沈方圓，孫明明，2， 焦加國*，武 俊，田 達(dá)，劉 款，李輝信，胡 鋒，SCHWAB A. Paul

（1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院土壤生態(tài)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2 中國科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 （南京土壤研究所），南京 210008；3 美國德州農(nóng)工大學(xué)土壤與作物科學(xué)系，德克薩斯州大學(xué)城 77843-2474）

四環(huán)素對芘污染農(nóng)田土壤微生物修復(fù)的影響及響應(yīng)過程①

沈方圓1，孫明明1，2， 焦加國1*，武 俊1，田 達(dá)1，劉 款1，李輝信1，胡 鋒1，SCHWAB A. Paul3

（1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院土壤生態(tài)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2 中國科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 （南京土壤研究所），南京 210008；3 美國德州農(nóng)工大學(xué)土壤與作物科學(xué)系，德克薩斯州大學(xué)城 77843-2474）

針對城郊農(nóng)田土壤中多環(huán)芳烴和抗生素復(fù)合污染的新特征，通過室內(nèi)模擬土培實(shí)驗(yàn)，研究四環(huán)素（Tetracycline， TC） 脅迫下，降解菌Sphingobium sp.PHE3 對長三角典型農(nóng)田土壤中芘的降解效果和影響機(jī)制。研究表明，接種降解菌處理（B）能明顯促進(jìn)土壤中芘的降解，TC的引入可顯著抑制土壤中芘的深度降解過程（P＜0.05）。經(jīng)過90天培養(yǎng)后，B處理與接菌+添加TC處理（BTC）的降解率分別為40.1%、25.7%，較對照分別提高了23.0倍、14.1倍。通過土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析發(fā)現(xiàn)，降解菌數(shù)量在經(jīng)歷90天的土壤環(huán)境適應(yīng)期后逐漸快速增加，其數(shù)量變化與污染物芘在土壤中含量消減趨勢呈負(fù)相關(guān)；引入芘和四環(huán)素對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性和功能穩(wěn)定性具有顯著影響（P＜0.05），然而對土壤真菌群落影響不顯著（P＞0.05）。此外，B和BTC處理?xiàng)l件下，土壤過氧化氫酶活性、熒光素二乙酸酯酶活性和土壤微生物生物量碳氮值顯著高于單獨(dú)添加芘處理（P）和單獨(dú)添加TC處理（TC），但P處理與TC處理之間無顯著差異（P＞0.05），說明外源污染物（芘或四環(huán)素）對于土壤酶活性和微生物生物量碳氮具有顯著抑制作用（P＜0.05），致使降解菌功能作用受到抑制。綜上研究結(jié)果表明TC可明顯抑制土壤中典型四環(huán)多環(huán)芳烴的微生物降解過程，針對多環(huán)芳烴與抗生素復(fù)合有機(jī)污染農(nóng)田土壤的微生物強(qiáng)化修復(fù)技術(shù)有待深入研究。

多環(huán)芳烴；土壤污染；芘；四環(huán)素；微生物降解

在我國很多城市周邊或近郊共同分布了許多焦化廠、鋼鐵廠、煤電廠、醫(yī)療廢棄物處理廠和畜禽養(yǎng)殖場等企業(yè)［1］。隨著我國“退二進(jìn)三”、“退城進(jìn)園”等政策的深入實(shí)施，這些污染企業(yè)逐漸被關(guān)閉或搬遷，隨之出現(xiàn)了大量的城郊農(nóng)田污染土壤［2］。此類土壤中往往含有典型非極性有機(jī)污染物多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons， PAHs），PAHs是一類由兩個或多個苯環(huán)以不同方式聚合而成的一組有機(jī)污染物，具有致癌、致畸、致突變等毒性作用［3］。除此之外，此類土壤中往往還含有高濃度的極性有機(jī)污染物抗生素（antibiotics）藥物。由于在城郊畜禽養(yǎng)殖過程中，大量的獸藥類抗生素被用于防治疾病和促進(jìn)畜禽生長，然而當(dāng)抗生素進(jìn)入畜禽體內(nèi)后，并不能被完全吸收，有研究表明近30% ～ 90% 的抗生素會以母體化合物或中間代謝產(chǎn)物的形式隨著畜禽糞便、尿液和體液排出體外，進(jìn)而導(dǎo)致抗生素進(jìn)入周邊農(nóng)田土壤環(huán)境中［4-5］。這些非極性和極性有機(jī)污染物在時間和空間尺度上的同時存在，致使城郊農(nóng)田土壤呈現(xiàn)出PAHs和抗生素復(fù)合污染的全新特征，并且這些復(fù)合有機(jī)污染物也會隨著食物鏈的傳遞作用，嚴(yán)重威脅人體健康和環(huán)境安全，是亟需解決的土壤環(huán)境問題，給修復(fù)治理帶來了很大挑戰(zhàn)。微生物降解PAHs污染農(nóng)田土壤作為一種環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)高效的修復(fù)技術(shù)已得到了深入研究和較廣泛的實(shí)際應(yīng)用［6］，然而，針對抗生素脅迫下微生物強(qiáng)化降解修復(fù)PAHs污染農(nóng)田土壤的效果和機(jī)制仍有待進(jìn)一步探明。

