陳巖松，陳　燕，林鶯鶯，鄭瑜宏

福建醫(yī)科大學(xué)教學(xué)醫(yī)院福建省腫瘤醫(yī)院檢驗科，福建福州350014

鼻咽癌外周血單個核細(xì)胞和血漿中EB病毒DNA水平變化及與放化療療效的關(guān)系

陳巖松，陳燕，林鶯鶯，鄭瑜宏

福建醫(yī)科大學(xué)教學(xué)醫(yī)院福建省腫瘤醫(yī)院檢驗科，福建福州350014

目的比較鼻咽癌患者放化療治療前后外周血單個核和血漿EBV DNA水平的動態(tài)變化，探討EBV DNA水平與鼻咽癌放化療近期療效的關(guān)系。方法采用實時熒光定量PCR方法分別測定整群選取的2015年7—11月福建省腫瘤醫(yī)院放療科收治的75例初診鼻咽癌患者放化療前后外周血單個核細(xì)胞和血漿EBV DNA水平，根據(jù)療效評價分為CR、PR、SD、PD組，各組治療前后外周血單個核細(xì)胞和血漿EBV DNA水平分別進行比較；對配對的75例治療前鼻咽癌患者外周血單個核細(xì)胞和血漿EBV DNA水平進行檢出率和相關(guān)性分析。結(jié)果CR、PR組外周血單個核細(xì)胞和血漿EBV DNA治療前后下降明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；SD、PD組外周血單個核細(xì)胞和血漿EBV DNA治療前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。外周血單個核細(xì)胞和血漿EBV DNA總體檢出率為78.7%、53.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩種類型標(biāo)本EBV DNA結(jié)果呈正相關(guān)（r=0.481，P=0.00）。結(jié)論外周血單個核細(xì)胞和血漿EBV DNA檢測可作為評價鼻咽癌放化療近期療效的指標(biāo)。

EB病毒DNA；外周血單個核細(xì)胞；血漿；鼻咽癌；療效評價

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是惡性程度較高的頭頸部腫瘤，其分布具有明顯的地區(qū)差異，在我國多見于廣東、廣西、福建等南方地區(qū)。鼻咽癌的發(fā)病可能是多種因素長期共同作用的結(jié)果，其中EB病毒感染是重要的致病因子［1］。EBV DNA是近年來用于鼻咽癌輔助診斷的新指標(biāo)。中晚期鼻咽癌的治療主要采用同期放化療結(jié)合輔助化療［2］，EBV DNA做為鼻咽癌放化療療效監(jiān)測的文獻報道較少，該文通過觀察初診2015年7—11月收治的鼻咽癌患者EBV DNA水平在放化療治療前后中的動態(tài)變化，以探討EBV DNA做為鼻咽癌放化療近期療效判定的可行性，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

研究對象為整群選取福建省腫瘤醫(yī)院放療科收治的75例首診鼻咽癌患者，男55例，女20例，年齡12～75歲，中位年齡48歲。全部病例均經(jīng)病理活組織檢查證實，依照“鼻咽癌2008分期”標(biāo)準(zhǔn)［3］進行臨床分期。75例鼻咽癌患者的臨床病理資料見表1。同時收集35名健康人群作為治療前對照。

病理分型I：角化型鱗狀細(xì)胞癌；II：非角化性癌；III：基底細(xì)胞鱗狀細(xì)胞癌。

1.2治療方法

所有患者均接受直線加速器根治性放療，5次/周，總量65～70 Gy。除1例II期患者未行化療外，其余患者采取順鉑加5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)化療，每3周1次，共2個療程或鉑類單藥同步化療，每3周1次，共3個療程。所有患者均完成全部治療計劃。

1.3療效評價

所有患者完成治療計劃后3個月，依據(jù)體格檢查、鼻咽鏡、核磁共振成像等結(jié)果進行近期療效評價，依據(jù)WHO實體瘤評價標(biāo)準(zhǔn)分為完全緩解（complete remission，CR）、部分緩解（partial remission，PR）、穩(wěn)定（stable disease，SD）和進展（progressive disease，PD）組。

