李麗　王奐玲　王桂芳　周靜

（北京市水文地質(zhì)工程地質(zhì)大隊(duì)北京100195）

北京地下水中土著反硝化細(xì)菌的分離及脫氮性能研究

李麗王奐玲王桂芳周靜

（北京市水文地質(zhì)工程地質(zhì)大隊(duì)北京100195）

依據(jù)本單位對(duì)北京市地下水的數(shù)年水質(zhì)監(jiān)測數(shù)據(jù)，選取10個(gè)硝酸鹽污染的地下水水樣，經(jīng)溴百里酚藍(lán)（BTB）變色培養(yǎng)基初篩及搖瓶培養(yǎng)，成功篩選分離出一株高效反硝化細(xì)菌，命名為3-Ⅰ。經(jīng)16S rRNA基因序列分析，反硝化細(xì)菌3-Ⅰ與Rhizobium pusense sp和Beijerinckia fluminensis sp的同源性為99%。3-Ⅰ菌株能夠以乙酸鈉為唯一碳源，以硝酸鹽及亞硝酸鹽為氮源，搖瓶處理72h后在人工配水中硝酸鹽去除率高達(dá)99.9%，且無亞硝酸積累；在編號(hào)為W 652、HJ121和HJ155的3個(gè)北京市地下水水樣中的硝酸鹽去除率均高于99.3%，也無亞硝酸鹽積累，具有一定的工程應(yīng)用價(jià)值。

地下水；硝酸鹽氮污染；反硝化細(xì)菌

北京市是為數(shù)不多的以地下水作為主要供水水源的國際化大都市，地下水供水量占全市總供水量的2/3[1]。研究指出，目前北京市的地下水資源已經(jīng)遭受不同程度的硝酸鹽污染，北京市平原農(nóng)區(qū)深層地下水硝態(tài)氮污染程度已接近甚至超過歐美國家，淺層地下水污染更為嚴(yán)重[8]。長期使用高硝酸鹽含量的飲用水，可導(dǎo)致嬰兒血紅蛋白增高，也可能引起成年人與此相關(guān)的癌病發(fā)生，威脅人類健康[2-4]。許多國家和機(jī)構(gòu)都規(guī)定了地下水中硝酸鹽質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)，世界衛(wèi)生組織（WHO）將飲用水中硝酸鹽氮含量的最大允許值限定為11.3mg/L，美國規(guī)定其最大允許值為10mg/L，我國規(guī)定飲用地下水源的Ⅲ類標(biāo)準(zhǔn)中NO3-N含量不能超過20mg/L。因此，開展北京市地下水硝酸鹽污染修復(fù)研究，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

傳統(tǒng)的飲用水處理工藝（絮凝沉淀-過濾-氯氣消毒）對(duì)NO3-幾乎無去除效果。目前，地下水硝酸鹽去除方法主要有物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)及生物修復(fù)方法。其中，生物反硝化法具有投資小、維護(hù)費(fèi)用低、操作簡便、對(duì)環(huán)境安全、效率高、降解徹底以及對(duì)地理環(huán)境要求低等許多優(yōu)點(diǎn)。脫氮微生物的存在，是生物脫氮作用進(jìn)行的先決條件，因此，如何從自然環(huán)境或人工環(huán)境中分離篩選反硝化細(xì)菌，增加反硝化細(xì)菌的種屬資源，一直是研究的重點(diǎn)。研究表明，國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)并分離篩選出多種好氧反硝化細(xì)菌，如糞產(chǎn)堿桿(Alcaligenes faecalis)、異養(yǎng)球硫細(xì)菌(Thiosphaera pantotropha)、海洋假單胞菌(Pseudomonas nautical)和細(xì)小好氧反硝化菌(Microvirgulaaerodenitrifica)等50多個(gè)菌屬[5-8]。反硝化細(xì)菌幾乎存在于各種生境中，如果可以從受污染的地下水水體中篩選出一株或幾株土著微生物，可具有較高的生態(tài)安全性，并對(duì)其進(jìn)行馴化，強(qiáng)化其除氮效率，鑒定其安全性，在此方向上開展基礎(chǔ)研究，可為今后在該地區(qū)開展生物修復(fù)技術(shù)研究提供基礎(chǔ)資料。

