何 丹，楊曉梅，傅 亞，秦少容，張景勍（1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥物高校工程研究中心/重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 00016；.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶 0111；.重慶科技學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，重慶011；.太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司，重慶 08000）

RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定半夏糖漿中乙酸和琥珀酸的含量Δ

何 丹1＊，楊曉梅2，傅 亞3，秦少容4，張景勍1#（1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥物高校工程研究中心/重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400016；2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶 401121；3.重慶科技學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，重慶401331；4.太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司，重慶 408000）

目的：建立同時(shí)測(cè)定半夏糖漿中乙酸和琥珀酸含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法。色譜柱為GL InterSustain-C18，流動(dòng)相為0.03 mol/L磷酸二氫銨緩沖液（pH2.0）-甲醇（梯度洗脫），流速為0.8 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μl。結(jié)果：乙酸和琥珀酸檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.020 98～0.209 8（r=0.999 9）、12.04～120.4 μg/ml（r= 0.999 9）；定量限分別為0.15、18.24 ng，檢測(cè)限分別為0.045、5.53 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2%；加樣回收率分別為97.45%～101.68%（RSD=1.39%，n=9）、98.31%～101.08%（RSD=1.01%，n=9）。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、快速，適用于同時(shí)測(cè)定半夏糖漿中乙酸和琥珀酸的含量。

反相高效液相色譜法；半夏糖漿；乙酸；琥珀酸

半夏糖漿是由生半夏、紫苑、麻黃、桔梗等9味中藥材組成的復(fù)方口服制劑，具有止咳化痰的功效，臨床上常用于治療風(fēng)寒咳嗽、支氣管炎和咳嗽痰多等癥［1］。本品收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第9冊(cè)，但尚未被2015年版《中國(guó)藥典》收載?，F(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)僅采用理化鑒別對(duì)半夏糖漿中的甘草酸和橙皮苷進(jìn)行鑒別［1］，尚無(wú)有效成分含量測(cè)定項(xiàng)內(nèi)容。目前，對(duì)半夏糖漿有效成分的報(bào)道有采用薄層色譜法進(jìn)行定性鑒別［2］，有采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定半夏糖漿中甘草酸和橙皮苷的含量［3-5］或者測(cè)定麻黃堿和鹽酸麻黃堿的含量［6-10］，也有采用氣相色譜法（GC）測(cè)定半夏糖漿中薄荷腦含量［11］的報(bào)道。半夏為天南星科植物半夏的干燥塊莖，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)的功效［12］，半夏塊莖中主要含有有機(jī)酸和多糖類(lèi)成分［13-14］，其中有機(jī)酸有鎮(zhèn)咳祛痰的藥理作用［15］，為半夏糖漿止咳功效的主要有效成分。目前尚未見(jiàn)對(duì)半夏糖漿中有機(jī)酸——乙酸和琥珀酸進(jìn)行含量測(cè)定的報(bào)道，因此本課題組采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）同時(shí)測(cè)定半夏糖漿中乙酸和琥珀酸的含量，以期為半夏糖漿的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20型HPLC儀（日本Shimadzu公司）；AG135型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

半夏糖漿（李時(shí)珍醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)：201404003、201404001、201401002，規(guī)格：100 ml/瓶）；琥珀酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110896-200001，純度≥99.0%）；乙酸對(duì)照品（重慶川東化工有限公司，批號(hào)：20130801，純度≥99.0%）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：GL InterSustain-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.03 mol/L磷酸二氫銨緩沖液（pH2.0）（A）-甲醇（B），梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表1）；流速：0.8 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密量取乙酸對(duì)照品0.1 ml，精密稱(chēng)取琥珀酸對(duì)照品60.18 mg，置于同一50 ml量瓶中，加水溶解并定容，得乙酸和琥珀酸的混合對(duì)照品貯備液；精密量取上述貯備液2.5 ml，置于25 ml量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，得乙酸和琥珀酸質(zhì)量濃度分別為0.209 8、120.4 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密吸取樣品1 ml，置于10 ml量瓶中，加水溶解并定容，經(jīng)0.45 μm混合纖維樹(shù)脂膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按樣品的制備工藝和處方比例制備缺乙酸和琥珀酸的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，乙酸和琥珀酸均能達(dá)到基線分離，分離度＞2，拖尾因子均＜2.0；理論板數(shù)按乙酸峰計(jì)≥3 000，保留時(shí)間為8.9 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.乙酸；2.琥珀酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control；1.acetic acid；2.succinic acid

