姜 暉，王 玉，付連浩，張熙潔，劉曉紅（唐山市工人醫(yī)院，河北唐山 063000）

HPLC法同時(shí)測(cè)定精制冠心顆粒中5種成分的含量Δ

姜 暉＊，王 玉，付連浩，張熙潔，劉曉紅#（唐山市工人醫(yī)院，河北唐山 063000）

目的：建立同時(shí)測(cè)定精制冠心顆粒中丹參素、丹酚酸B、原兒茶醛、芍藥苷和阿魏酸含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Zorbax Eclipse XDB-C18，流動(dòng)相為乙腈-甲醇-0.5%磷酸（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長為280 nm（丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B）、230 nm（芍藥苷）、320 nm（阿魏酸），柱溫為30℃，進(jìn)樣量為1.0 μl。結(jié)果：丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、芍藥苷和阿魏酸檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為1.19～478.34 μg/ml（r=0.999 9）、0.11～44.93 μg/ml（r=0.999 9）、7.49～995.20 μg/ml（r=0.999 7）、0.95～379.39 μg/ml（r=0.999 9）、0.01～3.12 μg/ml（r=0.999 5）；定量限分別為1.91、0.36、150.00、2.74、0.10 ng，檢測(cè)限分別為0.96、0.10、45.00、1.52、0.03 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2%；加樣回收率分別為98.06%～99.47%（RSD= 0.52%，n=6）、98.01%～99.49%（RSD=0.70%，n=6）、98.44%～99.45%（RSD=0.37%，n=6）、96.94%～100.71%（RSD= 1.27%，n=6）、95.44%～100.44%（RSD=1.90%，n=6）。結(jié)論：該方法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于同時(shí)測(cè)定精制冠心顆粒中丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、芍藥苷和阿魏酸的含量。

含量測(cè)定；高效液相色譜法；丹參素；原兒茶醛；丹酚酸B；芍藥苷；阿魏酸

精制冠心顆粒收載于2015年版《中國藥典》（一部）［1］，由丹參、赤芍、川芎、紅花、降香5味中藥材組成。丹參為該方君藥，輔以川芎、紅花、赤芍，佐以降香，用于氣滯血瘀、胸痹、心痛、舌赤瘀斑、脈弦等證；可用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞等疾?。?］。其中，丹參可用于胸肋脅痛、風(fēng)濕痹痛、癥瘕結(jié)塊、瘡瘍腫痛、跌仆傷痛、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、產(chǎn)后瘀痛等證；赤芍中的芍藥苷可用于治療冠心病、增強(qiáng)體質(zhì)與免疫功能、抗炎止咳、祛痰平喘等，尤其是針對(duì)老年慢性呼吸道疾病的治療可作輔助藥物；川芎中含有的阿魏酸具有抗血小板聚集、增強(qiáng)前列腺素活性、鎮(zhèn)痛、緩解血管痙攣等作用，是生產(chǎn)用于治療心腦血管疾病及白細(xì)胞減少癥藥品的基本原料。精制冠心顆粒作為中藥復(fù)方制劑，其成分復(fù)雜，藥理作用是多種藥理成分共同作用的結(jié)果，然而藥典標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)的文獻(xiàn)僅考察了其中少數(shù)成分的含量［3-7］，因此筆者采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定丹參中的活性成分［8］丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B，赤芍［9］中的活性成分芍藥苷以及川芎中的活性成分阿魏酸［10-13］，以期為精制冠心顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1200型HPLC儀，包括G1311A型四元泵、G1322A型脫氣機(jī)、G1316A型柱溫箱、G1329A型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1315D型二極管陣列檢測(cè)器（美國Agilent公司）；ELITE-TEST型真空抽濾泵（大連依利特分析儀器有限公司）；CP225D型分析天平（德國Sartorius公司）；80-2型離心沉淀機(jī)（上海手術(shù)器械廠）；FS-150型超聲波提取器（上海生析超聲儀器有限公司，功率：300 W，頻率：20 kHz）。