本文從10個(gè)受硝酸鹽污染的北京地下水水樣中，成功分離篩選出一株高效反硝化細(xì)菌3-Ⅰ，并研究了其在硝酸鹽人工配水和3個(gè)受硝酸鹽污染的北京市地下水水樣中的脫氮性能，其硝酸鹽去除率可高達(dá)99%。

1材料與方法

1.1材料

培養(yǎng)基有以下幾種：富集培養(yǎng)基：牛肉浸膏5g·L-1，蛋白胨10g·L-1，KNO310g·L-1，pH 7.0，121oC，滅菌20min。反硝化菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基：乙酸鈉5g·L-1，K2HPO4·3H2O 1.30g·L-1，KNO31.30g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.07g·L-1，MgSO4·7H2O 0.1g·L-1，CaCl2·7H2O 0.2g·L-1，pH 7.0，121℃，滅菌20min。

溴百里酚藍(lán)培養(yǎng)基（BTB培養(yǎng)基）：乙酸鈉5g·L-1，K2HPO4· 3H2O 1.30g·L-1，KNO31.30g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.07g·L-1，MgSO4· 7H2O 0.1g·L-1，CaCl2·7H2O 0.2g·L-1，BTB(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的乙醇溶液)1mL，去離子水溶解，用1mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7.0～7.1，120℃滅菌30m in，培養(yǎng)基呈墨綠色。以上培養(yǎng)基若需固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂即可。

1.2水樣的采集與保存

本實(shí)驗(yàn)共采集地下水樣品10個(gè)，詳細(xì)信息見表1。水樣于24h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室待用。

表1采樣信息

1.3水樣中菌種的分離與篩選

1.3.1水樣中菌種的富集馴化培養(yǎng)

吸取采集的地下水水樣1mL至裝有100m L富集培養(yǎng)基的200mL錐形瓶中，無菌封口膜封口，180r/min，30℃搖床培養(yǎng)，每隔2天取培養(yǎng)物接種至新鮮的富集培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接量為10%。連續(xù)富集馴化培養(yǎng)6～7次。

1.3.2水樣中菌種的初篩

反硝化過程為堿增加過程，采用含有溴百里酚藍(lán)（BTB）指示劑的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行反硝化菌的初篩[9]。將富集馴化后的菌懸液梯度稀釋涂布于BTB培養(yǎng)基，置于30℃培養(yǎng)，直至出現(xiàn)變藍(lán)的菌落或暈圈即確定為初篩的反硝化細(xì)菌，然后挑取變藍(lán)或有暈圈的菌落重復(fù)劃線培養(yǎng)，直至平板菌落無其他形態(tài)的菌落為止。

1.3.3水樣中菌種的復(fù)篩

將初篩得到的菌株富集培養(yǎng)，吸取50mL菌液離心收集菌體，用反硝化菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基懸浮，離心以洗去附著的培養(yǎng)基，再用該培養(yǎng)基10mL懸浮菌體，取一定量測定OD600吸光值,以確定接入菌體的量。再將制備的菌懸液以相同的接菌量接入到100mL含硝酸鹽的基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)，設(shè)不接菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白，上述操作均在無菌條件下進(jìn)行。30℃恒溫?fù)u床180r/min振蕩培養(yǎng)72h，將培養(yǎng)基離心過濾后，檢測NO3-和NO2-的含量。

1.4菌株的16S rRNA分子生物學(xué)鑒定

16S rRNA序列分析：提取菌株的DNA作為16SrRNA的擴(kuò)增模板。（1）95℃預(yù)變性5m in，（2）95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1m in30s；（3）第2步循環(huán)30次；（4）72℃延伸10min，4.0℃保存。得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后進(jìn)行測序，測序結(jié)果在GenBank進(jìn)行同源性分析。

