耿明星，吳 婷，張 娟，楊 意，劉小康，舒建洪

(浙江理工大學生命科學學院，杭州 310018)

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Wnt5a信號通路調控NRTI引起的小腦神經炎癥的研究

耿明星，吳 婷，張 娟，楊 意，劉小康，舒建洪

(浙江理工大學生命科學學院，杭州 310018)

分別用NRTI類藥物AZT(100 mg/kg)和3TC(50 mg/kg)對C57BL/6小鼠進行2、5、14 d的處理，并于藥物處理結束時采集小鼠小腦。通過Western blotting檢測兩種藥物處理不同時間后小腦中炎癥因子IL-1β, TNF-α和 IL-6的表達水平，觀察到炎癥因子在小腦中都顯著性增加。然后通過HE染色研究NRTI作用5 d對小腦病變的影響，組織形態(tài)學分析表明， NRTI藥物作用5 d未引起小腦發(fā)生顯著病變。通過Western blotting檢測到小腦中NRTI可明顯上調Wnt5a，提示NRTI可能激活Wnt5a，再利用Wnt5a的特異性拮抗劑BOX5來抑制Wnt5a，BOX5可以顯著性降低NRTI誘導的炎癥因子上調。因此，Wnt5a信號通路參與調控NRTI引起的小腦神經炎癥。

NRTI；小腦；神經炎癥 ；Wnt5a信號通路；BOX5

0 引 言

人類感染人類免疫缺陷病毒(HIV-1)會導致獲得性免疫缺乏綜合癥[1]。截至2016年2月， 全國報告現存活艾滋病病毒(HIV)感染者/AIDS病人581632例，報告死亡185959例[2]。HIV-1流行疾病可以說是人類歷史上的一大瘟疫，同時也是對藥物、公眾健康和醫(yī)學研究的一項大挑戰(zhàn)。在1996年，高效抗逆轉錄病毒治療(HAART)的引入在全球范圍內極大地延長了患者的壽命，穩(wěn)定了AIDS流行病。這個療法可以將血漿中的病毒水平降到可檢測水平以下(<20個復制數目/mL)[3]。核苷類逆轉錄酶抑制劑(nucleoside reverse transcriptase inhibitor ，NRTI)作為HAART的一個核心組成部分，被廣泛用于抑制HIV的復制和增殖。然而，長期服用NRTI類藥物可引發(fā)神經毒性[4-5]，主要表現為神經炎癥和多種神經認知障礙，如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病和慢性疼痛等[6-7]。盡管NRTI用于治療艾滋病已有數十年，但目前對于NRTI引發(fā)神經炎癥的具體機制還是不甚明了。

Wnt5a是非典型Wnt信號的主要配體之一，在器官的發(fā)展和產后細胞功能的恢復中起重要作用。Wnt5a可以結合多種受體，比如Fzd2、Fzd4、Fzd5和Ror2。Wnt5a/ Ror2信號可以阻斷典型的Wnt-β-catenin信號通路[8]，并且在Wnt5a敲除小鼠中典型的Wnt-β-catenin信號通路后會增強[9]。最近有報道表明Wnt5a介導多種炎癥反應應答。但是Wnt5a介導炎癥的報道僅僅局限于外周組織，未見Wnt5a參與中樞神經炎癥的報道。

本實驗研究了Wnt5a信號通路對NRTI引起的小腦神經炎癥的調控作用。不僅有助于理解NRTI在小腦中對神經炎癥發(fā)生的影響，而且將為治療HIV-1相關的神經炎癥提供潛在的藥物靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C67BL/6小鼠，雄性，8周齡。所有動物實驗均得到杭州師范大學實驗動物倫福利倫理委員會授權同意，動物合格證號為：2015-106。 并飼養(yǎng)于該校實驗動物中心。NRTI藥物：齊多夫定(AZT)，拉米夫定(3TC)。AZT和3TC的粉末溶解在PBS中并貯存于-20℃?？贵w：Goat Anti-Mouse IgG H&L-HRP(Catalog,#GS1002)；GAPDH(SANTA,sc-25778)；Anti-TNF alpha抗體(abcam,ab1793)；Purified Rat Anti-Mouse IL6(BD,5554400)；Mouse IL-1β抗體(R&D,AF-401-NA)；Goat Anti-Rabbit IgG H&L-HRP(abcam,ab97051)；Anti-Wnt5a 抗體(abcam,ab72583)。

1.2 方 法

1.2.1 實驗分組

將C57BL/6小鼠分為AZT、3TC和空白對照3大組。每大組分為2、5、14d 3個小組，每組5只小鼠。AZT組每天每只小鼠皮下注射0.26 mL濃度1 mg/mL的AZT；3TC組每天每只小鼠皮下注射0.26 mL濃度為0.5 mg/mL的3TC；空白對照組每天每只小鼠皮下注射0.26 mL PBS。小鼠5只/籠，添加適量墊料，給予充足的食物和水，飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，(21±3) ℃的環(huán)境中。