因而，本研究基于我國城郊農(nóng)田土壤PAHs與抗生素復(fù)合污染的新特征，采用室內(nèi)模擬土培的方式，研究四環(huán)素類抗生素脅迫下土壤中典型四環(huán)PAHs污染物芘的微生物降解過程，在探明不同濃度四環(huán)素消減過程對土壤中芘的降解動態(tài)變化的影響后，揭示降解過程中特異性降解菌和土著微生物生態(tài)功能變化的響應(yīng)機(jī)制，以期為我國PAHs與抗生素復(fù)合有機(jī)污染農(nóng)田土壤的微生物修復(fù)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試土壤 供試土壤采自江西進(jìn)賢江西省紅壤研究所內(nèi)（116°26’E，28°37’N），典型農(nóng)田土壤水稻土；采集的土樣風(fēng)干磨細(xì)，過2 mm孔徑篩后保存于4 ℃冰箱中。供試土壤理化性狀見表1。土樣的基本理化性質(zhì)采用常規(guī)分析方法，具體參考文獻(xiàn)［7］。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 污染物：芘（四環(huán)多環(huán)芳烴）；抗生素：四環(huán)素； 熒光素二乙酸酯（fluorescein diacetate， FDA）及熒光素試劑均由Aladdin Industrial Corporation提供，純度≥97%；降解菌：Sphingobium sp. PHE3 （中國菌種保藏中心No. CCTCC AB 2010362），分離篩選自南京某鋼鐵廠附近污染農(nóng)田土壤［8］。甲醇、乙腈、二氯甲烷（色譜純）和甲酸（分析純＞98%） 購自德國Merck公司；磷酸鹽/EDTA緩沖液；硝酸鎂/氨水混合溶液（使用之前即時配制）；具體配制方法參考Awad等［9］的實(shí)驗(yàn)方法。抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取10.0 mg四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以100.0 mL甲醇配成100.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃避光存放；從上述儲備液中準(zhǔn)確吸取0.1 ml于10 ml容量瓶中，用甲醇定容，配成1.0 mg/L 的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液，并用甲醇逐級稀釋制備成5 ～ 500 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃避光存放。水為雙蒸水；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

表1 供試土壤理化性狀Table1 Characteristics of tested soil

芘與四環(huán)素的分析采用AB Sciex（LC20ADAPI3200MS/MS） 高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀；樣品干燥采用SIGMA CHRIST冷凍干燥機(jī)；固相萃取使用CNW固相萃取裝置及Waters Oasis HLB 500 mg 6 ml固相萃取柱；實(shí)驗(yàn)用品清洗采用KQ 600VDE三頻數(shù)控超聲波清洗器；樣品濃縮使用Anpel 氮吹儀；樣品過濾采用Anpel公司的PTFE針式濾器。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為考查不同濃度四環(huán)素對土壤中芘的微生物降解影響，本研究設(shè)計(jì)5個處理：原始農(nóng)田土壤（CK）；添加了1.0 mg/kg芘的污染土壤（P）；1.0 mg/kg芘污染土壤 + 4%（w/v）降解菌（B）；1.0 mg/kg芘污染土壤 + 20.0 mg/kg四環(huán)素（TC）；1.0 mg/kg芘污染土壤 + 4%（w/v）降解菌 + 20.0 mg/kg四環(huán)素（BTC）。每個處理重復(fù)3次。

芘與四環(huán)素的添加：準(zhǔn)確稱取12.0 mg的芘溶于10.0 ml丙酮中，然后將其先添加到土壤總量的1/10當(dāng)中，待丙酮揮發(fā)至干后，再用剩下的土與污染土混合，為保證混合均勻，將混合好的土壤反復(fù)過2 mm篩多遍。最終土壤中芘的濃度為1.0 mg/kg。將混合好的土壤在暗處靜置直至丙酮完全揮發(fā)并充分老化至穩(wěn)定后，進(jìn)行土培試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取120.0 mg四環(huán)素溶于適量純水中，具體添加方式與芘相同，最終使其終濃度為20.0 mg/kg。

降解菌液的配制與添加： 在無菌條件下將菌株P(guān)HE3接種于LB液體培養(yǎng)基中，28℃下200 r/min 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心后收集菌體，并用無菌水洗滌3次，再用無菌水將菌液調(diào)節(jié)吸光度（OD 600）至適當(dāng)濃度備用，含菌量約為2.5×1010CFU/ml，降解菌的加入量為40.0 ml/kg。

