熊 藝，林欣萌，蘭 平

（1 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室（中國科學院南京土壤研究所），南京 210008；2 南京農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院，南京 210095）

土壤宏蛋白質(zhì)組學之土壤蛋白質(zhì)提取技術的發(fā)展①

熊 藝1，2，林欣萌1，2，蘭 平1*

（1 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室（中國科學院南京土壤研究所），南京 210008；2 南京農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院，南京 210095）

隨著土壤宏基因組學的日益成熟和發(fā)展，作為后基因組時代重要技術平臺的土壤宏蛋白質(zhì)組學越來越受到關注。土壤宏蛋白質(zhì)組學的研究是解析土壤宏基因功能的重要手段之一，對于碳氮磷的生物地球化學循環(huán)以及土壤有機質(zhì)積累的研究具有重大價值，可將蛋白信息與相關的生態(tài)系統(tǒng)過程聯(lián)系起來。但是，土壤蛋白含量少，樣品復雜程度高，極大限制了土壤蛋白的分離提取和進一步分析。因此，通過改進和優(yōu)化土壤蛋白的提取技術，得到高濃度的蛋白是土壤宏蛋白質(zhì)組學研究的前提條件。本文總結了近幾年來土壤蛋白提取方法，并對其適用的土壤性質(zhì)以及適用的不同種類和功能的蛋白進行了分析。此外，本文也對現(xiàn)有的土壤蛋白提取技術以及土壤蛋白鑒定技術的方法改進進行了探討。

土壤蛋白質(zhì)；宏蛋白質(zhì)組學；蛋白質(zhì)提取方法

眾所周知，蛋白是生理功能的最終執(zhí)行者。土壤蛋白質(zhì)在碳氮磷的生物地球化學循環(huán)以及有機物的積累方面發(fā)揮重要作用，與土壤質(zhì)量與可持續(xù)發(fā)展息息相關［1］。宏蛋白質(zhì)組學是研究整個生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)所有微生物來源的蛋白質(zhì)種類和豐度變化的技術手段［2］。雖然，總體而言宏蛋白組學的研究較少，特別是明確鑒定在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要功能的蛋白的研究目前幾乎是微生物生態(tài)學研究中的一個空白［3-7］。但是，在過去的10年中，宏蛋白質(zhì)組學極大地加深了我們對于微生物群落以及它們所處的地球化學環(huán)境的理解［8-10］。蛋白質(zhì)組學的研究提供了不同微生物類群在凋落物分解過程中所起到的作用，對于胞外酶的研究可以揭示微生物量的限制因素、酶與凋落物分解的關系、酶活性與相關蛋白豐度的關系、酶的微生物起源以及落葉層生物與生物地球化學作用之間的關系［11］。微生物蛋白與其生境的時間分布可以為微生物的多樣性與其在生物地球化學作用過程中所扮演的角色的研究提供幫助［12］。宏蛋白質(zhì)組學將從一個新的水平上提供微生物演替和特定種群分布活動的信息，并且這些信息都能從表達的蛋白上得到解析。例如，預測未來微生物群落的演替規(guī)律，哪種微生物在分解作用中的貢獻最大，以及哪個因素影響了整個分解過程［12］。土壤微生物生物量巨大、種類繁多、不易分離培養(yǎng)［13］，宏基因組學與蛋白質(zhì)組學結合為解決這一難題提供了契機，特別是宏蛋白質(zhì)組學可以深入地研究種群的多樣性，可以直接觀察蛋白質(zhì)在環(huán)境樣本中的變化，能夠提供細胞的功能信息，可以細致地分析群落的結構與功能［14］。宏蛋白質(zhì)組學可以通過分析微生物酶的來源功能和活動來解決不同種類蛋白的混合表達問題［11］，從而克服尋找酶信息與相關生態(tài)系統(tǒng)過程聯(lián)系的困難［15］。但是，土壤蛋白含量少，樣品復雜程度高，極大限制了土壤蛋白的分離提取和進一步分析。因此，通過改進和優(yōu)化土壤蛋白的提取技術，得到高濃度的蛋白是土壤宏蛋白質(zhì)組學研究的前提條件［16］。

