譚 璐，張廣求，劉 文（黃岡市中心醫(yī)院藥劑科，湖北黃岡 438000）

HPLC法同時(shí)測(cè)定參菊洗劑中4種成分的含量Δ

譚 璐＊，張廣求#，劉 文（黃岡市中心醫(yī)院藥劑科，湖北黃岡 438000）

目的：建立同時(shí)測(cè)定參菊洗劑中苦參堿、蒙花苷、鹽酸小檗堿和蛇床子素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Dionex C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%三乙胺水溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.2）（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20 μl。結(jié)果：苦參堿、蒙花苷、鹽酸小檗堿和蛇床子素檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為1.400～8.400 μg（r=0.999 4）、0.152～0.912 μg（r=0.999 6）、0.248～1.488 μg（r=0.999 9）、0.128～0.768 μg（r=0.999 4）；定量限分別為84.85、3.15、15.03、7.76 ng，檢測(cè)限分別為24.13、0.89、4.27、2.20 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2%；加樣回收率分別為96.29%～99.06%（RSD=1.10%，n=9）、96.49%～98.27%（RSD=0.69%，n=9）、99.26%～101.13%（RSD=0.62%，n=9）、96.27%～98.64%（RSD=0.89%，n=9）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定參菊洗劑中苦參堿、蒙花苷、鹽酸小檗堿和蛇床子素的含量。

參菊洗劑；苦參堿；蒙花苷；鹽酸小檗堿；蛇床子素；高效液相色譜法；含量測(cè)定

參菊洗劑是黃岡市中心醫(yī)院自主研制并在臨床應(yīng)用多年的中藥制劑（批準(zhǔn)文號(hào)：鄂藥制字Z20110230），由苦參、野菊花、黃柏、蛇床子等12味中藥材組成，具有消炎、止癢、除穢、殺菌等功效，可用于細(xì)菌性、真菌性、滴蟲(chóng)性陰道炎及多種皮膚瘙癢癥，療效較好［1］。方中苦參為君藥，野菊花、黃柏、蛇床子為主要藥材?？鄥⒕哂锌沟蜗x(chóng)作用，對(duì)痢疾桿菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制作用；野菊花對(duì)金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、大腸埃希菌及多種致病性桿菌、皮膚真菌均有一定抗菌作用；黃柏有殺滅陰道滴蟲(chóng)作用，對(duì)金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和多種致病性皮膚真菌均有抑制作用；蛇床子有抗滴蟲(chóng)作用，對(duì)絮狀表皮癬菌、石膏樣小芽胞菌、羊毛狀小芽胞菌有抑制作用［2］。參菊洗劑收錄于2011年版《湖北省醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》中，該制劑規(guī)范只采用薄層色譜法對(duì)苦參、野菊花、黃柏、蛇床子進(jìn)行定性鑒別，而沒(méi)有對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定。因此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時(shí)測(cè)定參菊洗劑中苦參、野菊花、黃柏、蛇床子中的有效成分苦參堿、蒙花苷、鹽酸小檗堿和蛇床子素含量的方法，以期為更好地控制該制劑的質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate 3000型HPLC儀，包括Ultimate 3000泵、Ultimate 3000紫外檢測(cè)器、UltiMate 3000 WPS自動(dòng)進(jìn)樣器、Chromeleon高效液相數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)Dionex公司）；FA1604型萬(wàn)分之一電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；pHs-3C型pH計(jì)（杭州奧立龍儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

參菊洗劑（黃岡市中心醫(yī)院自制，批號(hào)：141105、141201、150209，規(guī)格：500 ml/瓶）；苦參堿對(duì)照品（批號(hào)：110805-200508，純度：99.80%）、蒙花苷對(duì)照品（批號(hào)：111528-201308，純度：99.50%）、鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：110713-201212，純度：99.00%）、蛇床子素對(duì)照品（批號(hào)：110822-201308，純度：99.00%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，乙酸乙酯、三乙胺、磷酸、氨水均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dionex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%三乙胺水溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.2）（B），梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表1）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱(chēng)取苦參堿對(duì)照品0.017 5 g、蒙花苷對(duì)照品0.001 9 g、鹽酸小檗堿對(duì)照品0.003 1 g、蛇床子素對(duì)照品0.001 6 g，置于同一25 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為700、76、124、64 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Conditions of gradient elution