由于企業(yè)公允價值確認(rèn)在大多數(shù)時是一個估計(jì)的結(jié)果，所以，其在企業(yè)實(shí)際應(yīng)用過程中極易被利用成為操縱利潤的工具。同時，企業(yè)會計(jì)準(zhǔn)則不是一種技術(shù)手段，不同準(zhǔn)則會生成不同的企業(yè)會計(jì)信息。企業(yè)公允價值變動被計(jì)入到當(dāng)期損益之中，其對企業(yè)的實(shí)際經(jīng)濟(jì)收益情況造成了改變，比如當(dāng)企業(yè)交易性金融資產(chǎn)公允價值發(fā)生變動時，其將會使得企業(yè)產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)利得或造成經(jīng)濟(jì)損失，從而改變企業(yè)的短期投資，且只確認(rèn)了資產(chǎn)的減值，并未確認(rèn)資產(chǎn)的升值收益；而企業(yè)衍生金融工具，其不但能夠增加企業(yè)的資產(chǎn)或負(fù)債，同時還能夠直接對企業(yè)當(dāng)期損益情況造成影響。

培養(yǎng)瓶選用250 ml棕色培養(yǎng)瓶，每瓶100.0 g土樣。培養(yǎng)期間，使樣品含水量達(dá)到田間飽和持水量的60%。定期通氣補(bǔ)水，25 ℃下避光培養(yǎng)3個月。分別在第1、5、7、14、21、35、50、75、90 天進(jìn)行破壞性采樣。土樣混勻后均勻采集土樣，所有土樣均于4 ℃避光保存，待后續(xù)分析。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤中芘降解試驗(yàn) 土壤樣品前處理及測定條件：供試土壤用二氯甲烷索氏抽提24 h，提取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至干，用環(huán)己烷定容至2.0 ml，取0.5 ml 轉(zhuǎn)移至裝有1.0 g 硅膠的預(yù)處理柱中，再用正己烷/二氯甲烷（1∶1）混合液洗脫，棄去第一組分1.0 ml洗脫液，收集2.0 ml 第二組分的洗脫液，氮?dú)獯蹈?，乙腈定容?.0 ml，待HPLC分析。液相色譜為日本島津Class-vp高效液相色譜分析系統(tǒng)，配熒光檢測器RF-10AXL，柱溫箱OTO-10ASVP，柱溫30℃，二元梯度泵LC-10AT，流動相為乙腈/水（60：40），流速為1.5 ml/min；色譜分離柱為美國Varian公司的ChromSpher 5 PAH （VPODS150-4.6 mm， particle size 5 mm， Shimadzu）［10］。

1.3.2 土壤四環(huán)素殘留量測定試驗(yàn) 土壤樣品前處理及測定條件：準(zhǔn)確稱取2.0 g土壤樣品于50.0 ml棕色玻璃離心瓶中，加入磷酸鹽/EDTA緩沖液15.0 ml、硝酸鎂/氨水混合溶液5.0 ml，渦旋1 min，超聲提取15 min，5 000 r/min離心10 min，收集上清液。再按照上述方法重復(fù)提取2次，合并提取液，用濾膜（0.45 μm）過濾后超純水稀釋至500.0 ml。固相萃取時，預(yù)先用10.0 ml甲醇和10.0 ml超純水對HLB固相萃取柱進(jìn)行活化，然后使提取液以3.0 ～ 5.0 ml/min的流速上柱，進(jìn)行萃取富集。富集完畢后，用10.0 ml超純水淋洗小柱，并用氮?dú)獯蹈?0 min，除去柱中殘留水分，之后用含0.1%甲酸的甲醇溶液進(jìn)行洗脫，收集的洗脫液在氮吹儀上吹至近干，再用含0.1% 甲酸的甲醇溶液定容至1.0 ml，渦旋混勻后經(jīng)0.22 μm針式濾器過濾至2.0 ml棕色小樣品瓶中，待測。具體方法步驟見參考文獻(xiàn)［11］。

1.3.3 土壤微生物過氧化氫酶活性測定 過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測定，其活性以每克風(fēng)干土壤滴定所需0.1 mol/L KMnO4毫升數(shù)（對照與試驗(yàn)測定的差）表示。

1.3.4 土壤微生物熒光素二乙酸脂酶（FDA）活性測定 FDA酶活性采用高錳酸鉀滴定法測定，其活性大小用熒光素吸光度值（μg/（g·h））表示。

1.3.5 土壤微生物C/N測定試驗(yàn) 土壤微生物生物量碳用氯仿熏蒸、0.5 mol/L K2SO4提取，用消煮爐定碳；土壤微生物生物量氮用氯仿熏蒸、0.5 mol/L K2SO4提取，用凱氏定氮儀測定。

