王程，王麗麗，紀朋艷，劉玉蓮，李妍，張巍，隋春紅

（1.吉林醫(yī)藥學院 基礎(chǔ)醫(yī)學院，吉林吉林132013；2.吉林醫(yī)藥學院 藥學院，吉林吉林132013）

硒化高粱蛋白質(zhì)的制備及其抗氧化活性

王程1，王麗麗1，紀朋艷1，劉玉蓮1，李妍1，張巍1，隋春紅2，*

（1.吉林醫(yī)藥學院 基礎(chǔ)醫(yī)學院，吉林吉林132013；2.吉林醫(yī)藥學院 藥學院，吉林吉林132013）

采用化學修飾法將高粱蛋白質(zhì)（SP）制備成硒化高粱蛋白質(zhì)（Se-SP）并鑒定其抗氧化活性。結(jié)果表明，各種Se-SP均表現(xiàn)出一定的谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活力，其中Se-SP23的活力最高，為227U/g蛋白。各種Se-SP均還可發(fā)揮清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、羥自由基（·OH）和超氧陰離子（O2-·）等自由基的作用，并可有效降低抗壞血酸/二價鐵離子（VC/Fe2+）誘導損傷線粒體中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的產(chǎn)生，維持心肌線粒體的形態(tài)，抑制損傷線粒體的膨脹。

高粱蛋白；硒；抗氧化活性

必需微量元素硒（selenium，Se）對健康至關(guān)重要，因其具有較強的抗氧化效應，在預治腫瘤、動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等多種疾病過程中發(fā)揮重要作用［1］。人體中的Se主要來源于植物硒蛋白質(zhì)，并主要以硒代甲硫氨酸（selenomethionine，Se-Met）和硒代半胱氨酸（selenocysteine，Se-Cys）的形式存在［2-3］。植物蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)資源的巨大寶庫，積極開發(fā)植物蛋白質(zhì)資源具有戰(zhàn)略意義。高粱是人類栽培的主要糧食作物之一，且高粱蛋白質(zhì)（sorghum protein，SP）占高粱種子總重的6.8%～19.6%［4］，其中77%～82%為醇溶蛋白質(zhì)［5］。SP因其較強的抗氧化性而具有抑菌、保鮮等重要作用一直受到廣泛關(guān)注［6］。同時，化學修飾法制備硒蛋白質(zhì)技術(shù)已基本成熟，即在相對溫和的條件下（溫度在20℃以上即可進行反應［7］），用Se原子取代蛋白質(zhì)分子中絲氨酸（serine，Ser）羥基（hydroxyl，-OH）中的氧（oxygen，O）原子，使Ser轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂形鴼浠╯elenyl，-SeH）的Se-Cys，從而制備含硒多肽或含硒蛋白質(zhì)［8］。如能采用化學修飾法制備大量的硒化高粱蛋白質(zhì)（se lenide sorghum protein，Se-SP），在檢驗其安全性后應用于醫(yī)療保健方面，具有重要的社會意義和經(jīng)濟效益。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

東北有機高粱米：吉林永鵬農(nóng)副產(chǎn)品開發(fā)有限公司（蛋白質(zhì)含量10.4%）；牛心：吉林東清真寺屠宰場；植物蛋白質(zhì)提取試劑盒：上海貝博生物技術(shù)有限公司；Sephadex G-25：Pharmacia公司；透析袋 3500：Spectium公司；十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)分子量標準：Transgen公司；牛血清白蛋白質(zhì)（BSA）、硒粉、依布硒（Ebselen）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、抗壞血酸（VC）、硫代巴比妥酸（TBA）：Sigma公司；硒標準液：國家標準物質(zhì)研究中心；硼氫化鈉（NaBH4）、過氧化氫（H2O2）、硫酸亞鐵（FeSO4）：國藥集團化學試劑有限公司。

高速粉碎機：上海頂帥電器有限公司；HD-4核酸蛋白質(zhì)檢測儀：上海滬西分析儀器廠；FD-1C-50型冷凍干燥機：比朗（上海）儀器有限公司；UV-2550紫外分光光度計，AA-6300型原子吸收分光光度計，Se空心陰極燈：日本島津公司；AFS-230E型雙道原子熒光光度計：北京海光儀器公司；LDI-1700基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MS）：美國Linear Scientific公司。

1.2試驗方法

1.2.1SP的提取

將高粱種子置于60℃烘箱至恒重，磨粉后過80目篩。利用植物蛋白質(zhì)提取試劑盒提取SP，凍干后即為SP。Lowry法［9］測定蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)提取率/%=提取的蛋白質(zhì)質(zhì)量（g）/高粱原料中蛋白質(zhì)質(zhì)量（g）× 100。

1.2.2SP組分的分離與分子量測定

采用Suphedex G-25凝膠層析分離SP各組分，SP各組分凍干備用。用pH=7.5的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）將各組分SP重新溶解，進行SDSPAGE（5%濃縮膠、15%分離膠）鑒定［10］，MALDI-TOFMS測定SP分子量［11］。