1 高效分離提取土壤蛋白的限制因素

1.1 土壤樣品的復雜性

土壤具有高度的微生物多樣性，土壤生態(tài)系統(tǒng)中，微生物數(shù)量巨大，種類豐富，微生物與環(huán)境之間的相互作用多樣；并且，土壤環(huán)境具有高度多樣的生物化學途徑，不同種類的微生物在不同生長時期代謝利用的底物與最終產(chǎn)物不同，這也就造成了土壤環(huán)境中海量的蛋白種類［17］。此外土壤中的蛋白質(zhì)樣本分布并不均勻，這是因為土壤養(yǎng)分分布是由結構性因素和隨機性因素共同作用的結果。結構性因素，如氣候、母質(zhì)、地形、土壤類型自然因素等可以導致土壤養(yǎng)分強的空間相關性；而隨機性因素，如施肥、耕作措施、種植制度等各種人為活動使得土壤養(yǎng)分的空間相關性減弱，朝均一化方向發(fā)展［18］。不同區(qū)塊的土壤蛋白含量可能也有類似的變化情況。

1.2 土壤蛋白質(zhì)的豐度低

土壤含有大量干擾物質(zhì)，尤其是天然有機物質(zhì)。然而在大部分土壤當中，蛋白質(zhì)含量低，現(xiàn)有的土壤蛋白的提取方法無法獲得適用于蛋白組分析的高質(zhì)量土壤蛋白樣品［19］。

1.3 高度的生物多樣性與微生物群落的高度動態(tài)性變化

葉片來源和微生物來源的蛋白比例在凋落物分解的過程中在不斷變化，然而這個比例卻很難被統(tǒng)計［20］。在凋落物形成早期，植物來源的蛋白質(zhì)占大多數(shù)，在1 ～ 2年的凋落物中，微生物來源的蛋白質(zhì)則占90%［21-22］

1.4 蛋白質(zhì)的吸附作用

雖然，很多暴露在土壤中的蛋白質(zhì)會被土壤微生物很快地分解成肽段碎片，但小部分蛋白被認為通過與土壤黏土礦物和有機質(zhì)結合，從而有了抵抗微生物降解的能力［23］。

胞外酶經(jīng)常被土壤礦物吸收或者黏附，也常被土壤腐殖質(zhì)膠體捕獲，蛋白質(zhì)的吸附作用使酶穩(wěn)定，使酶免受蛋白質(zhì)水解酶的影響。但是蛋白質(zhì)的吸附作用會造成酶在被黏粒吸附之后催化活性的降低，這將導致穩(wěn)定之后的酶與具體的微生物活動并無關聯(lián)［24］。這也將會對酶的提取造成影響，在分離過程中，酶的形態(tài)已經(jīng)發(fā)生改變［25］。Keiblinger等［6］用已經(jīng)完全測序的微生物蛋白與土壤顆?；旌线M行稀釋實驗，然而胞外酶的肽段覆蓋率比胞內(nèi)酶更低，且在與土壤顆粒作用后，僅有40% 的肽段光譜能夠被數(shù)據(jù)庫檢測到。

由于某些蛋白與有機質(zhì)之間的聯(lián)接，與其他大量分泌到胞外的酶（比如磷酸酶、葡萄糖苷酶、脲酶）相比，利用質(zhì)譜儀對他們的鑒定依然具有不確定性。蛋白質(zhì)與腐殖質(zhì)之間的強聯(lián)系（酶-腐殖質(zhì)復合體）已被多位專家證實［26-27］。

1.5 提取緩沖區(qū)選擇范圍小

從土壤中提取蛋白質(zhì)具有一定難度，一方面由于提取緩沖區(qū)的選擇范圍小，另一方面需要從提取出的有機土壤組分中對蛋白質(zhì)進行激烈地純化，而這會導致蛋白質(zhì)的損失和降解［28］。

2 土壤蛋白提取方法的發(fā)展

2.1 提取方法的改變

目前，土壤蛋白的提取還沒有統(tǒng)一的方法，各種方法都有其局限性［29］。

最初，土壤酶的活性能夠通過間接的方法被檢測到，比如通過土壤溶液或者土壤浸出液測定酶的活性，但是卻沒有胞外酶分子或者胞外蛋白分子被檢測到的報告。在最初的實驗方法中，通過六號濾紙并不能完全除去細菌細胞，胞內(nèi)蛋白也能被SDS-PAGE檢測到［30］。

