNA，以總RNA為模板，逆轉錄合成cDNA，以適量的cDNA為模板，以β-肌動蛋白（β-actin）為內部參照，PCR擴增PPAR-γ和NF-κB p65基因片段。應用兩步法試劑盒進行，反應體系為20 μL，42℃2 min，4℃。PCR反應參數(shù)設置：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃終止反應。采用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，應用全自動凝膠成像系統(tǒng)進行拍照檢測，采用Gene Tool軟件對條帶進行分析，用目的基因與內參基因吸光度的比值來表示結果，見表1。

表1 引物設計Tab.1 Primer design

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 血清肝功能和血脂指標分析

與正常組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST、TG和TC含量均明顯增加（P＜0.05）。與模型組相比，姜黃素（低、中、高劑量）治療組大鼠血清中ALT、AST、TG和TC含量均明顯減少（P＜0.05），其中高劑量治療組含量減少最明顯（P＜0.01），見表2。

2.2 肝組織的病理形態(tài)學變化

HE染色可見正常組大鼠肝小葉結構完整，肝索排列整齊，肝細胞形態(tài)規(guī)則，無脂肪變性及炎癥壞死情況；模型組大鼠肝小葉邊界模糊，肝索結構紊亂，肝細胞脂肪變性，可見大小不等的空泡變性，炎癥壞死明顯；與模型組相比，治療組大鼠肝小葉結構變清晰，肝細胞排列呈條索狀，脂肪變性明顯減輕，以姜黃素高劑量治療組更加明顯，差異顯著，見圖1。

2.3 免疫組織化學法測定PPAR-γ和NF-κB p65的表達

表2 不同劑量姜黃素對大鼠血清ALT、AST、TG和TC的影響（）Tab.2 Effect of different doses of curcumin on serum ALT，AST，TG and TC（）

表2 不同劑量姜黃素對大鼠血清ALT、AST、TG和TC的影響（）Tab.2 Effect of different doses of curcumin on serum ALT，AST，TG and TC（）

1）P＜0.05 vs normal group；2）P＜0.05，3）P＜0.01 vs model group.Cur-L，low dose curcumin group；Cur-M，middle dose curcumin group；Cur-H，high dose curcumin group.

Group n ALT（IU/L） AST（IU/L） TG（mmol/L） TC（mmol/L）Normal 6 79.00±10.54 148.00±11.53 0.28±0.07 1.06±0.08 Model 6 172.50±8.261） 320.50±10.971） 0.71±0.121） 2.27±0.091）Cur-L 6 101.00±8.892） 299.00±8.542） 0.46±0.112） 2.05±0.092）Cur-M 6 88.00±12.532） 232.00±7.812） 0.38±0.082） 1.34±0.072）Cur-H 6 79.5±11.263） 199.50±9.843） 0.32±0.123） 1.32±0.113）

圖1 大鼠肝組織 HE×200Fig.1 Optical micrographs of rat liver tissues HE×200

如圖2所示，與正常組比較，模型組肝細胞核內見少量棕色顆粒，表示模型組肝細胞核內PPAR-γ蛋白表達顯著減少；與模型組比較，姜黃素低、中、高劑量治療組肝細胞核棕色顆粒顯著增加（P＜0.05），尤其高劑量治療組PPAR-γ蛋白增加更明顯。姜黃素高劑量治療組PPAR-γ蛋白較低、中劑量治療組增加明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），呈現(xiàn)劑量依 賴關系。見表3。

圖2 大鼠肝組織PPAR-γ免疫組織化學染色 DAB×200Fig.2 Immunohistochemical staining of PPAR-γ in rat liver tissue DAB×200

表3 各組大鼠肝組織PPAR-γ蛋白的表達Tab.3 The expression of PPAR-γ protein in rat liver tissue

與正常組比較，模型組肝細胞胞質和胞核內見大量棕色顆粒，表示模型組肝細胞胞質和胞核內NF-κB p65蛋白表達顯著增加；與模型組比較，姜黃素不同劑量治療組肝細胞胞質棕色顆粒顯著減少（P＜0.05），尤其高劑量治療組NF-κB p65蛋白減少更明顯，表示NF-κB p65蛋白表達降低。姜黃素高劑量治療組NF-κB p65蛋白較低、中劑量治療組降低更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），呈劑量依賴關系，見圖3、表4。

2.4肝組織中PPAR-γ和NF-κB p65 mRNA表達

圖3 大鼠肝組織NF-κB p65免疫組化染色 DAB×200Fig.3 Immunohistochemical staining of NF-κB p65 in rat liver tissue DAB×200

RT-PCR結果表明，模型組大鼠肝組織PPAR-γ mRNA表達較正常組顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，姜黃素治療12周后，各劑量治療組肝組織中PPAR-γmRNA表達明顯增加（P＜0.05），尤其以姜黃素高劑量治療組增加更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與此同時，模型組大鼠肝組織中NF-κB p65mRNA表達較正常組顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，姜黃素各劑量治療組肝組織中NF-κB p65mRNA表達明顯減少（P＜0.05），尤其以高劑量治療組減少更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖4、表5。