1.2.3SP的化學修飾

按Klaymen［12］方法在氮氣保護下制備1mol/LNaHSe。用50 mmol/L PBS（pH=7.4）將純度大于75%的SP溶解成濃度為0.25g/L的蛋白質(zhì)溶液，每1毫升SP溶液加入12.5 μL PMSF（20 g/L乙腈溶液），密閉容器中25℃水浴3 h，再通入高純度氮氣20 min將體系內(nèi)氧氣完全排除后加入15 μLNaHSe溶液，氮氣保護下37℃反應40 h，反應完成后將溶液置于空氣中4 h充分氧化，12 000 r/min離心20 min除去沉淀，蒸餾水透析3次除鹽，凍干后即得Se-SP。

1.2.4SP和Se-SP硒含量和GPX活力的測定

SP和Se-SP的硒含量采用氫化物原子熒光光譜法檢測［13］。SP和Se-SP的谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）活力采用Wilson的酶偶聯(lián)法測定［14］，酶活力定義為1 min內(nèi)氧化1 μmol/L NADPH所需要的酶量為1 U，比活力的單位為U/g。

1.2.5Se-SP清除自由基能力的測定

配制不同濃度梯度的Se-SP樣品（12.5、25、27.5、50 mg/L）和Ebselen樣品（2.5、5.0、7.5、10 μmol/L）［15］。以Ebselen為對照，按常規(guī)方法［16］分別測定Se-SP對DPPH·、羥自由基（hydroxyl radical，·OH）和超氧陰離子（superoxide anion radical，O2-·）的清除率。

1.2.6Se-SP對線粒體損傷保護作用的測定

差速離心法制備牛心線粒體［17］。以BSA為標準，考馬斯亮藍法測定線粒體濃度［18］。配制終濃度0.5 g/L的線粒體溶液。37℃保溫30 min后，加入終濃度為0.5 mmol/L VC和12.5 μmol/L FeSO4，即為線粒體損傷模型。模型建立后立即加入各待測樣品（各組分Se-SP、SP樣品的終濃度為50 mg/L，Ebselen樣品的終濃度為10 μmol/L），37℃振蕩并計時。分別以正常線粒體（未進行模型損傷）和損傷線粒體為對照，在0、5、10、15、20、30、40、50 min時間點測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，在0、2、4、6、8、10、15、20 min時間點測定線粒體膨脹度。損傷線粒體產(chǎn)生的MDA含量采用TBA法測定［19］。線粒體膨脹度是通過測定溶液在520 nm波長下的吸光度值的變化來判定，線粒體膨脹度與A520值成反比［20］。

1.3數(shù)據(jù)處理

2　結(jié)果與分析

2.1SP的提取和分離鑒定

高粱種子原料的蛋白質(zhì)含量為10.4%，采用植物蛋白質(zhì)提取試劑盒可從100 g高粱種子中提?。?.13± 0.26）g SP，提取率為58.9%。經(jīng)Suphedex G-25凝膠層析，收集到4個分離組分，共包含6個蛋白質(zhì)峰，見圖1。

采用SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS對SP各組分所含主要蛋白質(zhì)的分子量進行分析測定，結(jié)果檢測到6種主要的SP，結(jié)果見圖2和圖3。

根據(jù)測定的分子量分別將其命名為SP16、SP23、SP28、SP45、SP46、SP49。其中SP23為α-醇溶蛋白質(zhì)，SP16為β-醇溶蛋白質(zhì)，SP28為γ-醇溶蛋白質(zhì)，SP45、SP46、SP49為其它雜蛋白質(zhì)［21］。

圖1　高粱蛋白質(zhì)的凝膠色譜洗脫曲線Fig.1　Elution curve of SP using gel chromatography

圖2　高粱蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析Fig.2　SDS-PAGE analysis of SPs

圖3　高粱蛋白質(zhì)的MALDI-TOF-MS分析Fig.3　MALDI-TOF MS analysis of SPs

2.2SP和Se-SP的硒含量和GPX活力

研究中常以機體內(nèi)重要含硒酶GPX的活力作為衡量硒蛋白質(zhì)抗氧化活力的指標［22］。各組分SP和Se-SP的硒含量和GPX活力，以及蛋白質(zhì)純化、硒化后Se-SP的回收率和純度見表1。

表1　各組分高粱蛋白和硒化高粱蛋白的理化性質(zhì)和抗氧化酶活性Table 1　Physical and chemical properties and antioxidant enzyme activities of SPs and Se-SPs

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取的SP并不具有GPX活力，但硒化修飾的Se-SP表現(xiàn)出明顯的GPX活力，其中Se-SP23的活力最高。這說明SP產(chǎn)生GPX活性的關(guān)鍵是Se的摻入。通過Se-SP硒含量與其GPX活力對比分析發(fā)現(xiàn)，Se-SP的GPX活力大小與蛋白質(zhì)的硒含量并沒有明顯的量效關(guān)系，這說明硒蛋白質(zhì)的GPX活力不僅與硒含量有關(guān)，還可能與硒蛋白的空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)［23］。

