張桂林，馬慧萍，李蘭茹，董志臣，何 蕾，賈正平（蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥材科，蘭州 730050）

HPLC法測(cè)定抗骨質(zhì)增生片中淫羊藿苷的含量

張桂林＊，馬慧萍#，李蘭茹，董志臣，何 蕾，賈正平（蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥材科，蘭州 730050）

目的：建立測(cè)定抗骨質(zhì)增生片中淫羊藿苷含量的方法，以期為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Hypersil ODS2 C18，流動(dòng)相為乙腈-水（27∶73，V/V），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10 μl。結(jié)果：淫羊藿苷檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為3～60 μg/ml（r=0.999 9）；定量限為11.2 μg/ml，檢測(cè)限為4.3 μg/ml；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率為99.00%～100.67%（RSD=0.63%，n=6）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于測(cè)定抗骨質(zhì)增生片中淫羊藿苷的含量。

抗骨質(zhì)增生片；淫羊藿苷；高效液相色譜法；含量測(cè)定

抗骨質(zhì)增生片是蘭州軍區(qū)總醫(yī)院自制的純中藥制劑［批準(zhǔn)文號(hào)：蘭制字（2012）F00020號(hào)］，其是由熟地黃、雞血藤、肉蓯蓉、淫羊藿等多味中藥材經(jīng)提取加工而制成，具有滋補(bǔ)肝腎、強(qiáng)壯筋骨、益精養(yǎng)血、活血通絡(luò)的作用［1］；臨床主要用于治療骨質(zhì)增生及骨退行性病變等癥。淫羊藿為方中君藥，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效，其主要有效成分是黃酮類化合物淫羊藿苷［2］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷具有多種生物活性［3-7］，并有抗缺氧、抗氧化等多種生物學(xué)功效［8-10］。由于目前尚未有測(cè)定抗骨質(zhì)增生片中淫羊藿苷含量的報(bào)道，因此筆者采用高效液相色譜法（HPLC）建立了測(cè)定抗骨質(zhì)增生片中淫羊藿苷含量的方法，以期為進(jìn)一步完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

U-3000型HPLC儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；3300LH型超聲提取儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司，功率：220 W，頻率：40 kHz）；AE200型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

抗骨質(zhì)增生片（蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院自制，批號(hào)：100618、100622、100624、101118、101125，規(guī)格：0.3 g/片）；淫羊藿苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110737-200415，純度：98.5%）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2 C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（27∶73，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取淫羊藿苷對(duì)照品適量，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加甲醇制成每1 ml含淫羊藿苷300 μg的對(duì)照品貯備液。精密吸取上述貯備液1 ml，置于10 ml棕色量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品10片，除去薄膜衣，研細(xì)，取樣品細(xì)粉約0.2 g，精密稱定，置于10 ml具塞錐形瓶中，加甲醇10 ml，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；再置于10 ml棕色量瓶中備用。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 取除淫羊藿的其他藥材適量，按樣品的制備工藝和配方比例制備陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以淫羊藿苷峰計(jì)≥3 000，保留時(shí)間為11 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.淫羊藿苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.icariin

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液貯備液50、100、200、400、1 000、2 000 μl，分別置于10 ml棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以淫羊藿苷質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得淫羊藿苷的回歸方程為y=24 537.59x－3 740.01（r=0.999 9）。結(jié)果表明，淫羊藿苷檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為3～60 μg/ml。

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限為11.2 μg/ml；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限為4.3 μg/ml。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，淫羊藿苷峰面積的RSD= 0.97%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號(hào)：100618）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、6、8 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，淫羊藿苷峰面積的RSD=1.37%（n=6），表明供試品溶液在室溫下8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)：100618）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算平均含量。結(jié)果，淫羊藿苷的平均含量為1.18 mg/g，RSD=0.31%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)：100618）適量，共6份，每份約0.1 g，分別置于10 ml棕色量瓶中，加入一定質(zhì)量的淫羊藿苷對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab 1 Recovery test results（n=6）

2.10 樣品含量測(cè)定

取5批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算淫羊霍苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab 2 Results of contents determination of samples（n=3）

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇

筆者參考2015年版《中國(guó)藥典》（一部）［11］和相關(guān)文獻(xiàn)［3，12-14］中的溶劑，選擇甲醇、50%甲醇、50%乙醇作為提取溶劑。結(jié)果，甲醇作為提取溶劑時(shí)淫羊藿苷含量最高，提取效果最好。因此，本試驗(yàn)選擇甲醇為提取溶劑。

3.2 提取時(shí)間的考察

筆者考察了3個(gè)不同的超聲提取時(shí)間（20、30、40 min）。結(jié)果，超聲處理20 min時(shí)，樣品中的淫羊藿苷提取不完全，超聲處理30和40 min時(shí)淫羊藿苷提取量相當(dāng)，且可將樣品中的淫羊藿苷提取完全。因此，為了節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間，本試驗(yàn)的超聲處理時(shí)間選擇為30 min。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于測(cè)定抗骨質(zhì)增生片中淫羊藿苷的含量。

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［10］ Ma HP，Ma XN，Ge BF，et al.Icariin attenuates hypoxiainduced oxidative stress and apoptosis in osteoblasts and preserves their osteogenic differentiation potential in vitro［J］.Cell Prolif.2014，47（6）：527.

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（編輯：劉 柳）

Content Determination of Icariin in Kangguzhi Zengsheng Tablet by HPLC

ZHANG Guilin，MA Huiping，LI lanru，DONG Zhichen，HE Lei，JIA Zhengping（Dept.of Pharmacy，Lanzhou General Hospital，Lanzhou Military Command，Lanzhou 730050，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the content determination of icariin in Kangguzhi zengsheng tablet，and provide a basis for improving the quality standard.METHODS：HPLC was performed on the column of Hypersil ODS2 C18with mobile phase of acetonitrile-water（27∶73，V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，detection wavelength was 270 nm，column temperature was 25℃，and injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range of icariin was 3-60 μg/ml（r=0.999 9）；limit of quantitation was 11.2 μg/ml，limit of detection 4.3 μg/ml；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recovery was 99.00%-100.67%（RSD=0.63%，n=6）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and reproducible，and can be used for the content determination of icariin in Kangguzhi zengsheng tablet.

Kangguzhi zengsheng tablet；Icariin；HPLC；Content determination

R917

A

1001-0408（2016）30-4291-03

2015-11-02

2016-08-18）

＊主管藥師。研究方向：藥物分析。電話：0931-8994665。E-mail：13639366065@163.com

#通信作者：副主任藥師，博士。研究方向：藥物分析。電話：0931-8994671。E-mail：mahuipingcxr@aliyun.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.30.37