1.5菌株在水中的硝酸鹽去除性能研究

1.5.1菌株的生長曲線

將菌液以5%的轉(zhuǎn)接量接入到新鮮的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于30℃恒溫?fù)u床180r/min培養(yǎng)，每2h取4mL菌液稀釋后測定OD600值，采用比濁計(jì)數(shù)法測定該菌不同時(shí)間的生長量，根據(jù)時(shí)間與OD600值的對(duì)應(yīng)關(guān)系繪制菌株的生長曲線，明確菌株的生長規(guī)律。

1.5.2菌株的最適生長pH值

取過夜培養(yǎng)的新鮮菌液，以5%的接種量分別接種至pH值為5、6、7、8、9和10的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30℃，180r/min搖床培養(yǎng)。分別于接種后的0、2、4、6、8、10、12和14h測其OD600值。

1.5.3菌株在人工配水中的脫氮性能研究

配制與污染地下水中硝酸鹽含量接近的人工配水，組分為：乙酸鈉5 g·L-1，K2HPO4·3H2O 1.30 g·L-1，KNO30.340 g·L-1，F(xiàn)eSO4· 7H2O 0.07g·L-1，MgSO4·7H2O 0.1 g·L-1，CaCl2·7H2O 0.2 g·L-1，pH 7.0。以5%的接種量接種到100mL人工配水中，不加菌的人工配水為空白，30℃180r/min搖床培養(yǎng)。分別于接種后24h、48h和72h測定硝酸鹽含量。

1.5.4菌株在地下水水樣中的脫氮性能研究

取編號(hào)為W 652、HJ121、HJ155的污染地下水水樣，加入乙酸鈉5g·L-1，以5%的接種量分別接種到100mL三個(gè)原水中，設(shè)置加入乙酸鈉的原水為空白，分別于0h和接種后96h測定硝酸鹽含量。

2結(jié)果與討論

2.1菌株的初篩

采集的10個(gè)地下水水樣經(jīng)過富集與馴化，將培養(yǎng)液（混合菌群）梯度稀釋涂布于BTB培養(yǎng)基，其中水樣編號(hào)為W 911、W912和WR50的培養(yǎng)基變藍(lán)，挑取變藍(lán)或出現(xiàn)藍(lán)色暈圈的菌落劃線純化，從W 911中分離到4株細(xì)菌，從W 912中分離到2株，從WR50中同樣分離到2株，共純化得到8株細(xì)菌。再將8株細(xì)菌劃線培養(yǎng)于BTB培養(yǎng)基，最終得到4株使培養(yǎng)基變藍(lán)的菌株，編號(hào)為1-Ⅰ、1-Ⅱ、2-Ⅰ和3-Ⅰ。

2.2菌株的復(fù)篩

初篩得到的4株菌株72h后的硝酸鹽含量如表2所示，但是1-Ⅰ、1-Ⅱ、2-Ⅰ均產(chǎn)生較多的NO2-積累，不可用于地下水修復(fù)。3-Ⅰ菌株的硝酸鹽去除率高達(dá)99.7%，且亞硝酸鹽含量也符合國家地下水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Ⅲ類要求[10]。

表2各菌株72h的脫氮性能數(shù)據(jù)

2.3菌株鑒定結(jié)果

將測序得到的序列與Genbank中相關(guān)序列比對(duì)，結(jié)果如表3所示，其與Rhizobium pusense strain NRCPB10和Beijerinckia fluminensisstrain UQM1685的同源性為99%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，根瘤菌屬Rhizobium pusense strain（NRCPB10）是分離自印度新德里種植鷹嘴豆的根際土壤，代表了一種新的根瘤菌屬[11]。孫俊平也曾分離篩選出一株Rhizobium pusense sp在微生物采油和原油污染處理方面具有應(yīng)用潛力[12]。弗留明拜葉林克氏菌(Beijerinckia fluminensis)可將濾紙條完全崩解，其所在復(fù)合菌系對(duì)苦參殘?jiān)偷径捰薪到饽芰13]。

表3菌株3-Ⅰ16s RNA基因同源性比對(duì)結(jié)果

3-Ⅰ菌株還需生理生化試驗(yàn)及其電鏡結(jié)果來進(jìn)一步完成鑒定。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[14]，根瘤菌屬具有良好的固氮作用，在氧氣充足的情況下，能夠利用空氣中的氮，但是在氧氣貧乏或溶解氧少的環(huán)境下，可以利用NO3-、NO2-作為氮源生長。在本文的實(shí)驗(yàn)過程中，3-Ⅰ菌株能夠在貧氧條件下有效去除水中的硝酸鹽，因此，推測其屬于根瘤菌屬的可能性極大。