從土壤基質(zhì)的無機和有機成分中分離蛋白質(zhì)時，Benndorf等人［31］采用了NaOH處理與酚提取相結合的方式。其中，0.1 mol/L的NaOH的處理使得腐殖酸和蛋白質(zhì)從土壤礦物中釋放出來，同時破壞了微生物。而隨后的酚提取步驟將蛋白質(zhì)從腐殖質(zhì)中分離出來，并用于蛋白質(zhì)組學的研究。此種方法可分別提取出胞內(nèi)和胞外蛋白，且利于蛋白組學的功能分析。但是蛋白質(zhì)的提取率很低，要通過預培養(yǎng)和接種才可獲得足夠分析的蛋白質(zhì)含量［29］。

檸檬酸鹽提取法同時提取出的雜質(zhì)較多，但是提取物的顏色較深，因此可以促進隨后的SDS提取，而單純的SDS提取方法，提取物顏色淺黃，含有雜質(zhì)較少。兩個方法連續(xù)使用，能夠提取出更多的蛋白并且能夠顯示更多的條帶。僅用NaOH或者檸檬酸鹽是不夠的，因為在接下來的SDS緩沖液提取步驟中仍然能夠從土壤基質(zhì)中洗脫出大量蛋白［19］。

土壤蛋白提取的困難在于蛋白提取方法的缺失。蛋白質(zhì)功能的鑒定受到提取方法低效率的嚴重影響，也許大部分蛋白在純化步驟中未被高效地提取，或者在過程中被丟失［28］。

采用原位或浸出法直接提取出總蛋白，再由過膜、沉淀和離心等分離手段分離出細胞蛋白的蛋白直接提取法具有一些缺陷，例如提取出的蛋白質(zhì)的濃度通過比色法或免疫學技術來測定，而這種測定方法會因為含有的酚類物質(zhì)而發(fā)生偏差。除此之外，蛋白質(zhì)的性質(zhì)通過沒有任何氨基酸序列標識的電泳來展現(xiàn)。土壤蛋白直接提取方案的最大缺點是提取率和對土壤微生物區(qū)系的影響一直未被研究［28］。2010年Chourey等［32］提出了一個新的土壤微生物蛋白的直接提取方法，即SDS-TCA法。此法采用熱變性和SDS相結合的方法處理土壤樣品，接著通過TCA沉淀及丙酮洗滌等步驟，提取出蛋白樣品。這種方法在不同的土壤樣品中均能鑒定出500個以上的蛋白，并且與純培養(yǎng)的相比，在蛋白大小和功能分類等方面均無明顯偏差。與間接提取法相比，此法具有明顯的優(yōu)勢，被認為是目前為止最有效的土壤微生物蛋白組學的提取方法［29］。

如表1所示，一開始的土壤蛋白質(zhì)的提取方法只包括簡單的過濾、離心與滲析，隨后為了通過電泳獲得更多的蛋白條帶與斑點，大家開始采用檸檬酸鹽、SDS、酚類物質(zhì)相結合的方法。由于需要蛋白質(zhì)條帶或斑點的可視化體現(xiàn)，此階段的蛋白質(zhì)提取手段需要考慮到濃縮產(chǎn)物的顏色。從2010年左右開始，隨著質(zhì)譜分析技術的進步，為了適應定量化的質(zhì)譜分析的需求，大家開始使用超聲波破碎或者加入液氮研磨的手段使細胞更容易破碎，加入NaOH浸提、乙酸銨沉淀、TCA沉淀、洗滌劑（DTT）與尿素清洗、丙酮清洗等步驟使得提取產(chǎn)物種類更加全面和純凈。然而SDS與苯酚始終是去除有機質(zhì)與土壤礦物黏粒的有力武器。

表1 近年來土壤蛋白提取方法的主要步驟以及所用試劑Table1 Main steps and reagents used for the soil protein extraction in recent years

