于海征，郭萬里,b，陳洋洋，薛清靜，梁宗鎖，b

(浙江理工大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院；b.浙江省植物次生代謝調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018)

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丹參SmWRKY65基因的克隆及其擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

于海征a，郭萬里a,b，陳洋洋a，薛清靜a，梁宗鎖a，b

(浙江理工大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院；b.浙江省植物次生代謝調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018)

為研究丹參WRKY家族基因的生物學(xué)特性，通過生物信息學(xué)的方法從丹參轉(zhuǎn)錄組庫中篩選出響應(yīng)茉莉酸甲酯(MeJA)的SmWRKY65，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測該基因的組織器官表達(dá)特性，進(jìn)而采用花序浸泡法把基因?qū)氲綌M南芥中。研究表明SmWRKY65基因編碼區(qū)的長度為867bp，編碼288個(gè)氨基酸，含有1個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族第IIa類成員。SmWRKY65在根、莖、葉、花等組織器官中均有表達(dá)，且在葉和莖中的表達(dá)量最高，5月份和10月份各個(gè)組織器官中表達(dá)也存在差異。最后獲得了轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。

丹參；擬南芥；SmWRKY65；基因克隆；遺傳轉(zhuǎn)化

0 引 言

丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)是唇形科常用的傳統(tǒng)藥用植物，以干燥的根入藥，對心腦血管疾病有明確的療效，其主要活性成分為水溶性的酚酸類物質(zhì)和脂溶性的丹參酮類[1]。目前，人們從丹參中分離出大約40多種水溶性成分和20多種脂溶性成分，如咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹參素、丹參酮、隱丹參酮、丹參酮IIA等[2]。隨著代謝組和轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為丹參次生代謝研究提供了一個(gè)更高的平臺(tái)[3]。

WRKY是一類數(shù)量較大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[4]，其成員數(shù)目隨著植物的不斷進(jìn)化而豐富[5]，不同植物中WRKY家族成員的數(shù)目差異較大，如在擬南芥中發(fā)現(xiàn)有90多個(gè)成員，在水稻(Oryzasativa)中發(fā)現(xiàn)擁有100多個(gè)成員，而在向日葵(Helianthusannuus)中僅發(fā)現(xiàn)了6個(gè)成員(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/family.php?fam=WRKY)。根據(jù)其所含WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目及鋅指結(jié)構(gòu)特征，可將其分為3類[6]：第I類通常含有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)為C-X4-C-X22-23-H-X-H(X為任意氨基酸)，即C2H2型。此類不僅存在于綠色植物中，在原生生物黏菌阿米巴(Dictyosteliumdiscoideum)、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)和寄生蟲藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(Giardialamblia)中也有發(fā)現(xiàn)，由此推測第I類WRKY可能是最原始的[7]，該類轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合功能主要由羰基(C)端的WRKY結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)，而氨基(N)端WRKY域單獨(dú)不能與DNA結(jié)合，其生物學(xué)功能還不清楚，可能有助于增強(qiáng)氨基(N)端WRKY域與靶基因的結(jié)合。第II類只含有1個(gè)WRKY域，其鋅指結(jié)構(gòu)與第I類WRKY轉(zhuǎn)錄因子相同，目前鑒定出的大多數(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子都屬于該類型，該類還可以再分為5個(gè)亞類(IIa、IIb、IIc、IId、IIe)[5,7]。第III類含有1個(gè)WRKY域，其鋅指結(jié)構(gòu)為C-X7-C-X23-H-X-C，即C2HC型。越來越多的數(shù)據(jù)表明WRKY廣泛參與植物的生長發(fā)育、響應(yīng)逆境脅迫[5,8]，以及參與次生代謝調(diào)控[9-11]。在煙草中過表達(dá)BcWRKY46可以提高抗冷、耐鹽和抵御滲透脅迫的能力[12]。AtWRKY18和AtWRKY40能夠調(diào)控ABA信號(hào)途徑，抑制擬南芥種子萌發(fā)、根生長及對鹽脅迫和滲透脅迫的敏感性[13]。水稻OsWRKY45和OsWRKY53能夠調(diào)控二萜類生物合成的關(guān)鍵酶CPS4、KSL4、CYP99A2、CYP99A3、MAS的基因表達(dá)，從而提高M(jìn)omilactone A、Oryzalexin、 Phytocassane的生物合成[14-15]。番茄SlWRKY73可以激活3個(gè)單萜合成基因SlTPS5、SlTPS3、SlTPS7[16-17]的表達(dá)，從而調(diào)控萜類的生物合成。

