董永喜，王　霞，孫　緒，李勇軍，廖尚高，董　莉

1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550004

UPLC測定紫金龍中8-deacetyl-yunaconitine的含量

董永喜1，2，王霞1，2，孫緒1，2，李勇軍1，2，廖尚高1，2，董莉1，2

1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550004

目的建立紫金龍藥材中8-deacetyl-yunaconitine的含量測定方法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。方法于2015年1—6月，選擇貴州不同產(chǎn)地紫金龍藥材21批，采用超高液相色譜（UPLC）的方法，色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18柱，流動(dòng)相為乙腈-0.1%醋酸銨，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm。記錄8-deacetyl-yunaconitine的色譜峰面積。結(jié)果測定了21批不同產(chǎn)地的紫金龍藥材，8-deacetyl-yunaconitine含量在0.054%～0.250%。平均回收率為99.6%，RSD為0.6%。結(jié)論該方法簡便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可以控制該藥材的質(zhì)量。

紫金龍；8-deacetyl-yunaconitine；UPLC；質(zhì)量控制

紫金龍為毛茛科植物深裂黃草烏Aconitum vilmorinianum Kom var.altifidum W.T.Wang的干燥塊根，收載于《貴州省中藥材、民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003年版［1-2］。具有驅(qū)風(fēng)除濕，溫經(jīng)止痛的功效。已收入國家藥品標(biāo)準(zhǔn)的以紫金龍為主藥的風(fēng)濕跌打酊，臨床用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打損傷、扭傷挫傷引起的腰腿、關(guān)節(jié)、筋肌疼痛等癥時(shí)療效顯著，受到廣大醫(yī)生和患者的歡迎。對紫金龍藥材的報(bào)道，僅有張嘉岷、Xiong J等［3-4］對紫金龍進(jìn)行分離純化得到二萜類生物堿。該課題組之前對其，但是目前未見關(guān)于紫金蓮藥材質(zhì)量控制的研究報(bào)道及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。該課題組前期已從紫金龍醇提物進(jìn)行了抗炎作用及其機(jī)制研究［5-6］，并從中分離純化得到了黃草烏堿丁、hemsleyaconitine G、hemsleyaconitine F等8個(gè)生物堿成分［7］，并從中分離得到含量較高的8-deacetyl-yunaconi-tine。該實(shí)驗(yàn)自2015年1—6月，選用來自于貴州不同產(chǎn)地的21批紫金龍藥材進(jìn)行8-deacetyl-yunaconitine的含量測定方法研究，為控制和評價(jià)紫金龍的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

實(shí)驗(yàn)開始于2015年1-6月；21批紫金龍藥材，分別采收至貴州，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)生藥教研室龍慶德教授鑒定為毛茛科植物深裂黃草烏Aconitum vilmorinianum Kom var.altifidum W.T.Wang的干燥塊根；8-deacetylyunaconitine對照品由貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備，批號(hào)20140516，經(jīng)1 H-NMR，13 CNMR，MS，UV，IR等波譜鑒定，采用UPLC-DAD在多個(gè)波長檢測其峰面積歸一化結(jié)果均大于98.0%；乙腈（色譜純，批號(hào)AS1122-001）；醋酸銨（批號(hào)20131006）；純凈水（批號(hào)20140722）。

1.2儀器

Thermo UltiMate 3000超高效液相色譜儀（UPLC）系列（包括四元梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Chromeleon6.8工作站），TCQ-250超聲波清洗器，TGL-16G高速離心機(jī)，1/10萬電子天平（AE240），超純水機(jī)。

1.3方法

1.3.1色譜條件色譜柱Zorbax Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm×5 μm，安捷倫），流動(dòng)相:乙腈（A）-0.1%醋酸銨（B），流速1.0 mL/min，梯度洗脫（0～5 min，5%～10% A；5～20 min，10%～60%A；20～30 min，60%～95%A；31～36 min，95%～5%A），柱溫40℃，檢測波長254nm，進(jìn)樣量5 μL。理論板數(shù)按8-deacetyl-yunaconitine峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000，藥材樣品中8-deacetyl-yunaconitine與相鄰峰達(dá)到較好分離，見圖1。

圖1　紫金龍藥材和8-deacetyl-yunaconitine對照品色譜圖

1.3.2供試品溶液的配制取紫金龍粉末約3.0 g，精密稱定，精密加入30%甲醇溶液30 mL，回流提取2 h放冷，補(bǔ)重，搖勻，濾過。精密吸取續(xù)濾液20 mL過聚酰胺柱，用95%乙醇60 mL洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，20%甲醇復(fù)溶并定容至5 mL，離心即得。