3 討論

NAFLD的病因較多，發(fā)病機制至今尚未完全明確，目前有幾個發(fā)病學說，但最為成熟的是“二次打擊”學說。第一次打擊是脂肪變性的發(fā)展，長期營養(yǎng)過剩導致脂質代謝紊亂，引起了游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FAs）和甘油三酯在肝臟的積聚。肝細胞中游離脂肪酸的不斷增加降低了β-氧化，因而又提高了脂肪酸的積聚。第二次打擊是脂肪變性發(fā)展到炎癥和纖維化的階段，由于氧化應激，線粒體功能障礙和炎性細胞因子導致肝細胞炎癥和壞死，并激活纖維化級聯(lián)反應。

表4 各組大鼠肝組織NF-κB p65蛋白的表達Tab.4 The expression of NF-κB p65 protein in rat liver tissue

圖4 大鼠肝組織PPAR-γ和NF-κB p65mRNA的表達水平Fig.4 The mRNA expression level of liver tissue PPAR-γand NF-κB p65

表5 姜黃素對大鼠肝組織PPAR-γ和NF-κB p65mRNA表達的影響（）Tab.5 Effects of curcumin on mRNA expression of PPAR-γ and NF-κB p65 in rat liver tissue（）

表5 姜黃素對大鼠肝組織PPAR-γ和NF-κB p65mRNA表達的影響（）Tab.5 Effects of curcumin on mRNA expression of PPAR-γ and NF-κB p65 in rat liver tissue（）

1）P＜0.05 vs normal group；2）P＜0.05，3）P＜0.01 vs model group.Cur-L，low dose curcumin group；Cur-M，middle dose curcumin group；Cur-H，high dose curcumin group.

Group n NF-KB p65mRNA PPAR-γmRNA Normal 6 0.13±0.04 0.28±0.03 Model 6 0.75±0.051） 0.18±0.031）Cur-L 6 0.61±0.052） 0.29±0.042）Cur-M 6 0.52±0.042） 0.32±0.032）Cur-H 6 0.38±0.043） 0.43±0.033）

PPAR-γ是一種核受體和配體激活的轉錄因子超家族成員之一，激活后可以控制葡萄糖和脂質代謝、脂肪細胞分化、調節(jié)炎性反應。有研究［6］顯示，PPAR-γ可以轉錄調節(jié)脂肪的生成，在脂肪儲存的過程中起著重要作用。一些研究［7，8］表明，PPAR-γ在大鼠模型的過表達可以防止脂肪肝進展，用PPAR-γ激動劑羅格列酮治療已被證明也有類似的效果。PPAR-γ的保護作用可能是由于脂肪組織和骨骼肌對胰島素的敏感性提高，導致肝臟中游離脂肪酸的沉積減少。此外，PPAR-γ表達顯示出在星狀細胞、巨噬細胞和上皮細胞具有抗炎和抗纖維化效果［9］。

Xu等［10］研究表明，姜黃素能顯著誘導PPAR-γ的基因表達和激活PPAR-γ。Zheng等［11］報道指出，姜黃素能夠激活體外活化的肝星狀細胞PPAR-γ的活性，這對減少細胞增殖、誘導細胞凋亡和抑制細胞外基質基因的表達來說十分必要。本研究結果表明，姜黃素可明顯增加PPAR-γ的活性，提高PPAR-γ的表達，從而抑制肝細胞的脂肪變性和壞死凋亡。

NF-κB是一種轉錄因子，能被各種刺激（包括細胞因子、促細胞分裂劑、致癌物質、化療試劑、物理和化學應力、輻射、缺氧和其他炎性刺激等［12～14］）激活。NF-κB在所有細胞的細胞質中處于靜止狀態(tài)，只有激活時才移位到細胞核與相應的基因序列相結合。在靜止狀態(tài)下，NF-κB由p50、p65和IκB組成異源三聚體存在于細胞質中。磷酸化、泛素化以及IκB的降解將會導致p50-p65異源二聚體的活化，然后轉位到細胞核并在相應的基因上結合特定的應答元件，從而對細胞組織產(chǎn)生一定的調節(jié)作用。有研究［15］已經(jīng)證明姜黃素可以下調NF-κB的活性。姜黃素通過抑制IκB激酶和Akt的激活可以下調細胞增殖基因、抗凋亡基因和轉移性基因產(chǎn)物的表達［16］。隨后，其他的研究［17］也表明姜黃素可以通過抑制IκB激酶的激活來下調NF-κB的表達。本研究結果表明，姜黃素可明顯抑制NF-κB p65的活性，降低NF-κB p65的表達，從而減輕炎性反應。由于NF-κB在肝組織的脂肪變性、炎性反應和細胞凋亡中發(fā)揮著重大的作用，因此作為一種基因轉錄調控因子，NF-κB越來越多地引起了研究者的關注。