2.2 蛋白鑒定方法的進步

在對土壤蛋白質(zhì)進行一維凝膠電泳的過程中，在pH = 6.0時，得到了最清晰的電泳圖譜，然而在電泳過程中，蛋白質(zhì)條帶只能在擁有足夠的分子質(zhì)量相同的蛋白質(zhì)的情況下才會顯露出來，而土壤蛋白僅有很少的量并且擁有大量不明確的相對分子質(zhì)量［30］。

在2002年以前的蛋白質(zhì)濃縮物的檢測方法主要包括紫外光吸收法、色譜分析法、茚三酮法、通過比色的蛋白質(zhì)定量分析（比如雙縮脲法、lowry法、bradford法）以及二喹啉甲酸法［20］。

然而，不恰當?shù)牡鞍踪|(zhì)計量方法也會影響蛋白質(zhì)的的鑒定效果。某些土壤蛋白一般會和腐殖質(zhì)形成復合物從而被共同提取，然而這會對標準比色法對于蛋白質(zhì)含量的測定產(chǎn)生影響，比如bradford法［33］，一些已經(jīng)商用的發(fā)色基團以及熒光素都是無效的，不能提供正確的量比指標［34］。因此我們需要不受干擾物質(zhì)影響的蛋白質(zhì)含量的測定方法，比如氨基酸計量法［1］。

如表1所示，最初，在土壤蛋白的定量分析上，主要使用bradford法等比色法。而后出現(xiàn)了一維凝膠電泳和二維凝膠電泳。隨著質(zhì)譜分析技術和色譜分析技術的發(fā)展又出現(xiàn)了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，或者單獨的色譜分析和質(zhì)譜分析。而如今在常用的土壤蛋白提取物分析技術中，電泳則作為在質(zhì)譜分析或者色譜分析所必需的胰蛋白酶水解步驟之前的預處理手段。如表2所示，當然更加先進的檢測手段（比如利用液相色譜儀和質(zhì)譜儀檢測蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量）和與之相適應的提取手段必然會檢測到更多的蛋白種類與更加精確的蛋白含量。

表2 近年來不同土壤蛋白提取方法的提取效果Table2 Performance of different methods for the soil protein extraction in recent years

3 不同土壤蛋白提取方法適用的情景

3.1 不同性質(zhì)土壤適合的提取方法

表3中羅列了近年來適宜不同性質(zhì)土壤類型的土壤蛋白提取方法，采用不同的方法提取同一種性質(zhì)的土壤中的蛋白，結果差異很大。

由于在提取過程中，溶液中的蛋白質(zhì)的水解作用以及部分蛋白在TCA中的溶液化，TCA預處理可能導致高分子量的蛋白質(zhì)的丟失［35］。SDS和酚共同使用提取效果更佳。酚類對于干擾物（比如腐殖質(zhì)）的去除最有效果，避免了蛋白質(zhì)和干擾物的共同提取［34］。但是，由于腐殖質(zhì)主要位于水相，蛋白質(zhì)主要位于酚相［31］，這也可能造成蛋白質(zhì)與腐殖質(zhì)復合體在移去水相的過程中的丟失，從而導致相關蛋白的缺失［25］。使用NaOH的提取方法也可能造成類似的影響［31］。此外酚類物質(zhì)和SDS共同使用還能提高蛋白提取的效果［19］。但是單一的提取方法可能會偏向于某些群落結果的信息。Keiblinger等［6］用了4種方法測定提取土壤蛋白，然而4種方法共同檢測到的光譜量很少，也許特定的方法對于特定的種類的蛋白有特殊的偏好。

表3 不同理化性質(zhì)的土壤或凋落物適合的土壤蛋白提取方法Table3 Soil protein extraction methods suitable for the soil or leaf litter with different physical and chemical properties

檸檬酸鹽和SDS緩沖液連續(xù)使用的提取方法在不同利用類型的土地的土壤中都表現(xiàn)得很不錯［19］。

為了檢測到所有的蛋白，Benndorf等［31］采用緊接著有機溶劑反復清洗的酚類物質(zhì)提取方法，這個方法對于去除土壤或者地下水中的有機質(zhì)干擾物非常有效。這種方法似乎也減少了黃鐵礦和蛋白質(zhì)之間的聯(lián)系，因為蛋白質(zhì)在酚中呈現(xiàn)出了比在水中更高的溶解度。雖然說這種方法對低分子量蛋白質(zhì)提取具有顯著效果，但同時也丟失了一些高分子量的蛋白［36］。