1.3.3對照品溶液的配制精密稱取對8-deacetyl-yunaconitine對照品6.0 mg置10 mL量瓶中，20%甲醇溶液定容至刻度，得對照品儲(chǔ)備溶液。

2　結(jié)果

2.1線性關(guān)系考察

分別精密量取對照品儲(chǔ)備溶液0.15、0.4、1、1.6、2 mL置10 mL量瓶中，20%甲醇溶液定容，搖勻。5 μL進(jìn)樣，以濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，得回歸方程Y=1708.1X+0.523，r=0.9999。結(jié)果顯示8-deacetyl-yunaconitine進(jìn)樣量在0.045～0.60μg線性關(guān)系良好。

2.2精密度試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果表明，RSD為0.2%，證明儀器精密度良好。

2.3重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)紫金龍藥材樣品6份，按1.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定、計(jì)算8-deacetyl-yunaconitine的含量及RSD。結(jié)果表明，RSD為0.4%，證明重復(fù)性良好。

2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h分別進(jìn)樣，結(jié)果表明，RSD為2.0%，證明供試品溶液在12 h穩(wěn)定。

2.5回收率試驗(yàn)

取已測定含量的紫金龍藥材6份，每份約1.5g，精密稱定，精密加入8-deacetyl-yunaconitine對照品適量，按1.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定。結(jié)果表明，平均回收率為99.6%，RSD為0.6%。證明該方法的回收率良好。

2.6樣品測定

取貴州不同產(chǎn)地紫金龍藥材按2.1項(xiàng)下方法制備供試液，同時(shí)制備對照液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算藥材含量，結(jié)果見表1。

3　討論

紫金龍藥材具有驅(qū)風(fēng)除濕，溫經(jīng)止痛的功效。用于跌撲損傷、腰膝疼痛、瘡毒等的治療，為貴州常用的民族藥材之一。僅有張嘉岷、Xiong J等［3-4］對紫金龍進(jìn)行分離純化得到二萜類生物堿。目前未見關(guān)于紫金蓮藥材質(zhì)量控制的研究報(bào)道，在2003年版《貴州省中藥材、民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中，紫金龍藥材也僅有性狀及鑒別項(xiàng)目，無含量測定項(xiàng)目來控制該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。中藥組成復(fù)雜，產(chǎn)生藥效的不是某單一成分，檢測任何一種活性成分均不能反映中藥的整體療效。但是借鑒化藥質(zhì)量控制模式，測定某一味藥材的有效成分、活性成分、指標(biāo)性成分的含量的方法，對于控制中藥質(zhì)量起著不可替代的重要作用［8］。通過測定中藥中某些指標(biāo)性成分的含量來衡量中藥材的質(zhì)量優(yōu)劣和其制劑工藝的穩(wěn)定性，以保證中藥的質(zhì)量達(dá)到臨床用藥安全有效的目的。前期研究中發(fā)現(xiàn)，紫金龍藥材中8-deacetyl-yunaconitine含量較高，且在已分離得到的單體化合物中抗炎活性較好，因此選擇其為指標(biāo)性成分，建立基于此種成分的含量測定方法。

該實(shí)驗(yàn)開始前期，首先我們分別考察了三種色譜柱Gemini C18（250 mm×4.6 mm×5 μm，菲羅門），Cortecs C18（100 mm×4.6 mm×2.7 μm，沃特世）和Zorbax Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm×5 μm，安捷倫）的分離效果，最終選用了色譜峰分布、峰形、分離度均較好的Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱。以選定的色譜條件，利用UPLC-DAD檢測器測定8-deacetyl-yunaconitine的紫外最大吸收峰為207 nm和260 nm。對照品檢測靈敏度較高，藥材供試品色譜中基本能兼顧各成分色譜峰的豐度、分離度和基線等，故選擇254 nm為藥材含量測定波長。在供試品溶液制備中分別考察了不同提取溶劑（甲醇、30%甲醇、60%甲醇、乙醇、30%乙醇、60%乙醇）、不同提取方法（回流提取法、超聲提取法）對紫金龍藥材含量測定的影響。結(jié)果表明30%甲醇回流提取2h較好?？紤]到酚酸類物質(zhì)對樣品測定的影響，故采用聚酰胺柱對樣品提取液進(jìn)一步純化。

