鄒 芳，趙 娟，雷燕萍，祖朝龍，曹 慧*

（1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物工程重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，合肥 230031）

一株煙草秸稈降解菌的分離、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究①

鄒 芳1，趙 娟1，雷燕萍1，祖朝龍2，曹 慧1*

（1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物工程重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，合肥 230031）

從皖南地區(qū)煙稻輪作田土壤中經(jīng)CMC-Na初篩獲得5株纖維素降解菌，經(jīng)DNS法測定纖維素酶活性復(fù)篩得到一株降解活性較高的降解菌YC-2。根據(jù)該菌16S rDNA序列比對結(jié)果，結(jié)合形態(tài)和生理生化特征， 確定YC-2為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。對YC-2酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)研究，并分析YC-2對煙堿的耐受情況及對煙草秸稈的降解情況，結(jié)果表明：在7天內(nèi)，YC-2對煙草秸稈降解率為10.14%；酶學(xué)特性表現(xiàn)為最適反應(yīng)溫度為60℃且在15 ～60℃ 之間具有穩(wěn)定性；最適反應(yīng)pH為7.0，在pH 4.0 ～ 7.5范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好；YC-2在濃度為1 ～ 2 g/L煙堿中能快速生長，而在高濃度的煙堿中生長受到抑制。因此，菌株YC-2產(chǎn)纖維素酶活性較高、相對耐熱耐堿且對煙桿有一定分解作用，通過進(jìn)一步誘變選育和發(fā)酵條件優(yōu)化有較好的田間應(yīng)用潛力。

枯草芽孢桿菌；纖維素酶；產(chǎn)酶特性

自然界中，纖維素可占植物體總質(zhì)量40% 左右［1］。然而，由于植物秸稈結(jié)構(gòu)的特殊性（纖維素構(gòu)成細(xì)胞壁，其間纏繞具有空間結(jié)構(gòu)的半纖維素及木質(zhì)素）而導(dǎo)致微生物很難降解秸稈纖維素［2］。作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國，中國每年秸稈產(chǎn)量超過6億t［3］，除秸稈還田［4］外，秸稈氣化、熱解發(fā)電、秸稈青貯等技術(shù)皆因收集運(yùn)輸與儲存難、成本高等問題無法大規(guī)模應(yīng)用［5］。近年來，中外大量研究表明菌劑的施用不僅能有效加快秸稈腐解，還對土壤養(yǎng)分、土壤微生物及作物產(chǎn)量有一定的促進(jìn)作用。Hart等［6］篩選的一株毛束霉屬真菌顯著降低了小麥秸稈C/N值，提高了土壤團(tuán)聚體穩(wěn)定性。Kausar等［7］將綠色木霉及黑色曲霉混菌培養(yǎng)并經(jīng)試驗(yàn)證明其顯著降低了稻秸纖維素、半纖維素、木質(zhì)素及C/N含量。金海洋等［8］在水稻秸稈還田過程中添加纖維素分解菌劑顯著降低了水稻秸稈的強(qiáng)度，并增加土壤脲酶、多酚氧化酶等酶活性及下季作物西瓜產(chǎn)量和糖度。

煙稻輪作為我國皖南地區(qū)特有的一種種植模式，在我國東南和華南煙區(qū)已被農(nóng)戶廣泛采用。據(jù)調(diào)查顯示，我國每年大約產(chǎn)生1.0×106t煙草廢棄物，其中含有多種致癌致畸物質(zhì)，如氨基聯(lián)苯、甲奈胺、苯并［α］芘等［9］。70.0% 的煙桿殘留在田間未加以利用，從而造成煙桿分解速度慢、氮饑餓、青枯菌和TMV煙草病菌寄生等問題，影響后季作物生長［10］。為提升農(nóng)田土壤肥力，減少農(nóng)田面源污染［11］，篩選高效有降解活性的微生物是最為經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的方法。由于煙草秸稈木質(zhì)素含量相對較高、且含有對多種微生物生長有抑制作用的煙堿，微生物對煙秸稈的降解可能更為困難。本研究旨在分離出高效分解煙草秸稈并可對煙堿具有一定耐受作用的菌株，加速秸稈的腐爛，為煙稻輪作模式的推廣提供菌株材料和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試土壤采自皖南地區(qū)煙稻輪作試驗(yàn)田，煙秸稈來自湖北省恩施煙草所。