1.3.6 土壤微生物計(jì)數(shù)以及降解菌計(jì)數(shù)試驗(yàn) 采用無機(jī)鹽培養(yǎng)基（MSM）作為生長底物來富集培養(yǎng)微生物。加入100.0 mg/L的含芘溶液（10 μl/well）作為唯一碳源；將不同稀釋度懸液（20 μl）加入96孔板。室溫下培養(yǎng)2周后，加入3.0 g/L的INT（碘硝基氯化四氮唑藍(lán)）（50 ul/well），最終觀察孔板顏色變化并計(jì)數(shù)，具體方法參考文獻(xiàn)［12］。

所有數(shù)據(jù)為3次重復(fù)樣的平均值，利用OriginPro 8.5 SR1和軟件 SPSS 21進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。圖表采用OriginPro 8.5和Microsoft Excel 2013 軟件繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤中芘的降解動態(tài)

在 90 天培養(yǎng)過程中，不同處理土壤中芘含量動態(tài)變化情況如圖 1所示。隨著培養(yǎng)時間的延長，土壤芘含量逐漸降低。自然條件下芘降解非常緩慢。由圖1可見，在單一芘處理（P）下，與本底值（1.0 mg/kg）相比，芘的濃度未出現(xiàn)明顯變化，且芘的消除率僅為1.7%，說明土壤芘降解過程非常緩慢，幾乎沒有降解效果；由圖1A可見，接種降解菌的芘污染土壤處理（B），在培養(yǎng)的前15天，芘的濃度未出現(xiàn)明顯變化。經(jīng)過15天的馴化以后，降解菌才顯現(xiàn)出對芘的顯著降解活性（P＜0.05），降解率逐漸增加，說明降解菌對芘的降解作用存在一定的滯后期。這可能是由于芘的苯環(huán)數(shù)目較多、分子量大，難被微生物快速降解利用［13］。當(dāng)降解菌進(jìn)入土壤經(jīng)過一段時間的馴化后，降解菌逐漸顯現(xiàn)出對土壤中芘的強(qiáng)化降解作用。芘的最終殘留濃度為0.6 mg/kg，其降解率達(dá)到40.1%（圖1），說明降解菌降解效果顯著（P＜0.05）；對芘與四環(huán)素復(fù)合污染的處理（TC），芘的消除率僅為1.4%。而在接種降解菌的芘與四環(huán)素復(fù)合污染土壤處理 （BTC） 條件下，芘的最終殘留濃度為0.7 mg/kg，降解率為25.7%。相對P、B處理來分析，該降解效果受到顯著抑制 （P＜0.05），說明在試驗(yàn)濃度下四環(huán)素對降解菌的功能表達(dá)表現(xiàn)出一定的抑制作用［14］，當(dāng)抗生素進(jìn)入土壤環(huán)境后，土壤微生物群落組成及多樣性可能會受到較大擾動和破壞［13-16］，進(jìn)而顯著抑制芘的降解修復(fù)。

圖1 土壤中芘的降解動態(tài) （A. 芘的殘留量，B. 芘的去除率）Fig. 1 Degradation dynamics of pyrene （A. residues of pyrene， B. removal rate of pyrene）

2.2 土壤中四環(huán)素的消減動態(tài)

經(jīng)過90 天培養(yǎng)后，土壤中四環(huán)素的消減動態(tài)及消除率見圖2。TC、BTC處理下，四環(huán)素含量呈現(xiàn)“L”的變化規(guī)律，均表現(xiàn)為前期迅速下降，中后期逐漸平穩(wěn)的規(guī)律。這與前人的研究結(jié)果相似［17-18］。TC處理下，四環(huán)素進(jìn)入土壤后最終殘留量為3.9 mg/kg，消除率為80.2%。在培養(yǎng)前期，四環(huán)素在土壤中的消減較快，四環(huán)素的半衰期約為14天。這主要是與抗生素種類、土壤溫度、濕度、通氣狀況和土壤性質(zhì)等因素有關(guān)［19］。培養(yǎng)至35天時，四環(huán)素殘留量為5.2 mg/kg。培養(yǎng)結(jié)束后最終殘留濃度為3.9 mg/kg，說明四環(huán)素進(jìn)入土壤后在短時期內(nèi)會有較大幅度的消除，但不能被完全消除，仍有部分濃度會殘留到土壤中。這可能是由于初始進(jìn)入土壤中的抗生素濃度較高，顯著抑制了土著微生物的活性與功能，產(chǎn)生了毒害作用，進(jìn)而導(dǎo)致對四環(huán)素消除能力的下降。也可能由于四環(huán)素進(jìn)入土壤環(huán)境后以母體或衍生物的形式與土壤有機(jī)-無機(jī)復(fù)合物產(chǎn)生了吸附解吸的老化過程，生物可吸附性顯著降低，因而未能完成徹底的消減過程［20］。BTC處理下，四環(huán)素最終殘留量為2.6 mg/kg，消除率為86.7%。相對TC處理，增加了8.1%，說明接種降解菌可在一定程度上促進(jìn)四環(huán)素的消減過程。這可能是由于外源添加的有益降解菌促進(jìn)了其他土著微生物的活性，間接地促進(jìn)了污染土壤中四環(huán)素的深度消減。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)結(jié)束時，土壤環(huán)境中殘留四環(huán)素含量依然超過了我國長三角許多農(nóng)田土壤中抗生素含量的普查均值，而未經(jīng)處理的畜禽糞便年復(fù)一年地施于農(nóng)田，將會增加四環(huán)素類抗生素在土壤中的累積和長期持留［14，21-23］?？股貫E用造成抗性基因的環(huán)境污染問題， 抗生素抗性基因的產(chǎn)生和傳播擴(kuò)散已經(jīng)成為一個備受矚目的公共安全問題［24-26］。因此，需要深入關(guān)注農(nóng)田土壤中殘留抗生素的潛在生態(tài)風(fēng)險。