關于姜黃素激活PPAR-γ后，是否與NF-κB p65相關聯(lián)共同發(fā)揮抗炎作用，有研究［18～20］已證明其內在的關系。本研究結果與之前的研究結果一致。本實驗中模型組大鼠肝組織PPAR-γ表達降低，NF-κB p65表達增高；而姜黃素不同劑量治療組PPAR-γ表達增高，NF-κB p65表達降低，兩者呈明顯的負相關。姜黃素可通過促進PPAR-γ的表達使NF-κB p65的表達明顯降低，干擾NF-κB p65的核轉位，減輕肝細胞的炎性反應和壞死凋亡，從而有助于改善NAFLD的發(fā)生和進展。Kelly等［21］證明，PPAR-γ通過降低NF-κB的活性，可以下調炎癥基因的表達，從而調節(jié)炎癥通路。還有研究［22，23］表明PPAR-γ可以直接與NF-κB的亞基p65/p50相互結合，兩者之間發(fā)生相互作用，形成轉錄抑制復合物，降低NF-κB與DNA元件之間的結合活性，抑制NF-κB DNA的合成，從而抑制它的表達，間接影響了NF-κB對其他轉錄因子的表達，進而對一些炎性因子和蛋白的生成產(chǎn)生影響?？梢?，PPAR-γ與NF-κB p65的聯(lián)系非常緊密，兩者之間相互作用、相互影響，共同調節(jié)機體脂肪肝的發(fā)生、進展。

綜上所述，本研究結果表明姜黃素可以降低NAFLD大鼠血清中ALT、AST、TG和TC的含量，減輕肝細胞的變性壞死。在抑制肝組織脂肪變性的過程中，細胞脂肪變性程度與姜黃素存在著明顯的劑量依賴關系。姜黃素可以調控肝組織中PPAR-γ和NF-κB p65的表達水平，兩者存在著明顯的負相關。姜黃素可以通過抑制NAFLD大鼠肝組織的脂肪變性和炎性反應對NAFLD產(chǎn)生明顯的治療作用，此研究為今后姜黃素治療NAFLD提供了重要的理論依據(jù)。

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（編輯 武玉欣）

Effectsof Curcumin on mRNAand Protein Expression of PPAR-γand NF-κBp65in NAFLD Liver Tissue

WANGZi-chao1，ZHAO Li-juan2

（1.Graduate College，Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China；2.Department of Digestive Disease，The Third Affiliated Hospital，Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China）

Objective To investigate the effects of curcumin on mRNA and protein expression of hepatic peroxisome proliferator activated receptor gamma（PPAR-γ）and nuclear factor kappa B（NF-κB）p65 in rats with high-fat induced nonalcoholic fatty liver disease（NAFLD）.Methods NAFLD model was established in rats.The rats were randomly divided into five groups：normal group，model group，low dose group，middle dose group and high dose treatment group.Normal group was given ordinary diet，and the remaining four groups were fed with high fat diet，while the rats were treated with sodium carboxymethyl cellulose（CMC）and low，medium and high dose curcumin.After twelve weeks of treatment，the rats were sacrificed and effects ofthe treatmentwere analyzed.The contentin serum ofratwas detected foralanine transaminase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），triglyceride（TG）and total cholesterol（TC）by biochemistry method.Pathological changes of liver tissue were observed in rats by HE staining.Expression ofPPAR-γand NF-κB p65 protein was detected in livertissue ofratsby immunohistochemistry.Expression of PPAR-γand NF-κB p65mRNA was detected by RT-PCR method.Results The contents of ALT，AST，TG and TC in the serum of the treatment group were significantly lowerthan those in the modelgroup（P＜0.05）.The hepatic steatosis in treatmentgroup wassignificantly lowerthan thatin modelgroup.Compared with normalgroup，the mRNAand protein expression levels ofPPAR-γin the modelgroup were significantly decreased（P＜0.05），while themRNA and protein expression levels of NF-κB p65 were significantly increased（P＜0.05）.Compared with the model group，the expression of PPAR-γ in livertissue of the treatment group was significantly increased（P＜0.05），and the expression level of PPAR-γ was significantly higherin high dose group（P＜0.01）.Compared with the modelgroup，the expression ofNF-κBp65 in livertissue ofthe treatmentgroup was significantly decreased（P＜0.05），and the expression ofNF-κB p65 in high dose treatmentgroup decreased more significantly（P＜0.01）.Conclusion Curcumin can significantly reduces high-fat induced hepatic steatosis and inflammation reaction in rats，and the mechanism of its anti hepatic steatosis and anti-inflammation may be that curcumin enhances the expression of PPAR-γ and inhibits the activity of NF-κB p65.It was proved that the expression ofPPAR-γand NF-κBp65 was involved in the developmentofNAFLD.Controlling the expression ofthese molecules may be one ofthe importantmechanisms ofcurcumin in NAFLD treatment.

curcumin；nonalcoholic fatty liver disease；peroxisome proliferator activated receptor gamma；nuclear factor kappa B p65

R575.5

A

0258-4646（2016）02-0120-07

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.02.006

遼寧省科學技術計劃（2012225019）

王子超（1988-），男，碩士研究生.

趙麗娟，E-mail：qingsong201575@sina.com

2015-07-15

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