1.2 研究方法

1.2.1 煙草秸稈降解菌株的篩選 稱取10.0 g試驗(yàn)土樣置于90 ml滅菌的蒸餾水中，并于180 r/min搖床中振蕩30 min，取1 ml 10-3的稀釋菌液涂布于CMC-Na固體平板（培養(yǎng)基成分為CMC-Na 15 g，酵母膏1 g，NH4NO31 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，瓊脂 20 g，蒸餾水1 000 ml）上，在30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，剛果紅染色觀察菌落周圍水解圈情況，將A值（透明圈直徑及與菌落直徑之比）較大的菌株接種到以煙草粉末為唯一碳源的平板上，選取生長速度快的菌株，連續(xù)純化獲得純培養(yǎng)。

1.2.2 酶活性測定復(fù)篩1）粗酶液的制備。分別將CMC-Na固體平板上篩選出的細(xì)菌、真菌、放線菌于28℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)制成種子液。取1 ml的種子液接種至100 ml的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃ 180 r/min的搖床中培養(yǎng)72 h后4 000 r/min離心10 min，收集上清，作為粗酶提取液。

2）羧甲基纖維素鈉酶活力（CMC）及濾紙酶活力（FPA）測定。取合適稀釋度的稀釋酶液，依據(jù)Mandels［12］纖維素酶活性測定方法并稍作改動，得出粗酶液酶活性。定義酶活力為每分鐘催化底物生成1 μmol葡萄糖所需要的酶量為一個酶活力單位U。

1.2.3 菌株鑒定觀察秸稈降解菌株在培養(yǎng)基上的生長情況、菌落形狀、菌落顏色、菌落透明度、干燥程度及其邊緣整齊度等特征，并對菌株進(jìn)行革蘭氏染色，參照文獻(xiàn)［12］的方法對篩出菌株進(jìn)行生理生化鑒定。直接挑取目的菌落，以菌體熱解后暴露的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增的產(chǎn)物酶連轉(zhuǎn)化至本實(shí)驗(yàn)室保存菌種E.coli DH10b中，挑取陽性克隆測序后采用鄰接法（Neighbor Joining Method）建立菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株對煙草秸稈降解率及對煙堿濃度的耐受性測定在100/250 ml的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，按照最佳接種量將培養(yǎng)好的種子液接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，以煙堿為唯一碳源，并設(shè)置煙堿濃度為1 ～5 g/L 5個梯度濃度，測定菌液的OD600值，得出菌株對煙堿的耐受濃度范圍。

取0.5 g煙草秸稈粉加入到100 ml的秸稈降解培養(yǎng)基中，高溫滅菌，按照10% 的接種量將培養(yǎng)好的菌液接入培養(yǎng)基中，180 r/min 30℃培養(yǎng)7天，以不接菌的三角瓶作為空白對照，取出后用蒸餾水沖洗除去煙草秸稈以外的物質(zhì)，烘干后稱量剩余秸稈質(zhì)量。秸稈降解率測定采用采用失重法，其中 m1為初始秸稈質(zhì)量，m2為發(fā)酵7天洗凈烘干后秸稈質(zhì)量。

1.2.5 YC-2酶學(xué)特性的研究 根據(jù)1.2.2粗酶液的制備方法，反應(yīng)體系為500 μl粗酶液加1.5 ml檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，設(shè)置不同溫度、pH、金屬離子，采用DNS法測定其CMC酶活力和FPA酶活力，以研究粗酶液的酶學(xué)特性。

1.2.6 金屬離子對降解菌株CMC酶活力和FPA酶活力的影響將最終濃度為1 mmol/L的Zn2+、Pb2+、Fe2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+6種金屬離子添加至酶反應(yīng)體系中，以無任何金屬離子添加的對照組所測酶活為100%，得出添加金屬離子的相對酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌株的初篩

本研究從CMC-Na固體平板上共獲得354株單一菌株，將菌株在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純化，選取具有較大水解圈菌株接種到以煙草粉末為唯一碳源的固體平板上，隨后挑選5株A值較大且在煙草粉末平板上生長較快的菌株，其中YC-1為放線菌，YC-2 ～ YC-5為細(xì)菌。5株降解菌的脫色圈直徑與菌落直徑結(jié)果如表1，菌株在CMC-Na固體平板上的降解情況如圖1。