1.4EBV DNA檢測

所有入組患者治療前、治療全部結(jié)束后各采集靜脈血1次。

1.4.1試劑和儀器采用實時熒光定量PCR方法檢測EBV DNA。批號2015007，儀器為美國ABI 7500熒光定量PCR儀。

1.4.2標(biāo)本處理EDTA抗凝全血2 000 rpm10 min，取上清50 μL血漿備用；另取EDTA抗凝全血加入淋巴細(xì)胞分離液（批號20150519-1237），按試劑操作說明書進行外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）收集。

1.4.3核酸提取及PCR反應(yīng)將待檢PBMCs和血漿分別按照EBV DNA檢測試劑盒操作說明書進行核酸提?。?0 μL DNA裂解液振蕩混勻，100℃干浴10 min，13 000 rpm 5 min，各取2 μL上清進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)：93℃預(yù)變性2 min，93℃變性45 s，55℃退火及延伸60 s，10個循環(huán)，93℃30 s，55℃45 s，30個循環(huán)。同步擴增試劑盒內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線CT值由儀器分析軟件自動計算各樣本病毒拷貝數(shù)，＞500 copies/mL判為陽性；質(zhì)控品用于監(jiān)控反應(yīng)。

1.5統(tǒng)計方法

使用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。EBV DNA陽性率計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，EBV DNA在組間的分布以中位數(shù)M及四分位數(shù)間距（P25，P75）表示，治療前后EBV DNA的比較采用配對秩和檢驗；計量資料的相關(guān)關(guān)系分析采用雙變量相關(guān)分析（Spearman法），顯著性水準(zhǔn)為0.05。

表1　75例初診鼻咽癌患者的基本臨床特征［n（%）］

2　結(jié)果

①以500 copies/mL為最低檢測下限，75例初診鼻咽癌患者治療前PBMCs和血漿EBV DNA陽性率分別為78.7%（59/75）、53.3%（40/75），健康對照組PBMCs和血漿EBV DNA陽性率分別為2.8%（1/35）、0（0/35）。鼻咽癌兩種類型標(biāo)本均陽性者有26例，均陰性者有14例，鼻咽癌兩種標(biāo)本陽性率經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

②相關(guān)性分析顯示75例首診鼻咽癌治療前PBM Cs和血漿來源的EBV DNA結(jié)果呈正相關(guān)（rs=0.481，P= 0.00），見圖1。

表2　不同治療效果鼻咽癌患者治療前后EBV DNA拷貝數(shù)比較（copies/mL）

圖1　血漿和PBMCs EBV DHA拷貝相關(guān)性

③75例鼻咽癌患者根據(jù)臨床療效分組，各組放化療治療前后PBMCs和血漿EBV DNA結(jié)果見表2。CR、PR兩組治療前后PBMCs和血漿EBV DNA分別有明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；SD、PD兩組治療前后PBMCs和血漿EBV DNA差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3　討論

實時熒光定量PCR具有高靈敏度、準(zhǔn)確快速等特點，近年來廣泛用于臨床病毒學(xué)定量檢測。傳統(tǒng)的鼻咽癌實驗室檢查以EB病毒殼抗原抗體（VCA-IgA抗體）等相關(guān)血清抗原和抗體標(biāo)志物為主，近年研究認(rèn)為EB病毒DNA是鼻咽癌早期診斷、鑒別診斷、腫瘤負(fù)荷評估、療效監(jiān)測的有效指標(biāo)［4-6］。EB病毒致鼻咽癌的機制可能與其感染后表達潛伏膜蛋白（LMP）編碼基因、EB病毒核抗原（EBNA）基因及EBV編碼的小RNA（EBER）等有關(guān)。鼻咽癌病理類型以非角化型和角化型鱗狀細(xì)胞癌為主，EBV DNA在其中普遍表達。