1.2.2 小鼠小腦組織的分離

用預冷的PBS對麻醉后的小鼠進行心臟灌注，然后再冰臺上迅速取出腦組織，分離出小腦，用于Western blotting及石蠟切片的制備。

1.2.3 Western blotting檢測炎癥因子及Wnt5a的表達

1 mg的小腦加200 μL的RIPA裂解液機械勻漿，然后冰上裂解30 min。4 ℃，12000 r/min離心5 min，取上清，用BCA蛋白質定量試劑盒(biomiga)測定其蛋白質含量。取50μg蛋白質進行SDS-PAGE電泳，然后進行蛋白質轉移，接著進行免疫反應，所用一抗為：anti-Wnt5a(1∶1000)； GAPDH(SANTA,sc-25778)；Anti-TNF alpha(1∶1000)；Purified Rat Anti-Mouse IL6(1∶10000)；Mouse IL-1β(1∶2000)，所對應的二抗分別為Goat Anti-Rabbit IgG H&L-HRP(1∶2000)，Goat Anti-Mouse IgG H&L-HRP(1∶25000)；最后用ECL發(fā)光試劑盒進行顯色，拍照保存。

1.2.4 HE染色檢測小腦形態(tài)結構變化

5μm厚的石蠟切片，執(zhí)行常規(guī)的HE染色[10]，觀察小腦整個形態(tài)結構和神經元胞體形態(tài)。

1.2.5 統計分析

所有的實驗數據均表示為means±SEM。用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計分析。設P<0.05具有統計學意義，P<0.01表示存在極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 NRTI對小腦的炎癥因子表達影響

Western blotting分析了NRTI處理2d后小腦炎癥因子的表達水平，結果(圖1)顯示與空白對照組相比AZT組IL-6、IL-1β和TNF-α的表達分別增加了1.26、1.36、1.59；3TC組IL-6、IL-1β和TNF-α的表達分別增加了1.16、1.15、1.14。以上實驗結果初步表明NRTI藥物AZT和3TC給藥2d能夠上調小腦炎癥因子表達。

圖1 NRTI處理2d后小腦炎癥因子的表達

注：Means±SEM來自5只小鼠，*為P<0.05；**為P<0.01；***為P<0.001。

接下來分析了NRTI處理5d后小腦炎癥因子的表達。Western blotting結果(圖2)顯示與空白對照組相比AZT組IL-6、IL-1β和TNF-α的表達分別增加了1.71、1.99、1.53；3TC組IL-6、IL-1β和TNF-α的表達分別增加了1.93、2.23、1.18。AZT和3TC引起小腦中IL-1β，IL-6，TNF-α三種炎癥因子顯著增加。表明上述兩種NRTI藥物處理5d能夠引起小腦發(fā)生神經炎癥。

進一步分析了NRTI處理14d后大腦皮層炎癥因子的表達。Western blotting結果(圖3)顯示與空白對照組相比AZT組IL-6、IL-1β和TNF-α的表達分別增加了1.79、1.96、1.86；3TC組IL-6、IL-1β和TNF-α的表達分別增加了1.81、1.48、1.54；AZT和3TC炎癥因子顯著增加，進一步證實了上述兩種NRTI藥物能夠引起小腦的神經炎癥。

圖2 NRTI處理5 d后小腦炎癥因子的表達

注：Means±SEM來自5只小鼠，*為P<0.05；**為P<0.01；***為P<0.001。

圖3 NRTI處理14 d后小腦炎癥因子的表達

注：Means±SEM來自5只小鼠，*為P<0.05；**為P<0.01；***為P<0.001。

2.2 NRTI對小腦的形態(tài)結構變化的影響

小腦HE染色結果(圖4)顯示，空白對照組小腦結構完整，細胞核呈藍紫色(圖中深灰色部分)，細胞質呈粉紅色(淺灰色的部分)，并且核質對比明顯，AZT和3TC處理14d后與空白對照組相比沒有明顯差別，表明該階段上述兩種NRTI藥物未引起小腦顯著神經病變。

圖4 NRTI處理14 d后小腦HE染色結果

2.3 NRTI對小腦Wnt5a表達的影響

Western blotting檢測NRTI對小腦Wnt5a表達的影響。NRTI處理2d如圖5(a),AZT顯著上調小腦中Wnt5a表達，3TC對小腦Wnt5a表達沒有顯著上調，但是呈現出上升趨勢。NRTI處理5d如圖5(b)，小腦中Wnt5a表達均開始顯著增加。NRTI處理14d如圖5(c)，小腦中Wnt5a表達顯著增加，其中AZT處理后Wnt5a表達增加2倍以上。結果表明上述兩種NRTI藥物顯著上調小腦Wnt5a表達。