1.2 藥品與試劑

精制冠心顆粒（陜西漢唐制藥有限公司，批號(hào)：131001、120801、120501，規(guī)格：13 g/袋；吉林益民堂制藥有限公司，批號(hào)：20130502，規(guī)格：13 g/袋；廣州白云山奇星藥業(yè)有限公司，批號(hào)：121124，規(guī)格：13 g/袋）；丹參素鈉對(duì)照品（批號(hào)：110855-200507，純度：98%）、原兒茶醛對(duì)照品（批號(hào)：110810-200205，純度＞98%）、丹酚酸B對(duì)照品（批號(hào)：111562-201212，純度≥98%）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-200423，純度＞98%）和阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：0773-9910，純度＞98%）均購自中國食品藥品檢定研究院；丹參免煎顆粒（批號(hào)：1306761）、川芎免煎顆粒（批號(hào)：1305807）、紅花免煎顆粒（批號(hào)：1305725）、降香免煎顆粒（批號(hào)：1208734）、赤芍免煎顆粒（批號(hào)：6053132）均購自廣東一方制藥有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，磷酸、冰乙酸、甲酸、無水乙醇和乙醚均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-甲醇（B）-0.5%磷酸（C），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長：280 nm（丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B）、230 nm（芍藥苷）、320 nm（阿魏酸）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量10 μl。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Conditions of gradient elution

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取丹參素鈉對(duì)照品13.250 mg（相當(dāng)于丹參素11.958 mg），置于5 ml量瓶中；原兒茶醛對(duì)照品5.616 mg，置于25 ml量瓶中；丹酚酸B對(duì)照品14.976 mg，置于1 ml量瓶中；芍藥苷對(duì)照品18.970 mg，置于10 ml量瓶中；阿魏酸對(duì)照品0.780 mg，置于50 ml量瓶中，分別加甲醇溶解并定容，制成丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、芍藥苷、阿魏酸的質(zhì)量濃度分別為2 650.00、224.64、14 976.00、1 897.00、15.60 μg/ml的單一對(duì)照品貯備液。分別精密吸取上述單一對(duì)照品貯備液各1 ml，置于5 ml量瓶中，搖勻，即得丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、芍藥苷和阿魏酸的質(zhì)量濃度分別為478.34、44.93、2 995.20、379.40、3.12 μg/ml的混合對(duì)照品貯備液；再精密吸取上述混合對(duì)照品貯備液1 ml，置于5 ml量瓶中，加3 ml甲醇稀釋，即得丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、芍藥苷和阿魏酸的質(zhì)量濃度分別為119.58、11.23、748.80、94.85、0.80 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。2.2.2 供試品溶液 取樣品0.7 g，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加9 ml水溶解，超聲處理30 min，冷卻至室溫后加水定容，以半徑5 cm、1 500 r/min離心30 min，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 用免煎顆粒代替丹參、川芎、紅花、降香、赤芍藥材，按樣品的制備工藝和配方比例制備陰性對(duì)照品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；各成分的理論板數(shù)以芍藥苷峰計(jì)＞4 000，保留時(shí)間為18.5 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.缺丹參的陰性對(duì)照；D.缺赤芍的陰性對(duì)照；E.缺川芎的陰性對(duì)照；1.丹參素；2.原兒茶醛；3.芍藥苷；4.阿魏酸；5.丹酚酸BA.mixed reference substances；B.test sample；C.negative control without Salvia miltiorrhiza；D.negative control without Radix panoniae；E. negative controlwithoutLigusticum chuanxiong；1.danshensu；2. protocatechuic aldehyde；3.peoniflorin；4.ferulic acid；5.salvianolic acid B

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 μl，用甲醇倍比稀釋，制成系列線性溶液。精密量取上述系列線性溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程與線性范圍見表2。

表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限（LOQ）；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限（LOD），結(jié)果見表3。