至今，對丹參WRKY基因功能的研究報(bào)道較少。為此，本研究對丹參毛狀根轉(zhuǎn)錄組庫(MeJA處理，結(jié)果未發(fā)表)進(jìn)行分析，得到一個(gè)響應(yīng)MeJA的的轉(zhuǎn)錄因子SmWRKY65，通過該基因的克隆，組織表達(dá)分析、擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化，獲得該基因的基礎(chǔ)信息，發(fā)現(xiàn)該基因可能參與調(diào)控次生代謝物的生物合成和響應(yīng)逆境脅迫，為研究丹參WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能提供技術(shù)和材料基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

農(nóng)桿菌ATCC15834誘導(dǎo)丹參葉片獲得毛狀根[18-19]，繼代后的毛狀根在6,7-V培養(yǎng)基中黑暗條件下25 ℃，110 r/min震蕩培養(yǎng)18 d，用終濃度為100 μM的茉莉酸甲酯(MeJA)處理。處理后0.5、1、3、6、9 d取樣，液氮速凍，-80 ℃保存。2013年11月種植于浙江理工大學(xué)藥用植物園的丹參分別在2014年10月和2015年5月兩個(gè)花期取根、莖、葉、花等組織以及種植于溫室25 ℃，光照16 h生長1個(gè)月的丹參幼苗，液氮速凍，-80 ℃保存，用于組織特異性表達(dá)分析。擬南芥(Arabidopsisthaliana)為Col-0生態(tài)型。

1.2 RNA提取和WRKY基因的克隆

總RNA的提取采用TIANGEN?(DP441)RNA提取試劑盒，具體步驟參考說明書。用NANO Drop核酸定量測定儀測定RNA濃度，取1μg RNA，應(yīng)用Takara?(RR047A)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照附帶的說明書反轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA。根據(jù)丹參轉(zhuǎn)錄組庫中獲得的SmWRKY65的基因序列，設(shè)計(jì)PCR特異性引物，在上下游分別加入XbaI和KpnI的酶切位點(diǎn)。上游引物為：5′-3′ ATCTAG ATGGAAAATAATTTGGAAGCCTCA(下劃線為XbaI酶切位點(diǎn))，下游引物為：5′-3′ TGGTACCT ACATTGAAAAACCTATAGAATTAGAAATA TTA(下劃線為KpnI酶切位點(diǎn))。以丹參毛狀根的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為H2O 17.87 μL，10×Ex Taq Buffer(Mg2+plus) 2.5 μL，10×Ex Taq(5 U/μL) 0.13 μL，dNTP Mixture(各2.5mM) 2 μL，引物(10 μM)各1 μL，模板2 μL。擴(kuò)增條件為：98 ℃，10 s；63 ℃，30 s；72 ℃，60 s；30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，1.2%的瓊脂糖跑膠驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，采用TaKaRa(9267)瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，連接到測序載體pMD19-T上，重組載體轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH5α，挑取3個(gè)陽性單克隆測序。

1.3 丹參WRKY基因的生物信息學(xué)分析

測序后的結(jié)果采用Bioedit序列比對軟件進(jìn)行分析，選取正確的SmWRKY65序列，并翻譯成氨基酸序列。氨基酸序列的理化性質(zhì)采用在線分析軟件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行預(yù)測。并在NCBI上進(jìn)行BLASTp，搜索同源序列，用MEGA 6 NJ法(bootstrap 1000)進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 熒光定量PCR分析

提取丹參不同組織的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，采用TaKaRa SYBRPremixExTaqTMII(RR820A)進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。引物為QSmWRKY65-F:(5′-TTGTTGACTACGGACTGCT GC-3′)和QSmWRKY65-R(5′-CATGGCTCCTCTT TAGGGAAA-3′)。擴(kuò)增片段為130bp。內(nèi)參基因?yàn)镾mUBQ10[20]。引物為：SmUBQ10-F(5′-AGATGG GCGGACACTTGCTGATTA-3′)和SmUBQ10-R(5′-ACTCTCCACCTCCAAAGTGATGGT-3′)。擴(kuò)增條件為：第一步95 ℃預(yù)變性30 s；第二步95 ℃，5 s；59 ℃，30 s；40個(gè)循環(huán)。生物學(xué)重復(fù)3次。