圖2 土壤中四環(huán)素的消減動態(tài) （A. 土壤中四環(huán)素的殘留量，B. 土壤中四環(huán)素的去除率）Fig. 2 Changes of the concentration of tetracycline （A. residual of tetracycline in soil， B. dissipation rates of tetracycline）

圖3 降解菌數(shù)量變化Fig. 3 Number dynamics of degrading bacterium

2.3 土壤降解菌數(shù)量變化

微生物強(qiáng)化降解土壤中PAHs是一種常見的環(huán)境友好型修復(fù)技術(shù)［27］。在本研究中，芘降解菌數(shù)量動態(tài)變化情況如圖3所示，對于B處理，降解菌進(jìn)入土壤第1天時并未占據(jù)優(yōu)勢生態(tài)位，降解菌在短暫適應(yīng)后的2 ～ 5天內(nèi)，開始逐漸增殖，表明該處理下降解菌在土壤中具有較強(qiáng)的定殖能力。在隨后的5、7、14、21、35天降解菌數(shù)量一直維持在較高水平。這可能是接種的降解菌適應(yīng)了土壤環(huán)境。35 ～ 90 天，降解菌數(shù)量逐漸降低趨于穩(wěn)定，可能與微生物自身生長周期有關(guān)。相對于B處理，BTC處理對土壤微生物數(shù)量具有強(qiáng)烈的抑制作用。由圖可見，在整個培養(yǎng)期間，BTC處理下降解菌數(shù)量顯著低于B處理（P＜0.05），這可能是由于四環(huán)素的引入對于降解菌具有顯著的抑制作用。第5天至第7天，BTC處理降解菌數(shù)量逐漸升高，可能是由于四環(huán)素的毒性作用隨著其母體化合物的降解過程逐漸減弱，因而對降解菌的抑制效果也逐漸降低。第14天以后，降解菌數(shù)量逐漸降低趨于穩(wěn)定，可能與微生物自身生長周期有關(guān)。同時發(fā)現(xiàn)降解菌數(shù)量與污染物芘在土壤中消減趨勢呈負(fù)相關(guān)作用，其數(shù)量變化也與污染物芘的含量變化相呼應(yīng)。該部分研究結(jié)果說明四環(huán)素不僅對農(nóng)田土壤環(huán)境造成了較大的潛在威脅，而且也會進(jìn)一步對土壤中多環(huán)芳烴等有機(jī)污染物的深度降解修復(fù)帶來較大的干擾作用。

2.4 土壤微生物多樣性與結(jié)構(gòu)功能變化

獸藥類抗生素主要是用于治療畜禽細(xì)菌或真菌類疾病，但此類抗生素進(jìn)入土壤后， 勢必會對土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性帶來影響。土壤微生物多樣性指標(biāo)是有效評估污染物對微生物群落影響程度的方法之一。本實(shí)驗(yàn)采用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)對土壤微生物多樣性高低進(jìn)行評價，計(jì)算方法如下：Shannon-Wiener多樣性指數(shù)：H = -∑（Pi）（log2Pi），Pi為此物種個體數(shù)占總個體數(shù)比例。由表2可見，TC和BCT處理對細(xì)菌種群的影響開始表現(xiàn)為抑制作用，在培養(yǎng)第一天，TC、BTC的多樣性指數(shù)相對CK處理分別降低了23.4%，43.0%，兩種處理下細(xì)菌多樣性顯著降低 （P＜0.05）。處理至培養(yǎng)結(jié)束時，P、B、TC、BTC處理的土壤細(xì)菌種群多樣性指數(shù)相對于第一天降低了41.9%，29.3%，59.2%， 20.5%。這說明細(xì)菌種群在整個培養(yǎng)期都處于抑制狀態(tài)。真菌的多樣性指數(shù)，培養(yǎng)第1天，除了TC處理，其他處理無顯著差異，說明本試驗(yàn)中TC對真菌種群數(shù)量表現(xiàn)為顯著的抑制作用 （P＜0.05）；其他處理在培養(yǎng)第1天和第90天沒有顯著差異 （P＞0.05），說明經(jīng)過90天的培養(yǎng)，本試驗(yàn)處理對土壤真菌無明顯影響。