表3 定量限與檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果Tab 3 Determination results of detection limit and quantitation limit

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、芍藥苷和阿魏酸峰面積的RSD分別為1.40%、1.86%、1.71%、0.91%、1.94%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：131001）10 μl，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、芍藥苷和阿魏酸峰面積的RSD分別為1.17%、1.09%、0.83%、0.86%、1.53%（n=7），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批（批號(hào)：131001）樣品適量，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、芍藥苷和阿魏酸峰面積的RSD分別為1.66%、1.72%、1.31%、1.94%、1.96%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：131001）適量，共6份，每份約0.35 g，精密稱定，分別加入低、中、高質(zhì)量的丹參素、丹酚酸B、原兒茶醛、芍藥苷、阿魏酸對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab 4 Results of recovery tests（n=6）

2.10 樣品含量測(cè)定

分別取5批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品中丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、芍藥苷和阿魏酸的含量，結(jié)果見表5。

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3，mg/g）Tab 5 Results of contents determination of samples（n=3，mg/g）

3 討論

3.1 提取方式的選擇

本試驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行前處理時(shí)比較了索氏提取和超聲提取兩種方法，在相同的提取時(shí)間下索氏提取的提取率與超聲提取無明顯的區(qū)別，但索氏提取不如超聲提取簡單、方便、安全，因此本試驗(yàn)選用超聲提取對(duì)樣品進(jìn)行前處理。

本試驗(yàn)還考察了超聲提取時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）。結(jié)果，丹參素、原兒茶醛、芍藥苷、阿魏酸在30 min時(shí)提取率相對(duì)較大；而丹酚酸B在40 min時(shí)的提取率相對(duì)較大，故本試驗(yàn)綜合考慮5種成分的提取率，超聲時(shí)間選擇30 min。

3.2 陰性對(duì)照品的制備

本試驗(yàn)用免煎顆粒按照2015年版《中國藥典》（一部）中精制冠心顆粒的制備工藝和配方比例來制作陰性對(duì)照品，用免煎顆粒制作的陰性對(duì)照品的HPLC圖譜與生產(chǎn)工藝的陰性對(duì)照?qǐng)D譜相比，雖有所差異，但對(duì)本試驗(yàn)中要測(cè)的5種成分影響不大，鑒于有些陰性對(duì)照品不容易找到，而且按照該藥的處方工藝制備陰性對(duì)照品程序比較煩瑣、所用設(shè)備不齊全等，且用免煎顆粒制作陰性對(duì)照品方法簡單也不影響試驗(yàn)結(jié)果，故本試驗(yàn)用免煎顆粒制作陰性對(duì)照品。

綜上所述，本方法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于同時(shí)測(cè)定精制冠心顆粒中丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、芍藥苷和阿魏酸的含量。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部［S］.2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：1 700.

［2］Zhang H，Yu C，Jia JY，et al.Contents of four active components in differern commercia crude drugs and preparations of Danshen Salvia miltiorrhiza［J］.Acta Pharmacol Sin，2002，23（12）：110.

［3］Yuan JC，Yin YQ，Shen ZB，et al.Simultaneous determination of danshensu，protocatechuic aldehyde，caffeic acid，rosmarinci acid，salvianolic acid B，and salvianolic acid A in Xiandan Injection by HPLC［J］.Chin Tradit HerbalDrugs，2009（40）：128.

［4］閻便杰，李彤暉，劉珍.HPLC法測(cè)定精制冠心顆粒中原兒茶醛的含量［J］.陜西中醫(yī)，2005，26（4）：376.

［5］黃海欣.HPLC法測(cè)定精制冠心顆粒中丹酚酸B的含量［J］.中國藥師，2009，12（11）：1 665.

［6］王俊杰，劉弘，于天杰，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定精制冠心顆粒中芍藥苷與丹酚酸B含量［J］.中國藥師，2013，16（8）：1 175.