1.5 載體構(gòu)建和擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

pCAMBIA-1300為過表達(dá)常用載體。用XbaI，KpnI將pMD19-T:SmWRKY65的質(zhì)粒和pCAMBIA-1300分別酶切，回收目的片段。然后用T4連接酶進(jìn)行連接。獲得pCAMBIA-1300：SmWRKY65重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，采用花序浸泡法侵染擬南芥花序[21]。將獲得的T1代種子消毒后，鋪在含有30 mg/L潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)上，4 ℃處理2 d后，16 h光照培養(yǎng)7～10 d，將抗性苗移入為蛭石∶泥炭土體積比1∶1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d左右，參考Edwards K等[22]DNA提取方法獲得DNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為H2O 17.87 μL，10×Ex Taq Buffer(Mg2+plus) 2.5 μL，10×Ex Taq(5 U/μL) 0.13 μl，dNTP Mixture(各2.5 mM) 2 μL，引物(10 μM) 各1 μL，模板2 μL。擴(kuò)增條件為：98 ℃，10 s；63.5 ℃，30 s；72 ℃，60 s；30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1.2%的瓊脂糖跑膠驗(yàn)證PCR產(chǎn)物。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Spss19.0和GraphPad Prism 5數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異性分析和圖表的繪制。

2 結(jié) 果

2.1 MeJA對丹參SmWRKY65的表達(dá)量分析

從丹參轉(zhuǎn)錄組庫中篩選到一個(gè)響應(yīng)MeJA的WRKY轉(zhuǎn)錄因子SmWRKY65。我們采用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證SmWRKY65是否響應(yīng)MeJA。丹參毛狀根在6，7-V液體培養(yǎng)基中生長18d，在長勢均一的毛狀根中加入終濃度為100μM MeJA，分別在0.5、1、3、6、9d取樣，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測SmWRKY65的表達(dá)量，如圖1所示：處理后前6d，實(shí)驗(yàn)組和對照組隨時(shí)間的增加表達(dá)量逐漸提高，MeJA明顯誘導(dǎo)SmWRKY65的表達(dá)。在處理后第6d基因表達(dá)量達(dá)到最高值，實(shí)驗(yàn)組是對照組的3.1倍。而對照組的表達(dá)量一直上升，說明SmWRKY65除了被MeJA誘導(dǎo)外，還可能受其它誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)。

圖1 MeJA處理后SmWRKY65轉(zhuǎn)錄水平變化模式 注：“*”表示差異顯著(p<0.05)，“**”表示差異極顯著 (p<0.01)，MOCK為對照組，MeJA為處理組。

2.2 丹參SmWRKY65基因序列分析

從丹參cDNA模板中擴(kuò)增得到目的基因SmWRKY65，編碼區(qū)為867bp，共編碼288個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為31.97kD，等電點(diǎn)為5.94。含有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族第IIa類成員，與預(yù)期結(jié)果一致。在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源搜索，與保守性較高的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，如圖2。分析發(fā)現(xiàn)其與SmWRKY58序列相似度較高。

圖2 WRKY基因的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

2.3 丹參SmWRKY65組織表達(dá)分析

以浙江理工大學(xué)藥用植物園種植的丹參為研究材料，在兩個(gè)花期(5月和10月)取樣，檢測SmWRKY65在各個(gè)組織中的表達(dá)量和時(shí)間變化的差異。從圖3中可以看出SmWRKY65在各個(gè)組織中均有表達(dá)。在根中表達(dá)量最低，在莖和葉中表達(dá)量較高，花和幼苗次之，且表達(dá)量呈現(xiàn)時(shí)間差異性。SmWRKY65在10月葉中的表達(dá)量是5月份的3.88倍，在10月份根中的表達(dá)量是5月根中的2.75倍，在5月份莖中的表達(dá)量是10月份的1.88倍。這與丹參在不同季節(jié)各個(gè)組織所行使的功能可能有關(guān)。