3.2 不同種類、功能蛋白適合的提取方法

如表4所示，不同的土壤蛋白提取方法對不同種類、功能的蛋白質(zhì)存在不同的偏好。

不同的蛋白質(zhì)會被蛋白酶水解到不同的程度，其他修飾酶也會將不同的蛋白質(zhì)修飾成不同的性狀，而在加入酚類物質(zhì)的提取過程中，蛋白質(zhì)又不可避免地會在水相中溶解，每種蛋白又會有不同的沉淀和溶解的能力，在TCA沉淀的過程中，蛋白質(zhì)又會被不同程度地滅活，故每種蛋白質(zhì)提取方法可能造成專一性蛋白質(zhì)的丟失［35］。

根據(jù)前人的經(jīng)驗，可以在進行光譜分析之前，將不同提取方法得到的蛋白混合起來，這樣可以使能夠檢測到的蛋白質(zhì)種類更加全面［6］。

將已經(jīng)完全測序的真菌與細菌作為模式系統(tǒng)可以解決數(shù)據(jù)庫相關序列不全面的問題。但這樣將會受到生物多樣性單一以及加入的培養(yǎng)基和凋落物使得生境過于單一［15］。

可以制備土壤懸濁液，通過差速離心法得到富含土壤微生物細胞的層次，從而實現(xiàn)土壤蛋白的富集［37］。也可以利用NaOH和苯酚去除土壤中的腐殖質(zhì)直接從土體中提取土壤蛋白［31］。

表4 不同種類、功能的土壤蛋白質(zhì)適合的提取方法Table4 Extracting methods for the soil protein with different kinds and functions

4 總結和展望

4.1 現(xiàn)有土壤蛋白質(zhì)提取技術的局限性

由于土壤樣品成分復雜，土壤樣品中蛋白質(zhì)含量低，土壤蛋白的種類和數(shù)量受土壤生物群落動態(tài)性變化影響很大，土壤物質(zhì)對于蛋白質(zhì)有吸附作用以及提取土壤蛋白的浸提液緩沖區(qū)可選擇的范圍狹窄等原因，目前尚無一種可以從不同性質(zhì)的土壤樣品中無差別地提取所有蛋白質(zhì)的方法。

適用于土壤蛋白質(zhì)組學的蛋白質(zhì)提取方法發(fā)展到現(xiàn)在，主要有先將土壤中的微生物細胞分離再提取胞內(nèi)蛋白，或者提取細胞分泌到土壤中的蛋白；以及直接將土壤中的微生物細胞溶解破碎，再提取土壤中總蛋白的3種思路。

然而提取過程中使用試劑的不同，緩沖體系選擇的pH不同，離心、過濾、沉淀等的操作順序、時間、強度的不同又會使得不同的提取方法對某些種類的蛋白產(chǎn)生偏好［6］。從目前所能達到的最高技術水平來看，通過土壤蛋白質(zhì)組學的研究得到的數(shù)據(jù)，由于其提取完整性較低、變異性太大以及肽段序列數(shù)據(jù)庫匱乏的原因，往往需要結合利用土壤宏基因組學、轉(zhuǎn)錄組學得到的數(shù)據(jù)才能對研究對象做出較為客觀的結論［38］。

4.2 解決思路

4.2.1 通過特定的提取方法從特定類型的土壤中提取特定類型的蛋白 如表3、4所示，不同的蛋白質(zhì)提取方法可以從不同類型的土壤中提取出不同種類和功能的蛋白質(zhì)。洗滌劑的使用以及高溫會更加高效地促進細胞裂解以及礦物質(zhì)與蛋白質(zhì)的分離［32］，高濃度的DTT也許能通過減弱蛋白質(zhì)與礦物和腐殖質(zhì)之間的二硫鍵來提取更多的土壤蛋白［1］。