該實(shí)驗(yàn)對貴州產(chǎn)21批紫金龍藥材進(jìn)行了含量測定研究，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地藥材含量差別較大，以貴州水城產(chǎn)紫金龍藥材含量較高，最高者達(dá)0.250%，可能與生長期、采收季節(jié)、氣候、土壤等因素有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)所建立的研究方法全面提升了現(xiàn)有紫金龍藥材質(zhì)量控制水平，為充分利用貴州省豐富的苗藥資源及其進(jìn)一步深度開發(fā)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

表1　不同產(chǎn)地紫金龍藥材含量測定結(jié)果

［1］貴州省藥品監(jiān)督管理局編.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（2003年版）［M］.貴陽：貴州科技出版社，2003：366.

［2］江毅，李朝斗，楊衛(wèi)平，等．草藥彩色圖集［M］．貴陽：貴州科學(xué)技術(shù)出版社，2001：324.

［3］張嘉崛，吳鳳愕，陳耀祖，等.深裂黃草烏二萜類生物堿的研究［J］.植物學(xué)報(bào)，1997，39（6）：582-584.

［4］Xiong J，Tan N H，Ji C J，et al.Vilmoraconitine，a novel skeleton C19-diterpenoid alkaloid from Aconitum vilmorinianum［J］.Tetrahedron Letters，2008，49（33）：4851-4853.

［5］張曉紅，董莉，楊雅欣，等.紫金龍乙醇組分對脂多糖誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞分泌炎癥因子的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（21）：149-152.

［6］董永喜，王霞，張曉紅，等.紫金龍氯仿-甲醇組分對急性實(shí)驗(yàn)性炎癥的作用及機(jī)制研究［J］.中外醫(yī)療，2016，35（15）：161-163.

［7］楊雅欣，劉俊宏，李勇軍，等.紫金龍低極性部位的生物堿成分研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2015，27（4）：613-616.

［8］李波，樸晉華.中藥生物活性質(zhì)量控制的思考［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2012，13（1）：5-8.

Determination of 8-Deacetyl-Yunaconitine in Aconitum Vilmorinianum Kom by Ultra Performance Liquid Chromatography

DONG Yong-xi1，2，WANG Xia1，2，SUN Xu1，2，LI Yong-jun1，2，LIAO Shang-gao1，2，DONG Li1，2
1.Department of Pharmacy，GuiZhou Medical University，Guiyang，Guizhou Province，550025 China；2.Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics，GuiZhou Medical University，Guiyang，Guizhou Province，550004 China

Objective To develop an UPLC method for determination of 8-deacetyl-yunaconitine in Aconitum vilmorinianum Kom.Methods 21 samples of Aconitum vilmorinianum Kom from January to June 2015 in diffrent palces were selected.Analysis was carried out on a Agilent Eclipse XDB-C18 analytical column，and eluted with a gradient solvent system of acetonitrile-0.1%ammonium acetate as the mobile phaser.The detection wave length was set at 254 nm.The chromatographic peak area of 8-deacetyl-yunaconitine was recorded.Results The contents of in 21samples of Aconitum vilmorinianum Kom were in the ranges of 0.054%～0.250%.The average recovery rate was 99.6%，RSD Was 0.6%.Conclusion The method is simple，accurate and reproducible，and is suitable for the quality control of Aconitum vilmorinianum Kom.

Aconitum vilmorinianum Kom；8-deacetyl-yunaconitine；UPLC；Quality control

R4

A

1674-0742（2016）09（b）－0110-03

10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.26.110

貴州省中藥現(xiàn)代化項(xiàng)目（黔科合中藥字［2011］5028號(hào)）；貴州省科技計(jì)劃課題任務(wù)書黔科合LG字［2012］017號(hào)；貴州省高等學(xué)校創(chuàng)新能力提升計(jì)劃（黔教合協(xié)同創(chuàng)新字［2013］04）；貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目（黔科合重G字［2013］4001）。

董永喜（1983.3-），男，甘肅天水人，碩士，講師，研究方向：心血管藥物設(shè)計(jì)與合成研究.

董莉（1985.12-），女，四川廣安人，碩士，副教授，研究方向：中藥藥效學(xué)、藥理學(xué)研究和安全性評價(jià)，E-mail：108405755@qq.com。

（2016-06-17）