圖3 SmWRKY65組織表達(dá)模式注：“*”表示差異顯著(p<0.05)；“**”表示差異極顯著(p<0.01)。

2.4 SmWRKY65的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

通過花序浸泡法，將重組質(zhì)粒pCAMBIA-1300：SmWRKY65導(dǎo)入擬南芥Col-0中。將T1代種子鋪在含有潮霉素的培養(yǎng)基上，光下培養(yǎng)。能夠在培養(yǎng)基上正常生長的可能是轉(zhuǎn)基因擬南芥的陽性植株。然后將苗移到蛭石∶泥炭土體積比為1∶1的基質(zhì)上，22 ℃，16 h光下培養(yǎng)一段時(shí)間，提取DNA進(jìn)行陽性苗鑒定。鑒定結(jié)果如圖4所示。獲得了7株轉(zhuǎn)基因擬南芥，泳道12為陽性對照，泳道13為陰性對照。

圖4 轉(zhuǎn)基因擬南芥中SmWRKY65的PCR鑒定

3 討 論

WRKY在植物逆境脅迫響應(yīng)過程中起著重要的作用。近年來，越來越多的數(shù)據(jù)表明其廣泛參與植物的次生代謝調(diào)控[23]。本研究從丹參轉(zhuǎn)錄組庫中篩選出響應(yīng)MeJA的SmWRKY65，其編碼的蛋白屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族IIa類成員。研究發(fā)現(xiàn)許多IIa類WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與生物或非生物脅迫響應(yīng)。如OsWRKY76可以響應(yīng)MeJA和病原菌Magnaportheoryzae的誘導(dǎo)，也可以抑制二萜類和黃酮類植物抗毒素的生物合成[24]。過表達(dá)GmWRKY27的大豆毛狀根可以提高其對鹽和干旱的耐受性。氨基酸序列相近的WRKY轉(zhuǎn)錄因子可能具有相似的生物學(xué)功能[25-26]。因此我們推測SmWRKY65可能參與丹參的抗病途徑。

Schluttenhofer等[27]對擬南芥和長春花全基因組生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與茉莉酸信號(hào)相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控植物的次生代謝物合成。MeJA調(diào)控植物次生代謝一般通過調(diào)控與次生代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。如Hong等[28]研究發(fā)現(xiàn)MeJA可以上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子MYC2的表達(dá)從而提高倍半萜類合成基因AtTPS1、AtTPS1的表達(dá)。如圖1所示，SmWRKY65在MeJA的誘導(dǎo)下，表達(dá)量顯著上調(diào)，在第六天達(dá)到最高，這與丹參重要的次生代謝物丹酚酸B的積累規(guī)律較為類似[3]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)酚酸類生物合成途徑上的關(guān)鍵酶基因SmPAL1、SmTAT、SmRAS的啟動(dòng)子區(qū)均含有WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)W-box。SmWRKY65是否直接作用于這些關(guān)鍵酶基因有待下一步研究。

為了進(jìn)一步闡明SmWRKY65在丹參各個(gè)組織中所起的作用，我們分析了SmWRKY65組織表達(dá)模式。由于丹參根鮮重在9月份之前增長緩慢，之后生長迅速[29]。我們的研究發(fā)現(xiàn)SmWRKY65在10月份根中的表達(dá)量高于5月，因此推測其參與根的生長，以及參與次生代謝的生物合成。另外，其在莖中的表達(dá)量5月份高于10月，這可能與丹參在5月份節(jié)間伸長較快，與木質(zhì)素生物合成相關(guān)。木質(zhì)素在丹參中的合成途徑與丹酚酸B合成的上游途徑相同，而TAT與PAL1是這兩類物質(zhì)生物合成的上游關(guān)鍵酶基因，因此更加說明SmWRKY65可能參與丹參次生代謝的生物合成。

擬南芥作為模式生物，各項(xiàng)生理活動(dòng)相對丹參來說，研究的較為透徹，在擬南芥中異位表達(dá)SmWRKY65，便于對其功能的研究。同一個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子可能參與多個(gè)生理過程，例如過表達(dá)AtWRKY33可以提高對死體營養(yǎng)型真菌Botrytiscinerea和Alternariabrassicicola的抗性[30]。同時(shí)又發(fā)現(xiàn)其對病原誘導(dǎo)合成的抗毒素camalexin以及乙烯的生物合成調(diào)控都有重要的作用[31-32]。SmWRKY65是否參與逆境脅迫以及次生代謝調(diào)控，我們可以借助擬南芥，以全面認(rèn)識(shí)丹參SmWRKY65轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控逆境脅迫或目標(biāo)代謝途徑表達(dá)的分子機(jī)理。

[1] WANG X, MORRIS-NATSCHKE S L, LEE K-H. New developments in the chemistry and biology of the bioactive constituents of Tanshen [J]. Medicinal Research Reviews,2007,27(1):133-148.