表2 土壤微生物香農(nóng)多樣性指數(shù)Table2 Shannon’s diversity indices of soil microbiology

圖4 不同處理下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主成分分析（A. 細(xì)菌；B. 真菌）Fig. 4 Principal component analyses of community structure for soils treated with different treatments under different incubation period

利用末端限制性片段長度多態(tài)性分析 （T-RFLP）技術(shù)對土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，T-RFLP細(xì)菌和真菌數(shù)據(jù)的主成分分析 （Principal component analysis， PCA） 結(jié)果如圖4。由圖4A可見，在培養(yǎng)1天，各處理參數(shù)完全分開，說明污染物對土壤微生物的作用開始顯現(xiàn)，即不同污染物處理培養(yǎng)短期內(nèi)能夠?qū)?xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響 （P＜0.05）。其中相對CK與P處理的距離來說，CK與B 兩個處理間距離更近，說明接種降解菌可顯著降低土壤中污染物芘對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響 （P＜0.05）；在培養(yǎng)的90天，對比第1天時未完全分開，P與B處理完全分開，說明第1天培養(yǎng)，P、B兩處理未出現(xiàn)明顯變化，短時間內(nèi)處理效果并未顯現(xiàn)。經(jīng)過90天的培養(yǎng)時間，降解菌對于芘污染土壤有顯著影響 （P＜0.05） ，且該結(jié)果與表2中細(xì)菌多樣性指數(shù)結(jié)果一致。TC與BTC處理沒有分開，說明兩處理對比下，降解菌的作用被抑制，這與四環(huán)素降低降解菌的數(shù)量有關(guān)。由圖4B可見，在培養(yǎng)第1天，CK、B、P、BTC處理下，4個點(diǎn)未完全分離；TC與其他4個處理點(diǎn)完全分離，說明該處理對土著真菌群落影響顯著 （P＜0.05），其余4個處理對土著真菌群落沒有顯著影響 （P＞0.05），土著真菌群落結(jié)構(gòu)在此階段變異趨勢不清晰。在培養(yǎng)的90天，此階段中土著真菌群落在P與B處理間顯著分離 （P＜0.05），表明加入降解菌對于土著真菌結(jié)構(gòu)有較大的影響。而這一結(jié)果可能是由于接種降解菌后，直接影響了土著菌的群落結(jié)構(gòu)組成，進(jìn)而間接改變了土著真菌的群落結(jié)構(gòu)。

2.5 土壤微生物酶活性變化

土壤中酶活性的變化可以反映土壤中微生物降解有機(jī)污染物的能力［28-30］。近年來，國外學(xué)者展開了土壤酶活性與有機(jī)污染物關(guān)系的研究，并將土壤酶活性作為評價土壤質(zhì)量監(jiān)測指標(biāo)的研究［31-32］。本研究選取了過氧化氫酶、熒光素二乙酸脂酶（FDA）兩種有代表性的土壤酶來表征污染物處理對土壤酶活性的影響。

2.5.1 過氧化氫酶活性變化 過氧化氫酶一定程度上可反映微生物對污染物的解毒能力，是表征土壤生物特性的重要酶［33］。在90天培養(yǎng)過程中，土壤脫氫酶活性變化情況如圖5所示。污染物對土壤過氧化氫酶總體表現(xiàn)為抑制→激活→恢復(fù)的過程。由于添加外源污染物對酶具有抑制效應(yīng)，培養(yǎng)第7 ～ 35天，P、B、TC和BTC處理中土壤過氧化氫酶活性隨培養(yǎng)時間的延長而整體呈下降趨勢，說明不同污染物處理?xiàng)l件下的土壤過氧化氫酶活性受到不同程度的抑制。第35 ～ 50 天，各處理酶活性隨著培養(yǎng)時間的延長而迅速升高，50天后升高速率變慢，趨于平緩。且過氧化氫酶活性與芘的降解率呈顯著正相關(guān)。這可能是由于土壤微生物的降解、土壤有機(jī)質(zhì)的吸附等多種原因引起［34］。對于B和BTC處理來說，過氧化氫酶活性在35天后迅速增加，這可能是接種微生物后，土壤中微生物數(shù)量迅速增加進(jìn)而過氧化氫酶活性提高；隨后升高速率變慢，可能是隨著時間的延長微生物活性減小。同時也驗(yàn)證了接種降解菌通過提高土壤酶活性而提高了芘的微生物降解效率。