圖5 NRTI處理不同時間后小腦Wnt5a的表達注： Means±SEM來自5只小鼠*為P<0.05；**為P<0.01；***為P<0.001。

2.4 BOX5對小腦NRTI引起神經炎癥的影響

為了進一步研究Wnt5a對NRTI誘導的神經炎癥的作用，本文利用Wnt5a的特異性拮抗劑BOX5來抑制Wnt5a。觀察BOX5和NRTI同時作用14d后對小腦炎癥因子TNF-α 和IL-6表達的影響。Western blotting結果顯示BOX5可以顯著性降低AZT和3TC(圖6)誘導的炎癥因子上調，與空白對照組相比BOX5本身并不影響這些炎癥因子的表達。說明小腦中NRTI誘導的Wnt5a上調至少部分介導了NRTI導致的神經炎癥。

圖6 BOX5對小腦炎癥因子表達的影響注： Means±SEM來自5只小鼠，*為P<0.05；**為P<0.01；***為P<0.001。

3 討 論

目前，HAART在治療AIDS疾病中廣泛應用，極大程度降低了機會性感染的發(fā)生幾率[11]。然而，長期服用NRTI類藥物會引發(fā)一系列神經毒性，例如乳酸性酸中毒、線粒體毒性、周圍神經病變等。神經炎癥則被普遍認為是神經疾病如AIDS并發(fā)的癡呆和疼痛、中風及帕金森等的關鍵致病因素[12]，但是NRTI類藥物引發(fā)的神經毒性和神經炎癥是否相關聯還不清楚。炎癥因子如 IL-1β、IL-6和TNF-α是各種中樞神經系統疾病的關鍵的炎癥調節(jié)介質，也在中樞神經系統損傷引起的炎癥應答反應中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現注射NRTI藥物后小鼠小腦中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α表達量顯著增加，說明NRTI能夠誘導小腦中神經炎癥的發(fā)生。

Wnt5a是非經典Wnt信號的主要配體之一，在組織發(fā)育和信號轉導過程中發(fā)揮重要功能。近年來，越來越多的研究表明Wnt5a具有啟動和調節(jié)外周炎癥應答的功能[13]。本研究中觀察到注射NRTI藥物后小鼠小腦中Wnt5a表達量顯著增加，所以推測NRTI引起的神經炎癥和Wnt5a相關聯。利用Wnt5a的特異性拮抗劑BOX5來抑制Wnt5a進一步驗證兩者之間的關系。Western Blotting結果表明，BOX5可以顯著性降低NRTI誘導的小腦炎癥因子上調。因此，以上結果表明Wnt5a信號通路調節(jié)NRTI引起的小腦神經炎癥。

總的說來，本研究揭示Wnt5a信號通路調節(jié)NRTI引起的小腦神經炎癥，為NRTI刺激神經炎癥提供了病因機制，提示Wnt5a信號通路是HIV相關中樞炎癥和神經性疾病的一個很有潛力的防治靶點。

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(責任編輯： 許惠兒)

Study on Cerebellum Neuroinflammation Induced by NRTI Regulation with Wnt5a Signal Channel

GENGMingxing,WUTing,ZHANGJuan,YANGYi,LIUXiaokang,SHUJianhong

(College of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China )

In this study, mice (C57Bl/6) were treated with NRTI drugs AZT (100 mg/kg, sc./days) and 3TC (50 mg/kg) for 2, 5, or 14 days and cerebellum of mice was collected at the end of drug treatment. The expression level of inflammatory factors (IL-1β, TNF-α and IL-6) in cerebellum was detected with Western blotting under different treatment time of two drugs. The results show that IL-1β, TNF-α and IL-6 significantly increase in the cerebellum of NRTI-treated mice. Then, the effect of NRTI treatment for 5d on cerebellum lesion was investigated through HE dyeing. Histomorphology analysis shows that NRTI treatment for 5d does not induce significant cerebellum lesion. Western blotting detection indicates that NRTI in cerebellum can significantly up-regulate Wnt5a, which prompts that NRTI may activate Wnt5a. Then, BOX5- a specific Wnt5a antagonist was applied to restrain Wnt5a. Western blotting result indicates that BOX5 can significantly reduce NRTI-induced inflammatory factor up-regulation. Thus, Wnt5a signal channel participates in regulating cerebellum neuroinflammation induced by NRTI.

NRTI; cerebellum; neuroinflammation; Wnt5a signal channel; BOX5

10.3969/j.issn.1673-3851.2016.11.021

2016-04-19

國家科技重大新藥創(chuàng)制項目(2012ZX09102301)；浙江省自然科學基金項目(LY13H090015)

耿明星(1990-)，女，山東滕州人，碩士研究生，主要從事神經藥學方面的研究。

舒建洪，E-mail：shujianhong@zstu.edu.cn

R741.02

A

1673- 3851 (2016) 06- 0922- 06 引用頁碼： 110705