[2] XU Z, PETERS R J, WEIRATHER J, et al. Full-length transcriptome sequences and splice variants obtained by a combination of sequencing platforms applied to different root tissues ofSalviamiltiorrhizaand tanshinone biosynthesis [J]. Plant J,2015,82(6):951-961.

[3] GE Q, ZHANG Y, HUA W-P, et al. Combination of transcriptomic and metabolomic analyses reveals a JAZ repressor in the jasmonate signaling pathway ofSalviamiltiorrhiza[J]. Scientific Reports,2015,5:1-14.

[4] ULKER B, SOMSSICH I E. WRKY transcription factors: from DNA binding towards biological function [J]. Curr Opin Plant Biol,2004,7(5):491-498.

[5] RUSHTON P J, SOMSSICH I E, RINGLER P, et al. WRKY transcription factors [J]. Trends Plant Sci,2010,15(5):247-258.

[6] EULGEM T, RUSHTON P J, ROBATZEK S, et al. The WRKY superfamily of plant transcription factors [J]. Trends in Plant Science,2000,5(5):199-206.

[7] ZHANG Y, WANG L. The WRKY transcription factor superfamily: its origin in eukaryotes and expansion in plants [J]. BMC Evol Biol,2005,5:1-12.

[8] 肖培連,馮睿杰,侯麗霞,等.葡萄WRKY18基因的克隆及表達(dá)特性分析[J].植物生理學(xué)報(bào),2015(3):391-398.[9] KATO N, DUBOUZET E, KOKABU Y, et al. Identification of a WRKY protein as a transcriptional regulator of benzylisoquinoline alkaloid biosynthesis inCoptisjaponica[J]. Plant Cell Physiol,2007,48(1):8-18.

[10] MA D, PU G, LEI C, et al. Isolation and Characterization ofAaWRKY1, anArtemisiaannuatranscription factor that regulates the amorpha-4,11-diene synthase gene, a key gene of artemisinin biosynthesis [J]. Plant and Cell Physiology,2009,50(12):2146-2161.

[11] SUTTIPANTA N, PATTANAIK S, KULSHRESTHA M, et al. The transcription factor crWRKY1 positively regulates the terpenoid indole alkaloid biosynthesis incatharanthusroseus[J]. Plant Physiology,2011,157(4):2081-2093.

[12] WANG F, HOU X, TANG J, et al. A novel cold-inducible gene from Pak-choi(Brassicacampestrisssp. chinensis),BcWRKY46, enhances the cold, salt and dehydration stress tolerance in transgenic tobacco [J]. Mol Biol Rep,2012,39(4):4553-4564.

[13] CHEN H, LAI Z, SHI J, et al. Roles ofArabidopsisWRKY18, WRKY40 and WRKY60 transcription factors in plant responses to abscisic acid and abiotic stress [J]. BMC Plant Biol,2010,10:1-15.

[14] AKAGI A, FUKUSHIMA S, OKADA K, et al. WRKY45-dependent priming of diterpenoid phytoalexin biosynthesis in rice and the role of cytokinin in triggering the reaction [J]. Plant Molecular Biology,2014,86(1-2):171-183.

[15] CHUJO T, MIYAMOTO K, OGAWA S, et al. Overexpression of phosphomimic mutatedOsWRKY53 leads to enhanced blast resistance in rice [J]. PLoS One,2014,9(6):e98737.

[16] SPYROPOULOU E A, HARING M A, SCHUURINK R C. RNA sequencing onSolanumlycopersicumtrichomes identifies transcription factors that activate terpene synthase promoters [J]. BMC Genomics,2014,15:1-16.

[17] Xu Y H, WANG J W, WANG S, et al. Characterization ofGaWRKY1, a cotton transcription factor that regulates the sesquiterpene synthase gene(+)-δ-cadinene synthase-A [J]. Plant Physiology,2004,135(1):507-515.

[18] LIANG Z S, YANG D F, LIANG X, et al. Roles of reactive oxygen species in methyl jasmonate and nitric oxide-induced tanshinone production inSalviamiltiorrhizahairy roots [J]. Plant Cell Reports,2012,31(5):873-883.

[19] YANG D, DU X, LING X, et al. Different roles of the mevalonate and methylerythritol phosphate pathways in cell growth and tanshinone production ofSalviamiltiorrhizahairy roots [J]. PloS One,2012,7(11):e46797.