2.2.2 供試品溶液 精密量取樣品5 ml，置于分液漏斗中，用氨水調(diào)節(jié)pH至9.3，加乙酸乙酯置于分液漏斗中，振搖提取3次，每次20 ml，合并乙酸乙酯提取液，揮干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0 ml量瓶中，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按樣品的處方比例和制備工藝，分別制備不含苦參、野菊花、黃柏和蛇床子的陰性樣品，然后按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以苦參堿峰計(jì)＞2 000，保留時(shí)間為20 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6 ml，分別置于10 ml量瓶中，加甲醇定容，制成系列線性溶液。取上述溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得苦參堿、蒙花苷、鹽酸小檗堿和蛇床子素的回歸方程與線性范圍，見(jiàn)表2。

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，等倍逐步稀釋?zhuān)础?.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限（LOQ）；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限（LOD），結(jié)果見(jiàn)表3。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，苦參堿、蒙花苷、鹽酸小檗堿和蛇床子素峰面積的RSD分別為0.41%、0.37%、0.58%、0.66%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，苦參堿、蒙花苷、鹽酸小檗堿和蛇床子素峰面積的RSD分別為0.89%、0.77%、1.15%、1.23%（n=7），表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.缺苦參的陰性對(duì)照；D.缺野菊花的陰性對(duì)照；E.缺黃柏的陰性對(duì)照；F.缺蛇床子的陰性對(duì)照；1.苦參堿；2.蒙花苷；3.鹽酸小檗堿；4.蛇床子素Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control without Sophora flavescens；D.negative control without Chrysanthemum indicm；E.negative control without Phellodendron chinese；F.negative control without Cnidium monnieri；1.matrine；2.linarin；3.berberine hydrochloride；4.osthole

表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

表3 定量限與檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果Tab 3 Determination results of quantitation limit and detection limit

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)：150209）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，苦參堿、蒙花苷、鹽酸小檗堿和蛇床子素的平均含量分別為297.76、10.88、47.33、11.06 μg/ml；RSD分別為0.69%、0.85%、1.00%、0.91%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的樣品（批號(hào)：141105）適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量的苦參堿、蒙花苷、鹽酸小檗堿和蛇床子素對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab 4 Results of recovery tests（n=9）

2.10 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算苦參堿、蒙花苷、鹽酸小檗堿和蛇床子素的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3，μg/g）Tab 5 Results of contents determination of samples（n=3，μg/g）

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

苦參堿的檢測(cè)波長(zhǎng)主要為210［3］、220［4-5］、230 nm［6］等，蒙花苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為268、334 nm［7］，鹽酸小檗堿的檢測(cè)波長(zhǎng)為228、264、346 nm［8］，蛇床子素的檢測(cè)波長(zhǎng)為206［9］、322 nm［10］。筆者嘗試在不同檢測(cè)波長(zhǎng)處測(cè)定參菊洗劑中4種待測(cè)成分，結(jié)果在210 nm波長(zhǎng)處，4種成分均有較好的響應(yīng)值，且其他雜質(zhì)干擾較小，故本試驗(yàn)選擇210 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 提取溶劑的考察

預(yù)試驗(yàn)時(shí)，筆者考察了甲醇、乙醚、乙酸乙酯作為提取溶劑。結(jié)果，相同提取條件下，乙酸乙酯提取率最高，故本試驗(yàn)選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。為確定最佳提取溶劑體積和提取次數(shù)，筆者選用乙酸乙酯30、20、15 ml/次分別振搖提取3次或者4次，以峰面積比較提取效果。結(jié)果，乙酸乙酯20 ml/次振搖提取3次即可有效提取出樣品中4種待測(cè)成分，故本試驗(yàn)選擇乙酸乙酯的提取體積為20 ml/次，提取次數(shù)為3次。

3.3 流動(dòng)相的選擇

筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)［11-15］，考察了乙腈-不同濃度磷酸溶液、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀水溶液和乙腈-0.1%三乙胺水溶液（磷酸調(diào)節(jié)不同pH）等不同流動(dòng)相進(jìn)行等度和梯度洗脫。結(jié)果，以乙腈-0.1%三乙胺水溶液（磷酸調(diào)節(jié)pH至7.2）梯度洗脫效果最佳，各色譜峰峰形、分離度均較好且基線較平穩(wěn)。因此，本試驗(yàn)選擇乙腈-0.1%三乙胺水溶液（磷酸調(diào)節(jié)pH至7.2）為流動(dòng)相，洗脫方式為梯度洗脫。

綜上所述，本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定參菊洗劑中苦參堿、蒙花苷、鹽酸小檗堿和蛇床子素的含量。

［1］劉文，譚璐，張廣求，等.參菊洗劑治療陰道炎的療效觀察［J］.臨床合理用藥雜志，2015，8（9）：21.