2.4菌株的生長曲線和適生長pH值

3-Ⅰ的生長曲線如圖1，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，該菌在0～2h時(shí)處于延遲期，2h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，6h時(shí)對(duì)數(shù)生長期結(jié)束，進(jìn)入穩(wěn)定期，下一步實(shí)驗(yàn)可在菌體處于穩(wěn)定期8h時(shí)取樣。

圖1菌株3-Ⅰ生長曲線

圖2菌株3-Ⅰ最適生長pH

由圖2可以看出，3-Ⅰ菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中生長時(shí)，在pH為7和8的條件下，菌株生長速度較快，且菌株3-ⅠpH變化不敏感，說明該菌株可以適應(yīng)的酸度范圍較寬，利于今后野外工程使用。為了更接近北京地區(qū)地下水的pH，今后實(shí)驗(yàn)選取pH為7時(shí)進(jìn)行。

2.5菌株在人工配水及地下水水樣中的脫氮性能研究

分別于接種24h、48h和96h后測定人工配水中硝酸鹽含量，結(jié)果如圖3所示，48h時(shí)硝酸鹽含量即由223.9 mg/L降為0.6mg/L，72h時(shí)硝酸鹽含量降為0.1mg/L，去除率高達(dá)99.9%，且無亞硝酸鹽積累。由于本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)沒有定量測定乙酸鈉的含量，但從離子色譜圖上看出乙酸根的含量在72h時(shí)也消耗完畢。在今后的實(shí)驗(yàn)中，將進(jìn)一步優(yōu)化乙酸鈉投入量。

圖3菌株3-Ⅰ降解人工配水中的反硝化特性

分別于0h和接種后96h測定菌株3-Ⅰ處理后的W652、HJ121、HJ155水樣中的硝酸鹽含量，結(jié)果如表4所示。通過對(duì)這3個(gè)水樣進(jìn)行水質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)其中的離子種類和濃度遠(yuǎn)大于人工配水。3-Ⅰ菌株在96h時(shí)對(duì)地下水中硝酸鹽的去除率均高于99%，可見，3-Ⅰ菌株的脫氮性能基本不受地下水中其它離子的影響。

表4菌株3-Ⅰ分別處理3個(gè)地下水水樣的脫氮特性數(shù)據(jù)

3結(jié)語

本文依據(jù)本單位數(shù)年監(jiān)測數(shù)據(jù)選取了10個(gè)硝酸鹽污染的地下水水樣，經(jīng)溴百里酚藍(lán)（BTB）變色培養(yǎng)基初篩及搖瓶培養(yǎng)，從中成功分離篩選出1株高效反硝化細(xì)菌，命名為3-Ⅰ。經(jīng)16S rRNA基因序列分析，其與Rhizobium pusense sp和Beijerinckia fluminensissp的同源性為99%，還需進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)及電鏡觀察形態(tài)來進(jìn)一步確定種屬。該菌對(duì)pH的耐受范圍較大，在pH 5-10的條件下均能良好生長。3-Ⅰ菌株能夠以乙酸鈉為唯一碳源，硝酸鹽及亞硝酸鹽為氮源，搖瓶處理72h后在人工配水中硝酸鹽去除率高達(dá)99.9%，且無亞硝酸積累；在編號(hào)為W652、HJ121、HJ155三個(gè)地下水中的硝酸鹽去除率均高于99%，也無亞硝酸鹽積累。菌株3-Ⅰ在硝酸鹽人工配水和受硝酸鹽污染的北京地下水水樣中表現(xiàn)出優(yōu)異的脫氮性能，具有一定的工程應(yīng)用價(jià)值。

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李麗(1981—)，女，河北石家莊人，北京市水文地質(zhì)工程地質(zhì)大隊(duì)，碩士研究生，助理工程師，主要水資源保護(hù)方面的研究工作。