2.3SP和Se-SP對自由基的清除作用

分別檢測了 SP16、Se-SP16、SP23、Se-SP23、SP28、Se-SP28對DPPH·、·OH和O2-·的清除作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各種Se-SP對DPPH·的清除作用較對應的SP增強了1.7倍～2.6倍，其中Se-SP23的清除效果最佳，其清除率比陽性對照Ebselen（對應濃度的Se-SP24和Ebselen所具有的GPX活力相當）還高1.1倍，結(jié)果見圖4。

各種Se-SP對·OH的清除作用較對應的SP增強了2.1～3.5倍，其中Se-SP23的清除率較高，與Ebselen相近，結(jié)果見圖5。各種Se-SP對O2-·的清除作用較對應的SP增強了2.3倍～3.9倍，而且3種Se-SP均高于Ebselen，結(jié)果見圖6。

圖5　不同物質(zhì)對OH·的清除作用Fig.5　Scavenging effects of different chemicals on the OH·

圖6　不同物質(zhì)對O2-·的清除作用Fig.6　Scavenging effects of different chemicals on the O2-·

上述結(jié)果說明Se-SP能有效清除DPPH·、·OH和O2-·。而作為陽性對照的有機硒化合物Ebselen僅對DPPH·、·OH發(fā)揮清除作用，這可能由于Ebselen僅能由-SeH提供的氫發(fā)生還原反應，缺乏空間結(jié)構(gòu)優(yōu)勢，而Se-SP不僅由Se-Cys作為供氫體清除DPPH·、·OH，還可通過其空間結(jié)構(gòu)螯合過渡金屬離子促進O2-·分解［24］。

2.4SP和Se-SP對線粒體損傷的保護作用

通過鑒定Se-SP對VC/Fe2+誘導牛心線粒體損傷模型的保護作用，深入研究Se-SP在亞細胞水平的抗氧化活性。試驗結(jié)果顯示，SP和Se-SP均可以在一定程度上減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，結(jié)果見圖7。

圖7　不同物質(zhì)對損傷線粒體中MDA含量的抑制作用Fig.7　Inhibition effects of different chemicals on MDA content in damaged mitochondria

SP和Se-SP也均還可以抑制損傷線粒體的膨脹，從而保護線粒體，結(jié)果見圖8。

圖8　不同物質(zhì)對線粒體膨脹的抑制作用Fig.8　Inhibition effects of different chemicals on swelling of mitochondria

同時發(fā)現(xiàn)，Se-SP對損傷線粒體的保護作用明顯高于SP，其中Se-SP23的作用最強，可推測化學修飾后的Se-SP具有了可提供氫的化學基團-SeH，具有了較強是供氫能力和還原性，能更多中和活性氧成分，有效終止自由基鏈式反應，起到保護線粒體的目的。

3　結(jié)論

本研究成功采用Suphedex G-25凝膠層析將試劑盒提取的SP分離為4個組分，包含6種SP，又采用化學修飾法將其中3種純度相對較高的SP28、SP23、SP16制備成Se-SP。采用這種方法可從100 g高粱種子原料中制備出約1 g的Se-SP，且該方法條件溫和，操作簡單，具備擴大生產(chǎn)潛力。試驗鑒定各種Se-SP均具有一定的GPX活性，并能有效清除DPPH·、·OH和O2-·自由基，并有效減弱由VC/Fe2+誘導損傷的牛心線粒體的脂質(zhì)過氧化反應，維持線粒體形態(tài)，抑制線粒體膨脹的發(fā)生。

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Preparation of Selenide Sorghum Proteins and Their Antioxidant Activity

WANG Cheng1，WANG Li-li1，JI Peng-yan1，LIU Yu-lian1，LI Yan1，ZHANG Wei1，SUI Chun-hong2，*
（1.School of Basic Medicine，Jilin Medical University，Jilin 132013，Jilin，China；2.School of Pharmacy，Jilin Medical University，Jilin 132013，Jilin，China）

Selenide sorghum proteins（Se-SPs）were prepared by chemically modified method，and their an－tioxidant activities were identified.The results showed that Se-SPs possessed certain antioxidant activity of glutathione peroxidase（GPX），Wherein，GPX activity of Se-SP23was highest，about 227 U/g protein.Se-SPs could play a scavenging role in free radical such as 1，1-diphenyl-2-three nitrophenylhydrazine（DPPH·），hydroxyl radical（·OH）and superoxide anion（O2-·）.Moreover，Se-SPs could effectively decrease content of the lipid oxidation product MDA from damaged mitochondria induced by ascorbic acid/divalent iron ions（VC/Fe2+），and could be maintained in the cardiac mitochondrial morphology to avoid swelling.

sorghumprotein；selenium；antioxidantactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.002

吉林省教育廳“十二五”科學技術(shù)研究項目（2015-405）

王程（1979—），男（漢），副教授，博士，主要從事食品抗氧化劑研究與開發(fā)。

隋春紅，副教授，博士，研究方向：食品化學。

2016-05-15