［2］張廣求，劉文，譚璐，等.參菊洗劑體外抑菌作用［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，34（8）：1 032.

［3］李翔，劉皈陽(yáng)，馬建麗，等.HPLC法測(cè)定扁咽口服液中苦參堿的含量［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2014，30（6）：532.

［4］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部［S］.2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：202-203.

［5］侯杰榮，柯發(fā)敏，侯思奎.HPLC法同時(shí)測(cè)定苦參中3種生物堿的含量［J］.中藥材，2014，37（2）：273.

［6］王慧，毛春芹，周淵，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定舒樂(lè)洗劑中苦參堿和小檗堿［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（12）：88.

［7］王伯濤，王峰，張同波，等.反相高效液相色譜法測(cè)定野菊花中蒙花苷的含量［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（1）：166.

［8］徐璐揚(yáng)，李中東，劉慶豐，等.HPLC測(cè)定三黃湯中4種成分含量［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2011，28（12）：1 135.

［9］楊娟，黃敬群.除濕止汗散的制備及質(zhì)量控制［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31（2）：154.

［10］黃良永，鄭江萍，甘春英.獨(dú)活藥材及其配方顆粒中蛇床子素的含量比較［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，29（1）：90.

［11］胡軍林，譚靜玲，費(fèi)毅琴，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定一清顆粒中3種原小檗堿型生物堿的含量［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2014，34（1）：50.

［12］唐春麗，陸石英，覃文慧，等.多波長(zhǎng)HPLC法同時(shí)測(cè)定清胃黃連片中4種成分的含量［J］.中藥材，2014，37（6）：1 062.

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［14］韓永成，龔海燕，劉偉，等.UPLC同時(shí)測(cè)定野菊花中蒙花苷和綠原酸含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（20）：88.

［15］李義敏，張巧艷，秦路平，等.HPLC法測(cè)定蛇床子中3種香豆素類(lèi)成分的含量［J］.中藥材，2015，38（7）：1 441.

Simultaneous Determination of Four Components in Shenju Lotion by HPLC

TAN Lu，ZHANG Guangqiu，LIU Wen（Dept.of Pharmacy，Huanggang Central Hospital，Hubei Huanggang 438000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of matrine，linarin，berberine hydrochloride and osthole in Shenju lotion.METHODS：HPLC was performed on the column of Dionex C18with mobile phase of acetonitrle-0.1%triethylamine（pH was adjusted to 7.2 with phosphoric）（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，detection wavelength was 210 nm，column temperature was 30℃，and injection volume was 20 μl.RESULTS：The linear range was 1.400-8.400 μg for matrine（r=0.999 4），0.152-0.912 μg for linarin（r=0.999 6），0.248-1.488 μg for berberine hydrochloride（r=0.999 9）and 0.128-0.768 μg for osthole（r=0.999 4）；limit of quantitation was 84.85，3.15，15.03，7.76 ng，limit of detection was 24.13，0.89，4.27，2.20 ng；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recoveries were 96.29%-99.06%（RSD=1.10%，n=9），96.49%-98.27%（RSD=0.69%，n=9），99.26%-101.13%（RSD=0.62%，n=9）and 96.27%-98.64%（RSD=0.89%，n=9）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and reproducible，and can be used for the simultaneous determination of matrine，linarin，berberine hydrochloride and osthole in Shenju lotion.

Shenju lotion；Matrine；Linarin；Berberine hydrochloride；Osthole；HPLC；Content determination

R282.71；R927.2

A

1001-0408（2016）30-4257-04

2015-11-27

2016-08-13）

（編輯：劉 柳）

黃岡市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.黃科〔字2013〕76號(hào)）

＊主管藥師，碩士。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)、藥物分析。電話：0713-8625312。E-mail：tanlu05@126.com

#通信作者：副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)、藥物分析。E-mail：ccnpa@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.30.26