Chourey等［32］和Singleton等［39］的方法在檢測主要的細胞活動和新陳代謝過程中蛋白質(zhì)比例的信息的能力是相同的，但Singleton的方法在森林土壤蛋白功能的檢索能力方面還是有所欠缺的，而Chourey的方法能夠在研究C與N固定的過程以及有機物水解的方面提供更多的信息。而且兩種方法在分類上也有偏見，前者偏向于提取真菌蛋白，而后者傾向于提取細菌蛋白。使用DTT的Chourey的方法提取出的蛋白多樣性更高［1］。

4.2.2 通過蛋白質(zhì)肽段數(shù)據(jù)庫的完善鑒定出更多的蛋白 本文所涉及的土壤蛋白質(zhì)組學的研究大多涉及了蛋白質(zhì)肽段數(shù)據(jù)庫的匱乏導致的土壤蛋白鑒定的不全面和偏差。Baldrian和López-Mondéjar［40］在實驗中發(fā)現(xiàn)，分泌蛋白的數(shù)據(jù)庫組要由氧化酶類和水解酶類組成，能檢測到真菌的蛋白信息而沒有對應的基因序列主要是由于將檢測到的蛋白去對應已知基因序列的能力不足造成的。

宏轉(zhuǎn)錄學雖然能直接地鑒定代謝途徑，但是也缺乏mRNA和蛋白質(zhì)之間的對應關系。蛋白質(zhì)組學的質(zhì)譜鑒定也是依賴于相關基因圖譜的豐富程度，蛋白質(zhì)組學也能從更加豐富的基因序列中受益［2］。

一些根際微生物生態(tài)的研究使用了穩(wěn)定同位素探測技術，利用C13與N15標記核酸，從而探測和鑒定在土壤微生物群落中參與了特定的新陳代謝過程或者其他生化途徑的微生物種群［33］。此外，穩(wěn)定同位素同時也可以標記蛋白質(zhì)，若能解決土壤蛋白質(zhì)的分離純化上的困難以及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫缺失的問題，SIP-Protein techniques（穩(wěn)定同位素標記蛋白技術）也能用來準確鑒定具體的酶和特定種類的微生物在土壤群落生物化學過程中起到的作用。

4.2.3 建立廣譜高效的蛋白質(zhì)提取方法 配合更高精度的質(zhì)譜分析更全面地提取并鑒定蛋白的質(zhì)譜分析與色譜分析是鑒定土壤蛋白的關鍵［1］。一種較為可行的提高土壤蛋白提取的廣譜性和公平性的方法是將不同提取方法提取出的土壤蛋白濃縮液混合在一起然后再進行電泳或者液相色譜以及質(zhì)譜儀檢測，這樣能夠使提取出來的土壤蛋白種類更加全面［6］。

［1］ Bastida F， Hernández T， García C. Metaproteomics of soils from semiarid environment： Functional and phylogenetic information obtained with different protein extraction methods［J］. Journal of Proteomics， 2014， 101： 31-42

［2］ Siggins A， Gunnigle E， Abram F. Exploring mixed microbial community functioning： Recent advances inmetaproteomics［J］. FEMS Microbiol. Ecol.， 2012， 80：265-280

［3］ VerBerkmoes N C， Denef V J， Hettich R L， et al. Functional analysis of natural microbial consortia using community proteomics［J］. Nat. Rev. Microbiol.， 2009， 7：196-205

［4］ Morris R M， Nunn B L， Frazar C， et al. Comparative metaproteomics reveals ocean-scale shifts in microbial nutrient utilization and energy transduction［J］. ISME J.，2010， 4： 673-685

［5］ Sowell S M， Abraham P E， Shah M， et al. Environmental proteomics of microbial plankton in a highly productive coastal upwelling system［J］. ISME J.， 2011， 5： 856-865

［6］ Keiblinger K M， Wilhartitz I C， Schneider T， et al. Soil metaproteomics — comparative evaluation of protein extraction protocols［J］. Soil Biol. Biochem.， 2012， 54：14-24

［7］ Hettich R L， Pan C， Chourey K， et al. Metaproteomics：Harnessing the power of high performance mass spectrometry to identify the suite of proteins that control metabolic activities in microbial communities［J］. Anal. Chem.， 2013， 85： 4 203-4 214