EB病毒在B淋巴細(xì)胞中增殖使其轉(zhuǎn)化并長期潛伏在淋巴細(xì)胞內(nèi)。Lin［7］通過基因測序發(fā)現(xiàn)血漿EBV DNA基因序列與鼻咽原發(fā)腫瘤組織EBV DNA序列基本一致，提示血漿EBV DNA來源于鼻咽腫瘤灶并可能反映腫瘤負(fù)荷，這也為血漿EBV DNA用于鼻咽癌的輔助診斷、治療監(jiān)測提供了依據(jù)。中晚期鼻咽癌的治療主要以同步放化療序貫輔助化療或誘導(dǎo)化療后行同步放化療，EBV DNA載量用于鼻咽癌放化療療效判斷在文獻中多有報道，這些研究多以血漿做為觀察標(biāo)本。該研究采用熒光定量PCR技術(shù)對75例首診鼻咽癌患者放化療前后進行EBV DNA的定量檢測，同步檢測了血漿及外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）標(biāo)本。結(jié)果顯示，EBV DNA陽性率在PBMCs和血漿中分別為78.7%和53.3%，PBMCs陽性率高于血漿。2種類型標(biāo)本的檢測結(jié)果呈正相關(guān)，和蔡桂君［8］等研究得到的相關(guān)性0.664結(jié)果相近。PBMCs和血漿標(biāo)本用于EBV DNA檢測優(yōu)缺點，PBMCs標(biāo)本檢出率高，可以放映EB病毒在體內(nèi)的現(xiàn)癥感染和潛伏感染，但容易受體內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量波動的影響，不易實現(xiàn)檢測標(biāo)準(zhǔn)化；血漿標(biāo)本操作簡便易于標(biāo)化，但不便于反映潛伏感染。因此實驗室如同時提供兩種類型標(biāo)本的檢測結(jié)果將有利于臨床綜合判斷。

該研究觀察了75例首診鼻咽癌患者放化療治療前后PBMCs和血漿EBV DNA水平，在治療有效組（CR+PR）2種類型標(biāo)本治療后EBV DNA水平均有顯著下降，而SD和PD組則下降不明顯，結(jié)果與An X等報道的CR+PR組有64.6%下降率相近［9］。EBV DNA的變化與臨床療效一致，結(jié)果進一步支持鼻咽癌對放化療敏感，并提示EBV DNA可以反映腫瘤細(xì)胞增殖情況。

該研究結(jié)果表明，EBV DNA載量是鼻咽癌瘤灶增殖的有用指標(biāo)，可用于鼻咽癌放化療短期療效評估的參考，然而其在鼻咽癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)監(jiān)測等方面的作用尚待進一步實驗研究。

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The Dynamic Change of Peripheral Blood Mononuclear Cell and Plasma Epstein-Barr Virus DNA in Patients with Nasopharyngeal Carcinoma and Correlation with the Radiotherapy and Chemotherapy Curative Effect

CHEN Yan-song，CHEN Yan，LIN Ying-ying，ZHENG Yu-hong
Department of Clinical Laboratory，F(xiàn)ujian Cancer Hospital，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian Province，350014 China

Objective To compare the levels of peripheral blood mononuclear cell and plasma Epstein-barr virus DNA in patients with nasopharyngeal carcinoma（NPC）before and after radiotherapy and chemotherapy，and to discuss the correlation between the levels of EBV DNA and the short-term curative effect of the radiochemotherapy.Methods Real-time fluorescent quantitative PCR method were determined in 2015 July to November in fujian province tumor hospital radiotherapy was treated 75 cases of nasopharyngeal carcinoma patients before and after the radiation and chemotherapy peripheral blood mononuclear cells and plasma EBV DNA level.Compare the concentrations before and after therapy in CR、PR、SD、PD groups.The relationship was analyzed between plasma and PBMCs EBV DNA.Results CR，PR of peripheral blood mononuclear cells and plasma EBV DNA before and after treatment decreased significantly，the difference was statistically significant（P＜0.05）；SD，PD group of peripheral blood mononuclear cells and plasma EBV DNA before and after treatment there was no statistically significant difference（P＞0.05）.Peripheral blood mononuclear cells and plasma EBV DNA overall detection rate of 78.7%，53.3%，obvious difference（P＜0.05）；Two types of specimens of EBV DNA results were positively correlated（r=0.481，P=0.481）Conclusion Plasma and PBMCs EBV DNA could be used to access the short-term curative effect of NPC with radiotherapy and chemotherapy.

EB virus；Peripheral blood mononuclear cell；Plasma；Nasopharyngeal carcinoma；Curative effect

R739.63

A

1674-0742（2016）09（b）－0001-04

10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.26.001

福建省自然基金資助項目（2014J01297）。

陳巖松（1980.6-），男，福建福州人，本科，主管檢驗師，主要從事臨床分子生物學(xué)及臨床免疫學(xué)研究工作。

（2016-06-18）