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10 ml，分別置于10 ml量瓶中，加水溶解并定容，即得系列線性溶液，取上述溶液適量，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得乙酸的回歸方程為y=47 926x－973.96（r=0.999 9）、琥珀酸的回歸方程為y=55.466x－478.5（r= 0.999 9）。結(jié)果表明，乙酸和琥珀酸檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.020 98～0.209 8、12.04～120.4 μg/ml。

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，等倍逐步稀釋?zhuān)础?.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得乙酸和琥珀酸的定量限分別為0.15、18.24 ng；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得乙酸和琥珀酸的檢測(cè)限分別為0.045、5.53 ng。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，乙酸和琥珀酸峰面積的RSD分別為1.29%、0.81%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：201404003）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，乙酸和琥珀酸峰面積的RSD分別為0.95%、1.31%（n=6），表明供試品溶液在室溫下10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一批樣品（批號(hào)：201404003）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，乙酸和琥珀酸峰面積的RSD分別為0.86%、1.22%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已測(cè)知含量的樣品（批號(hào)：201404003）適量，共9份，每份0.5 ml，分別置于10 ml量瓶中，分別加入一定質(zhì)量的乙酸和琥珀酸對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab 2 Results of recovery tests（n=9）

2.10 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算乙酸和琥珀酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab 3 Results of contents determination of samples（n=3）

3 討論

3.1 流動(dòng)相pH的選擇

本課題組考察了流動(dòng)相pH分別為2.8、2.6、2.4、2.2、2.0時(shí)對(duì)樣品中乙酸和琥珀酸分離情況的影響。結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相pH為2.8時(shí)，乙酸和琥珀酸與相鄰組分之間的分離度不夠理想，峰形較差，影響測(cè)定的準(zhǔn)確度；當(dāng)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH為2.0時(shí)，乙酸和琥珀酸峰形較好，且與相鄰組分能夠得到較好的分離。因此，本試驗(yàn)選擇流動(dòng)相的pH為2.0。

3.2 緩沖液種類(lèi)的選擇

本課題組分別選擇磷酸二氫銨、磷酸二氫鉀作為流動(dòng)相中的緩沖液，考察不同緩沖液對(duì)乙酸和琥珀酸分離度的影響。結(jié)果，當(dāng)選擇磷酸二氫鉀作為緩沖液時(shí)，乙酸和琥珀酸色譜峰均出現(xiàn)拖尾峰，峰形較寬；當(dāng)選擇磷酸二氫銨作為緩沖液時(shí)，乙酸和琥珀酸的峰形較好，分離度較好。因此，選擇磷酸二氫銨為本試驗(yàn)的緩沖液。

綜上所述，本方法準(zhǔn)確、快速，適用于同時(shí)測(cè)定半夏糖漿中乙酸和琥珀酸的含量。

［1］衛(wèi)生部藥典委員會(huì).衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑：第9冊(cè)［S］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1994：186-186.

［2］ 朱山寅.半夏糖漿的薄層鑒別研究［J］.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，14（1）：43.

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Simultaneous Determination ofAceticAcid and SuccinicAcid in Banxia Syrup by RP-HPLC

HE Dan1，YANG Xiaomei2，F(xiàn)U Ya3，QIN Shaorong4，ZHANG Jingqing1（1.Medicine Engineering Research Center of Chongqing Medical University/College of Pharmacy，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing 401121，China；3.College of Chemistry and Chemical Engineering，Chongqing University of Science and Technology，Chongqing 401331，China；4.Taiji Chongqing Fuling Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Chongqing 408000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of acetic acid and succinic acid in Banxia syrup.METHODS：RP-HPLC was performed on the column of GL InterSustain-C18with mobile phase of 0.03 mol/L ammonium dihydrogen phosphate buffer solution（pH2.0）-methanol（gradient elution）at a flow rate of 0.8 ml/min，the detection wavelength was 210 nm，column temperature was 30℃，injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range was 0.020 98-0.209 8 μg/ml for acetic acid（0.999 9）and 12.04-120.4 μg/ml for succinic acid（r=0.999 9）；limits of quantification were 0.15，18.24 ng，limits of detection were 0.045，5.53 ng；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recoveries were 97.45%-101.68%（RSD=1.39%，n=9）and 98.31%-101.08%（RSD=1.01%，n=9）.CONCLUSIONS：The method is accurate and rapid，and suitable for the simultaneous determination of acetic acid and succinic acid in Banxia syrup.

RP-HPLC；Banxia syrup；Acetic acid；Auccinic acid

R917

A

1001-0408（2016）30-4264-03

2015-11-01

2016-07-16）

（編輯：劉 柳）

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（No.KJ1500225）

＊副教授，碩士。研究方向：藥物分析。電話：023-68589782。E-mail：ildoctor@163.com

#通信作者：教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：藥物新劑型。E-mail：zjqrae01@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.30.28