［8］ Newman D K， Banfield J F. Geomicrobiology： How molecular-scale interactions underpin biogeochemical systems［J］. Science， 2002， 296： 1 071-1 077

［9］ Schneider T， Riedel K. Environmental proteomics： Analysis of structure and function of microbial communities［J］. Proteomics， 2010， 10： 785-798

［10］ Wilmes P， Bond P L. Microbial community proteomics：Elucidating the catalysts and metabolic mechanisms that drive the Earth’s biogeochemical cycles［J］. Curr. Opin. Microbiol.， 2009， 12： 310-317

［11］ Sinsabaugh R L， Lauber C L， Weintraub M N， et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale［J］. Ecol. Lett.， 2008， 11： 1 252-1 264

［12］ Thomas S， Katharina M K， Emanuel S， et al. Who is who in litter decomposition： Metaproteomics reveals major microbial players and their biogeochemical functions［J］. The ISME Journal， 2012， 6： 1 749-1 762

［13］ Mocali S， Benedetti A. Exploring research frontiers in microbiology： The challenge of metagenomics in soil microbiology［J］. Research in Microbiology， 2010， 161：497-505

［14］ Bastida F， Algora C， Hernandez T， et al. Feasibility of a cell separation-proteomic based method for soils with different edaphic properties and microbial biomass［J］. Soil Biology & Biochemistry， 2012， 45： 136-138

［15］ Thomas S， Bertran G， Regula G， et al. Proteome analysis of fungal and bacterial involvement in leaf litter decomposition［J］. Proteomics， 2010， 10： 1 819-1 830

［16］ Wang W， Vignani R， Scali M， et al. A universal and rapid protocol for protein extraction from recalcitrant plant tissues for proteomic analysis［J］. Electrophoresis， 2006， 27：2 782-2 786

［17］ Becher D， Bernhardt J， Fuchs S， et al. Metaproteomics to unravel major microbial key players in leaf litter and soil environments： Challenges and perspectives. Proteomics，2013， 13： 2 895-2 909

［18］ 郭旭東， 傅伯杰， 馬克明， 等. 基于 GIS和地統(tǒng)計學的土壤養(yǎng)分空間變異特征研究——以河北省遵化市為例［J］.應用生態(tài)學報， 2000， 11（4）： 557-563

［19］ Shaoning C， Matthias C R， Wei W. Improving soil protein extraction for metaproteome analysis and glomalin-related soil protein detection［J］. Proteomics， 2009， 9： 4 970-4 973

［20］ Criquet S， Farnet A M， Ferre E. Protein measurement in forest litter［J］. Biol. Fertil. Soils， 2002， 35： 307-313

［21］ Miltner A， Zech W. Microbial degradation and resynthesis of proteins during incubation of beech leaf litter in the presence of mineral phases［J］. Biol. Fertil. Soils， 1999， 30：48-51

［22］ Ziegler F， Zech W. Ver?nderungen in der stofflichen-Zusammen-setz.ung von buchenstren und gerstenstrohbeim abbauunter laborbedingungen［J］. Z. Pflanzenernaehr Bodenkd， 1991， 154： 377-385

［23］ Boyd S A， Mortland M M. Enzyme interaction with clays and clay-organic matter complexes［J］. Soil Biochemistry，1990， 6： 1-28

［24］ Nannipieri P. Role of stabilised enzymes in microbial ecology and enzyme extraction from soil with potential applications in soil proteomics // Nannipieri P， Smalla K. Nucleic acids and proteins in soil［M］. Berlin， Heidelberg：Springer Berlin Heidelberg； 2006： 75-94.