表1 5株煙草秸稈降解菌在CMC-Na固體培養(yǎng)基上菌落和降解圈直徑（cm）Table1 Colony and halo of five degrading bacteria for tobacco straw in CMC-Na medium

圖1 菌株在CMC平板上的降解效果Fig. 1 Degradation effects of strains on CMC medium plates

2.2 降解菌株的粗酶活性測定復(fù)篩

利用DNS法測定還原糖含量，依據(jù)酶活性定義計(jì)算出粗酶酶活力，其酶活力大小如表2所示，可以看出YC-2號菌株的總體酶活力較高，CMC粗酶酶活力為38.65 U/ml，F(xiàn)PA酶活力為14.38 U/ml。因此，選擇YC-2作為后續(xù)研究對象。

2.3 降解菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將降解菌株YC-2在固體牛肉膏蛋白胨平板上劃線純化，30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天觀察。該菌落為圓形，表面粗糙不透明，污白色，干燥，有皺褶，菌落中央有深色的傘狀線；經(jīng)革蘭氏染色油鏡觀察該菌株為革蘭氏陽性短桿菌（圖2）。

表2 5株菌株的CMC酶活力和FPA酶活力測定Table2 CMase and FPase activities of five strains

2.3.2 生理生化特征鑒定 以常見的枯草芽孢桿菌為對照（CK），降解菌株YC-2的生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

2.3.3 16S rDNA鑒定 對降解菌株16S rDNA的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1% 瓊脂糖凝膠電泳上驗(yàn)證，得到一條1 600 bp左右的條帶，送至金斯瑞公司測序后，得到一條長1 530 bp的序列，將測得的序列在NCBI中比對，發(fā)現(xiàn)其與枯草芽孢桿菌屬（Bacillus subtilis）16S rDNA序列一致性高達(dá)100%。將測序序列信息提交Genbank，菌株的登錄號為GQ421472.1，下載同源性較高的序列，利用MEGA 5.0基于鄰接法構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，見圖3。結(jié)果顯示YC-2與Bacillus subtilis strain NB、Bacillus sp. IHBB 在同一分支且距離很小，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征，可判定該菌是枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖2 YC-2降解菌形態(tài)（A）和菌株鏡檢（B）結(jié)果Fig. 2 The morphology （A） and microscopy （B） of the strain YC-2

表3 YC-2的生理生化特性Table3 Physiological and biochemical characteristics of strain YC-2

2.4 降解菌株對煙堿的耐受性及對煙桿的降解率

2.4.1 對煙堿的耐受性 煙堿屬高毒性化合物，很多微生物無法對其直接利用。本實(shí)驗(yàn)以煙堿為唯一碳源，并設(shè)置煙堿濃度分別為1 ～ 5 g/L 5個梯度濃度，在pH 6.5，30℃下培養(yǎng)24 h，測定菌株的OD600。結(jié)果如圖4所示：當(dāng)煙堿濃度為2 g/L時，菌株的生長最佳，當(dāng)煙堿濃度為3 g/L，生長次之。當(dāng)煙堿濃度逐漸上升至5 g/L時，菌株的生長受到抑制。因此，菌株在濃度為1 ～ 3 g/L煙堿中能快速生長，而在高濃度的煙堿中生長受到抑制。

2.4.2 對煙草秸稈的降解率 以10% 的接種量將菌液接入秸稈降解培養(yǎng)基中，發(fā)酵7天后，測得結(jié)果如表4：菌株在7天內(nèi)對煙草的降解率為10.14%，而自然條件下降解率為2.26%。

2.5 降解菌株的酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1 最適反應(yīng)溫度 將粗酶液的反應(yīng)體系置于15 ～ 80℃下反應(yīng)，把酶活力最高者作為100%，結(jié)果如下圖5A所示：CMC酶活力和FPA酶活力的最適反應(yīng)溫度為60℃。溫度小于60℃時，酶活力呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)溫度過高時，會使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變甚至使酶失活。將酶液在不同溫度下保持30 min，結(jié)論顯示在15 ～ 60℃之間酶活力較穩(wěn)定。