2.5.2 熒光素二乙酸脂酶（Fluorescein diacetate lipase，F(xiàn)DA） 該酶可以用來評價土壤微生物的總體活性［35］。在 90 天培養(yǎng)過程中，F(xiàn)DA酶活性動態(tài)變化見圖6。各處理?xiàng)l件下的土壤FDA酶活性隨著培養(yǎng)時間的延長先升高后下降。培養(yǎng)前14天，各處理?xiàng)l件下的土壤FDA酶活性隨培養(yǎng)時間的延長而逐漸升高，土壤FDA酶呈現(xiàn)一定的激活作用，在10天左右各處理組激活作用均達(dá)到最高峰，這可能是由于微生物能夠利用芘作為碳源和能源刺激自身的生長。另外也有研究表明，抗生素進(jìn)入土壤也可顯著激發(fā)土壤酶活性［36］（P＜0.05）。在培養(yǎng)第14 ～ 35天，P、B、TC、BTC 4個處理酶活性逐漸下降，隨后趨于平緩。在培養(yǎng)前20天，相對P處理，B處理酶活性顯著提高（P＜0.05）。說明接種降解菌可提高土壤微生物對污染物芘的降解。相對未添加四環(huán)素的對照處理，添加四環(huán)素的處理能夠顯著降低土壤FDA酶活性（P＜0.05）。在培養(yǎng)后期，由于污染物含量減少，酶活性的抑制逐漸減弱。

圖5 不同處理下土壤過氧化氫酶活性Fig. 5 Activities of soil catalaseunder different treatments

圖6 不同處理下土壤熒光素二乙酸脂酶活性Fig. 6 Activities of soil fluorescein diacetate lipase under different treatments

2.6 土壤微生物生物量碳氮的變化

微生物生物量非常敏感，可以作為土壤污染的預(yù)警指標(biāo)［37-38］。土壤微生物生物量碳的變化見圖7。由圖 7A可以看出，P處理下土壤微生物生物量碳急劇降低，7 天時，微生物生物量碳降為初始濃度的17.7%。從第8 天開始，微生物生物量碳降低的速度減弱；至 35 天時，微生物生物量碳降至最低，僅為初始濃度的30.6%。說明前35天芘對微生物的抑制占據(jù)主導(dǎo)地位。35 天以后，微生物生物量碳開始回升，這可能是由于具有耐性的種和未受影響的種的填補(bǔ)作用，微生物生態(tài)系統(tǒng)在一定程度上得以維持。B處理通過接種降解菌來專性降解芘，由圖7A從第5天至14天內(nèi)迅速升高，隨后逐漸降低。這可能是接種微生物后，土壤中微生物數(shù)量迅速增加提高了微生物生物量碳；隨后逐漸降低可能是隨著時間的延長微生物活性減小。由圖7B可見，TC處理從第7 天開始，土壤微生物生物量碳急劇降低；至 14 天時，微生物生物量碳降至最低，加入TC處理的微生物生物量碳為85.2 ～ 100.3 mg/kg，僅為初始濃度的16.7% ～21.5%。14 天以后，加入TC處理的微生物生物量碳開始回升。這可能是因?yàn)橥寥乐形⑸镌诟邼舛人沫h(huán)素處理?xiàng)l件下更容易產(chǎn)生抗性。有研究表明，施入含有四環(huán)素的畜禽糞便后，土壤中四環(huán)素抗性菌數(shù)量比對照有明顯增加［39］。至 90天時，TC處理的微生物生物量碳恢復(fù)至初始值的94.0%。這可能是由于土壤中微生物種類眾多，四環(huán)素是一種廣譜抗菌素，不僅對革蘭氏陽性菌、陰性菌、立克次體、濾過性病毒、螺旋體屬有抑制作用，乃至原蟲類都有很好的抑制作用，但對結(jié)核菌、變形菌等則無效。因此，土壤被四環(huán)素污染后，土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)處于開始受干擾的紊亂階段，但隨脅迫時間延長，可能會有幾種更具耐性的種群和未受影響的種群來填補(bǔ)，從而微生物生態(tài)系統(tǒng)在一定程度上得以維持。且培養(yǎng)時間越長，恢復(fù)到原始水平也越容易；對比TC處理，發(fā)現(xiàn)BTC處理中微生物量碳所受的抑制作用減弱。說明接種降解菌可顯著提高土壤微生物數(shù)量（P＜0.05），進(jìn)而提高土壤微生物生物量碳。如圖7C、7D可見，微生物生物量氮與微生物生物量碳的變化趨勢是相同的。該結(jié)果與之前的其他研究人員的研究結(jié)果接近一致［40-41］。