［25］ Giagnoni L， Magherini F， Landi L， et al. Soil solid phases effects on the proteomic analysis of Cupriavidus metallidurans CH34［J］. Biology and Fertility of Soils， 2012， 48（4）：425-433

［26］ Nannipieri P， Sequi P， Fusi P. Humus and enzyme activity // Piccolo A. Humic substances in terrestrial ecosystems［M］. Amsterdam： Elsevier， 1996： 293-328

［27］ Masciandaro G， Macci C， Doni S， et al. Comparison of extraction methods for recovery of extracellular βglucosidase［J］. Soil Biol. Biochem.， 2008， 40： 2 156-2 161

［28］ Giagnoni L， Magherini F， Landi L， et al. Extraction of microbial proteome from soil： Potential and limitations assessed through a model study［J］. European Journal of Soil Science， 2011， 62： 74-81

［29］ 王小麗， Pablo G P， 葉俊， 等. 土壤宏蛋白質(zhì)組學蛋白質(zhì)提取方法及其應用［J］. 應用與環(huán)境生物學報， 2012， 18（4）：691-696

［30］ Akifumi M， Masaki Y， Risa U， et al. Isolation of extracellular protein from greenhouse soil［J］. Soil Biology & Biochemistry， 2003， 35： 733-736

［31］ Benndorf D， Gerd U B， Hauke H， et al. Functional metaproteome analysis of protein extracts from contaminated soil and groundwate［J］. The ISME Journal，2007， 1： 224-234

［32］ Chourey K， Janet J， Nathan V， et al. Direct cellular lysis/protein extraction protocol for soil metaproteomics［J］. J. Proteome Res.， 2010， 9（12）： 6 615-6 622

［33］ Bastida F， Moreno J L， Nicolas C， et al. Soil metaproteomics： A review of an emerging environmental science. Significance， methodology and perspectives［J］. Eur. J. Soil Sci.， 2009， 60： 845-859

［34］ Roberts P， Jones D L. Critical evaluation of methods for determining total protein in soil solution［J］. Soil Biol. Biochem.， 2008， 40： 1 485-1 495

［35］ Carpentier S C， Witters E， Laukens K， et al. Preparation of protein extracts from recalcitrant plant tissues： An evaluation of different methods for two- dimensional gel electrophoresis analysis［J］. Proteomics， 2005， 5： 2 497-2 507

［36］ Benndorf D， Carsten V， Nico J， et al. Improving protein extraction and separation methods for investigating the metaproteome of anaerobic benzene communities within sediments［J］. Biodegradation， 2009， 20： 737-750

［37］ Williams M A， Taylor E B， Mula H P. Metaproteomic characterization of a soil microbial community following carbon amendment［J］. Soil Biol. Biochem.， 2010， 42：1 148-1 156

［38］ Jenni H， Mark P， Rache M， et al. Multi-omics of permafrost，active layer and thermokarst bog soil microbiomes［J］. Nature， 2015， 521（7551）： 208-212

［39］ Singleton I， Merrington G， Colvan S， et al. The potential of soil protein-based methods to indicate metal contamination［J］. Appl. Soil Ecol.， 2003， 23： 25-32

［40］ Baldrian P， López-Mondéjar R. Microbial genomics，transcriptomics and proteomics： New discoveries in decomposition research using complementary methods［J］. Appl. Microbiol. Biotechnol.， 2014， 98： 1 531-1 537

The Development of Soil Protein Extraction Methods in Soil Metaproteomics

XIONG Yi1，2， LIN Xinmeng1，2， LAN Ping1*
（1 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture （Institute of Soil Science， Chinese Academy of Sciences）， Nanjing 210008， China； 2 College of Resources and Environmental Sciences， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

There has been increasing concern about the soil metaproteomics in recent years. Proteomics platform in soil is helpful for understanding the biogeochemical cycles of carbon， nitrogen and phosphorus and the oxidation of soil organic matter. By analyzing the sources， functions and activities of soil microbial protein， soil metaproteomics can address the issue of different kinds of protein expression and then link protein information with the associated ecosystem processes. However， although the species of protein in soils are very rich， the contents of proteins in soils are usually very low， which dramatically hinders the application of proteomics techniques. A critical step thus is to get a high concentration of protein solution by pretreatment of soil samples. This review summarized some typical methods for extracting proteins from soils and leaf litter in recent years. In addition， the potential directions of improvements for current methods were discussed.

Soil protein； Proteomics； Protein extraction methods

S154.3

10.13758/j.cnki.tr.2016.05.001

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（973計劃）項目（No. 2015CB150501）和國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFD0200308）資助。

*通訊作者（plan@issas.ac.cn）

熊藝（1995—），男，四川瀘州人，主要從事土壤蛋白組學研究。E-mail： 13613229@njau.edu.cn