［7］王新立，張?jiān)饺A.HPLC法測(cè)定精制冠心顆粒中芍藥苷的含量［J］.陜西中醫(yī)，2007，28（5）：601.

［8］姜暉，張麗英，王紹志，等.HPLC法測(cè)定消渴平片中5種成分［J］.中草藥，2015，46（4）：530.

［9］姜暉，王紹志，張熙潔，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定利腦心膠囊中6種成分的含量［J］.中國藥房，2015，26（3）：374.

［10］付連浩，張熙潔，王紹志，等.多波長RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定參芍口服液中5種成分的含量［J］.中國藥房，2015，26（24）：3 423.

［11］冀蘭鑫，黃浩，姜民，等.HPLC測(cè)定血必凈注射液內(nèi)11種主要成分［J］.中國中藥雜志，2010，35（18）：2 395.

［12］馬彬峽，陳恒沖，吳春高，等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定樂脈顆粒中丹參素、原兒茶醛、芍藥苷和阿魏酸的含量［J］.藥物分析雜志，2009，29（7）：1 122.

［13］陳斌，葉雋，紀(jì)峰，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定腦血栓片中丹參素、原兒茶醛、芍藥苷、阿魏酸和丹酚酸B的含量［J］.藥物分析雜志，2007，27（12）：1 891.

Simultaneous Determination of Five Components in Jingzhi Guanxin Granule by HPLC

JIANG Hui，WANG Yu，F(xiàn)U Lianhao，ZHANG Xijie，LIU Xiaohong（Tangshan Worker’s Hospital，Hebei Tangshan 063000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of danshensu，salvianolic acid B，protocatechuic aldehyde，paeoniflorin and ferulic acid in Jingzhi guanxin granule.METHODS：HPLC was performed on the column of Zorbax Eclipse XDB-C18with mobile phase of acetonitrile-methanol-0.5%H3PO4（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 280 nm（for danshensu，protocatechuic aldehyde，salvianolic acid B），230 nm（for ferulic acid）and 320 nm（for paeoniflorin），column temperature was 30℃，injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range was 1.19-478.34 μg/ml for danshensu（r=0.999 9），0.11-44.93 μg/ml for protocatechuic aldehyde（r=0.999 9），7.49-995.20 μg/ml for salvianolic acid B（r=0.999 7），0.95-379.39 μg/ml for paeoniflorin（r=0.999 9）and 0.01-3.12 μg/ml for ferulic acid（r=0.999 5）；the limits of quantitation were 1.91 ng，0.36 ng，150.00 ng，2.74 ng and 0.10 ng，limit of detection were 0.96 ng，0.10 ng，45.00 ng，1.52 ng and 0.03 ng；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recoveries were 98.06%-99.47%（RSD= 0.52%，n=6），98.01%-99.49%（RSD=0.70%，n=6），98.44%-99.45%（RSD=0.37%，n=6），96.94%-100.71%（RSD= 1.27%，n=6）and 95.44%-100.44%（RSD=1.90%，n=6）.CONCLUSIONS：The method is simple and accurate，and suitable for the simultaneous determination of danshensu，salvianolic acid B，protocatechuic aldehyde，paeoniflorin and ferulic acid in Jingzhi guanxin granule.

Content determination；HPLC；Danshensu；Protocatechuic aldehyde；Salvianolic acid B；Paeoniflorin；Ferulic acid

R917

A

1001-0408（2016）30-4261-04

2015-10-30

2016-07-19）

（編輯：劉 柳）

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.C2011105042）

＊副主任藥師，碩士研究生。研究方向：藥理學(xué)、臨床藥學(xué)、藥物分析學(xué)。電話：0315-3722840。E-mail：jianghui910@163.com

#通信作者：主任藥師，博士研究生。研究方向：藥理學(xué)、臨床藥學(xué)、藥物分析學(xué)。電話：0315-3722435。E-mail：13930520000@163. com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.30.27