2.5.2 最適反應(yīng)pH 用緩沖液將反應(yīng)體系pH調(diào)成3.0 ～ 10.0，結(jié)果如圖5B：pH在3.0 ～ 7.0之間時，酶的活性呈上升趨勢，當(dāng)pH為7.0時，酶活力最大。當(dāng)反應(yīng)體系為堿性時，酶活力顯著降低。酶活力穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示在4.0 ～ 7.5的環(huán)境下酶活力穩(wěn)定性較高，依然可達(dá)60% 以上。

圖3 基于16S rDNA序列菌株YC-2的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain YC-2 based on 16S rDNA sequences

圖4 煙堿濃度對菌株YC-2生長的影響Fig. 4 The effects of neonicotinoids concentration on growth of strain YC-2

表4 菌株YC-2對煙草秸稈的降解效果Table4 The effect of strain YC-2 on tobacco straw degradation

2.5.3 金屬離子的影響 將最終濃度為1 mmol/L的Zn2+、Pb2+、Fe2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+6種金屬離子添加到酶反應(yīng)體系，測定的纖維素酶活性如圖6所示。相比于對照組，Zn2+、Pb2+、Cu2+對該酶活性有明顯抑制作用，F(xiàn)e2+、Mg2+有明顯激活作用，而Mn2+對酶作用不明顯。

3 討論

DNS法測得枯草芽孢桿菌YC-2的CMC粗酶酶活力為38.65 U/ml，F(xiàn)PA酶活力為14.38 U/ml。相對于劉東陽等［14］篩選的蠟狀芽孢桿菌X6菌株FPA酶活力3.65 U/ml，陳晶晶等［15］獲得的XWS-12菌株CMC最大酶活力25 U/ml，Kaur 等［16］篩選獲得的CDB18菌株的最大內(nèi)切葡聚糖酶24 U/ml來說，本文兩種酶活力均較大。但7天內(nèi)降解率為10.14%，與付麗麗［17］分離的3株作物秸稈降解菌（對稻稈、麥稈、玉米秸稈在7天內(nèi)均可降解40.0% 以上）相比降解率不高，其原因之一可能是煙草秸稈纖維素含量更高、結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜引起的。煙草秸稈的田間分解，在其他土著微生物的協(xié)同作用下，可能會提高纖維素的降解效率。有研究表明加入木霉、青霉混合菌降解玉米秸稈，發(fā)酵30天后玉米秸稈可降解68.0%，而單獨(dú)加入這兩種菌，降解率只有40.0% 左右，說明混合菌株一般可以加快秸稈的降解速度［18］。煙草秸稈所含的煙堿對許多種類的微生物生長有抑制作用［19］，YC-2對煙堿的耐受性試驗(yàn)結(jié)果表明該菌可在煙堿含量1 ～ 3 g/L的環(huán)境下快速生長。李鳳菊等［20］檢測的煙莖中尼古丁雖因地而異，但含量多在0.1% ～ 0.4%，本實(shí)驗(yàn)分離的煙草秸稈降解菌YC-2有更高的煙堿耐受性。

酶學(xué)性質(zhì)初步研究顯示，YC-2 所產(chǎn)的纖維素酶反應(yīng)最適pH為7.0，在4.0 ～ 7.5范圍內(nèi)均可保持較高酶活；最佳反應(yīng)溫度為60℃，溫度在15 ～ 60℃之間酶活穩(wěn)定性較高。與一般纖維素酶相對酶活力及最適反應(yīng)pH（4.0 ～ 5.5）［21］相比，本研究篩選的菌株產(chǎn)酶兼具活力較高、相對耐熱耐堿的特點(diǎn)，因此YC-2是一株具有較好應(yīng)用推廣潛力的纖維素酶生產(chǎn)菌株。謝鳳行等［22］用物理、化學(xué)等多種方法對一株產(chǎn)纖維素酶的枯草芽孢桿菌原生質(zhì)體誘變處理后發(fā)現(xiàn)所有誘變菌株皆可明顯提高菌株產(chǎn)纖維素酶能力，謝天文等［23］優(yōu)化產(chǎn)酶條件后也得出類似結(jié)論，這為后續(xù)研究提供了借鑒及參考價值。