圖7 土壤微生物生物量碳氮Fig. 7 Soil microbial biomass carbon and nitrogen

從本研究結(jié)果可以看出，與對照相比，污染物處理抑制了土壤微生物生長，這可能是由于土壤微生物在四環(huán)素脅迫下，微生物為了維持正常的生命活動就需要消耗更多的能量以維持其自身新陳代謝，而相應(yīng)的用于生長繁殖的能量則相對較少［42］，進(jìn)而致使微生物種群的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致微生物數(shù)量減少，進(jìn)而使得土壤中的微生物量碳氮降低。但也有文獻(xiàn)認(rèn)為有機(jī)污染物存在會造成土壤中微生物的生物量、基礎(chǔ)呼吸等諸指標(biāo)的上升［43］，不同的有機(jī)污染物類型、濃度以及不同的土壤性質(zhì)均可能是造成這種研究結(jié)果不同的主要原因。如果污染物容易成為微生物利用的底物，則會對微生物起到刺激作用。相反，當(dāng)污染物不能（或較難）被微生物所利用，這時往往會對微生物產(chǎn)生抑制作用。另外，也有研究認(rèn)為土壤中污染物對微生物是產(chǎn)生刺激還是抑制作用不但與土壤性質(zhì)以及微生物種類有關(guān)，而且與污染物在土壤中的含量有關(guān)［44］。

3 結(jié)論

1） 接種降解菌處理能有效促進(jìn)土壤中芘的降解，而添加四環(huán)素則顯著抑制了土壤芘微生物降解過程 （P＜0.05） 。經(jīng)過90天的培養(yǎng)，B和BTC處理下，芘的降解率分別為40.1%、25.7%，較對照分別提高了23.0倍、14.1倍。

2） P和TC處理對土壤細(xì)菌多樣性和功能結(jié)構(gòu)有顯著影響 （P＜0.05） ，但對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響不顯著（P＞0.05）。四環(huán)素的添加不僅降低了降解菌的數(shù)量與活性，也抑制了芘的深度降解過程。

3） P和TC處理對于土壤酶活性和微生物生物量碳氮有顯著抑制作用（P＜0.05）；接種降解菌處理明顯提高了芘污染土壤中過氧化氫酶、FDA酶活性及土壤微生物生物量碳氮含量。

PAHs與抗生素復(fù)合污染土壤的新特征，給常規(guī)微生物強(qiáng)化修復(fù)效果帶來了很大程度上的阻礙和干擾，該修復(fù)處理可以有效去除多環(huán)芳烴，但是對于抗生素的去除效果不太理想。因此需要對抗生素的潛在微生物風(fēng)險給予高度重視，且今后在實(shí)際微生物修復(fù)過程中應(yīng)對抗生素脅迫下對微生物的負(fù)面效應(yīng)予以深入研究。

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Effects and Response Process of Tetracycline on Bioremediation of Pyrene-contaminated Soil

SHEN Fangyuan1， SUN Mingming1，2， JIAO Jiaguo1*， WU Jun1， TIAN Da1，LIU Kuan1， LI Huixin1， HU Feng1， SCHWAB A. Paul3
（1 Laboratory of Soil Ecology， College of Resources and Environmental Sciences， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China； 2 Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation， Institute of Soil Science， Chinese Academy of Sciences， Nanjing 210008， China； 3 Department of Soil and Crop Sciences， Texas A & M University， College Station， Texas，United States 77843-2474）

An inoculation experiment in thermostatic incubator was carried out to investigate the effects and mechanisms of polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） degrading bacteria Sphingobium sp.PHE3 inoculation （B） on pyrene dissipation in arable soil co-polluted with tetracycline （TC）. The results indicated that PHE3 inoculation significantly increased the degradation rate of PAHs （P＜0.05）， while tetracycline existence in the soil obviously inhibited microbial degradation of pyrene in soil. At the end of the 90 days of incubation， the removal rates of pyrene in the treatment with sole PHE3 inoculation and combined inoculation of PHE3 with TC addition （BTC） were 40.12% and 25.72%， respectively， which were 23.0 and 14.1 times higher than that of the control （CK）. Meanwhile， a significant increase of soil microbial diversity and function structure were also observed after transient adaptation by PHE3 inoculation to the soil （P＜0.05）， suggesting a negative correlation between soil microbial activity and pyrene content in the soil. In addition， soil catalase activity， FDA enzyme activity and soil microbial biomass carbon and nitrogen （MBC/N） in the treatments B and BTC were also significantly higher than those of with pyrene addition （P）treatment and TC treatment. However， no significant difference was found for the soil enzyme activity and MBC/N between P and TC treatments （P＞0.05）， indicating that exogenous pollutants had a significant inhibition on soil microbial activity， and B weakened the inhibition. Therefore， it can be concluded that as the typical tetracyclic pollutant， TC can obviously inhibit the biodegradation of pyrene in soil， and the potential threat posed by the tetracyclines from organic fertilizer application has become a concern and need further monitoring for the soil environment.

PAHs； Soil contamination； Pyrene； Tetracyclines； Bioremediation

X53

10.13758/j.cnki.tr.2016.05.017

國家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目（41401254，41401347，41201252，41201252）、江蘇省自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目（BK20141050，BK20140723）和中國科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目（SEPR2014-01）資助。

*通訊作者（jiaguojiao@njau.edu.cn）

沈方圓（1989—），女，河南漯河人，碩士研究生，主要從事有機(jī)污染農(nóng)田土壤微生物修復(fù)研究。E-mail： 2013103029@njau.edu.cn