此外，金屬離子的添加可作為纖維素酶的抑制劑或激活劑，在纖維素催化過程中影響其活力從而改變其降解效率。Zn2+、Pb2+、Cu2+對纖維素酶有明顯抑制作用，究其原因可能是Pb2+、Cu2+等重金屬離子對微生物具有毒害作用，并可使蛋白質(zhì)變性，且毒害作用在重金屬離子過量時尤為明顯，與John等［24］的研究結(jié)果相同。低濃度的二價離子如Zn2+對纖維素酶有抑制或輕微激活作用［25-26］，Ca2+、Mg2+等對纖維素內(nèi)切酶皆有一定程度的激活作用［26］，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，但部分離子（如Ba2+等）會因纖維素酶種類的不同而改變其激活或抑制的角色［26］。

圖5 溫度及pH對纖維素酶酶活力穩(wěn)定性的影響Fig. 5 Effects of temperature and pH on stability of cellulase activity

圖6 金屬離子對纖維素酶酶活力的影響Fig. 6 The effects of metal ions on cellulase activity

4 結(jié)論

本研究以皖南煙稻輪作區(qū)為典型研究區(qū)域，通過采集該地區(qū)土壤樣品，結(jié)合平板分離及纖維素酶活性測定篩選出分解煙草秸桿的微生物菌株YC-2，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定，PCR擴(kuò)增16S rDNA測序比對，判斷該菌為一株枯草芽孢桿菌。對該菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)得出，1 ～ 3 g/L煙堿濃度下菌株可正常生長，煙桿降解率10.14%，為自然狀態(tài)下4.5倍左右。對降解菌粗酶液進(jìn)行系列酶學(xué)性質(zhì)研究后發(fā)現(xiàn)其溫度在15 ～60℃，pH 4.0 ～ 7.5內(nèi)皆有較高穩(wěn)定性，而金屬離子Zn2+、Pb2+、Cu2+明顯抑制其活性，F(xiàn)e2+、Mg2+則對該酶有明顯激活作用。本實(shí)驗(yàn)篩選出的產(chǎn)纖維素酶活力較高、相對耐熱耐堿且對煙桿有一定腐解作用的菌株YC-2，通過進(jìn)一步誘變選育和發(fā)酵條件優(yōu)化，有較好的田間應(yīng)用潛力。

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Isolation， Identification and Enzymatic Property of a Tobacco Straw Degradation Strain

ZOU Fang1， ZHAO Juan1， LEI Yanping1， ZU Chaolong2， CAO Hui1*
（1 College of Life Sciences/Key Laboratory of Microbiology Engineering of Agricultural Environment， Ministry of Agriculture，Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China； 2 Tobacco Research Institute， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei 230031， China）

To obtain microorganism strains for degrading tobacco straws， a strain named YC-2 was screened from a tobacco-rice rotation field in south of Anhui Province using CMC-Na medium and measuring cellulose activity. The train was identified as Bacillus subtilis based on its physiological and biochemical characteristics and 16s rDNA analysis. The enzymatic properties of the strain and degradation rate of tobacco straws by the strain were investigated. The effects of neonicotinoids concentration on the growth of YC-2 were also examined. The results indicated that the strain degraded 10.14% of the tobacco straw within 7 days. The optional temperature and pH were 60℃ and 7.0 for the enzymatic reactions of the strain， respectively. The CMCase and FPase were stable in the range of temperature from 15 to 60℃ and at pH from 4.0 to 7.5. The low neonicotinoids concentration of 1-2 g/L promoted YC-2 growth， while high concentration of neonicotinoids would inhibit the growth of the strain. Therefore， this strain has high activity for cellulase production and good tolerance to heat and alkali， and can decompose tobacco straw. Potential application in fields can be realized by further mutation breeding and fermentation condition optimization of the strain.

Bacillus subtilis； Cellulose； Enzymatic properties

S154.39

10.13758/j.cnki.tr.2016.05.015

安徽省煙草公司科技項(xiàng)目（2014551004）資助。

*通訊作者（hcao@njau.edu.cn）

鄒芳（1989—），女，湖北咸寧人，碩士研究生，主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究。E-mail： 455284318@qq.com