[20] MA Y, YUAN L, WU B, et al. Genome-wide identification and characterization of novel genes involved in terpenoid biosynthesis inSalviamiltiorrhiza[J]. Journal of Experimental Botany,2012,63(7):2809-2823.

[21] CLOUGH S J, BENT A F. Floral dip: a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation ofArabidopsisthaliana [J]. Plant J,1998,16(6):735-743.

[22] EDWARDS K, JOHNSTONE C, THOMPSON C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis [J]. Nucleic Acids Res,1991,19(6):1349.

[23] SCHLUTTENHOFER C, YUAN L. Regulation of specialized metabolism by WRKY transcription factors [J]. Plant Physiol,2014:167(2):295-306.

[24] YOKOTANI N, SATO Y, TANABE S, et al. WRKY76 is a rice transcriptional repressor playing opposite roles in blast disease resistance and cold stress tolerance [J]. J Exp Bot,2013,64(16):5085-5097.

[25] LI S, FU Q, CHEN L, et al.ArabidopsisthalianaWRKY25, WRKY26, and WRKY33 coordinate induction of plant thermotolerance [J]. Planta,2011,233(6):1237-1252.

[26] LAI Z, VINOD K, ZHENG Z, et al. Roles ofArabidopsisWRKY3 and WRKY4 transcription factors in plant responses to pathogens [J]. BMC Plant Biol,2008,8:1-13.

[27] SCHLUTTENHOFER C, PATTANAIK S, PATRA B, et al. Analyses ofCatharanthusroseusandArabidopsisthalianaWRKY transcription factors reveal involvement in jasmonate signaling [J]. BMC Genomics,2014,15:1-20.

[28] HONG G J, XUE X Y, MAO Y B, et al.ArabidopsisMYC2 interacts with DELLA proteins in regulating sesquiterpene synthase gene expression [J]. Plant Cell,2012,24(6):2635-2648.

[29] 梁宗鎖，董娟娥，蔣傳中.丹參規(guī)范化生產(chǎn)[M].北京:科學(xué)出版社,2014:26-29.

[30] ZHENG Z, QAMAR S A, CHEN Z, et al.ArabidopsisWRKY33 transcription factor is required for resistance to necrotrophic fungal pathogens [J]. Plant J,2006,48(4):592-605.

[31] MAO G, MENG X, Liu Y, et al. Phosphorylation of a WRKY transcription factor by two pathogen-responsive MAPKs drives phytoalexin biosynthesis inArabidopsis[J]. Plant Cell,2011,23(4):1639-1653.[32] BIRKENBIHL R P, DIEZEL C, SOMSSICH I E.ArabidopsisWRKY33 is a key transcriptional regulator of hormonal and metabolic responses towardBotrytiscinereainfection [J]. Plant Physiol,2012,159(1):266-285.

(責(zé)任編輯： 許惠兒)

Cloning ofSmWRKY65 fromSalviaMiltiorrhizaand Its Genetic Transformation inArabidopsisThaliana

YUHaiZhenga,GUOWanlia,b,CHENYangyanga,XUEQingjinga,LIANGZongsuoa,b

(a. College of Life Science; b. Zhejiang Province Key Laboratory of Plant Secondary Metabolism and Regulation, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

To investigate the biological characteristics of WRKY family gene inSalviamiltiorrhiza(Lamiaceae), we screened outSmWRKY65 which responds to methyl jasmonate (MeJA) fromSalviamiltiorrhizatranscriptome bank through bioinformatics method, detected tissue and organ expression characteristics of this gene throygh real-time fluorescence quantification of PCR (RT-qPCR), and then adopted floral dip method to transfer the gene intoArabidopsisthaliana. The results indicate that, the length ofSmWRKY65 gene coding region is 867bp; 288 amino acids are encoded;SmWRKY65 contains WRKY conserved structure domain and C2H2zinc finger structure domain;SmWRKY65 belongs to the IIa subgroup of WRKY family.SmWRKY65 is expressed in roots, stems, leaves, flowers and so on, and the expression quantity is the highest in leaves and stems.SmWRKY65 expression differs in each tissue and organ in May and October. Finally, some transgenicArabidopsisstrains withSmWRKY65 were produced.

Salviamiltiorrhiza;Arabidopsisthaliana;SmWRKY65; gene cloning; genetic transformation

10.3969/j.issn.1673-3851.2016.11.018

2016-01-29

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81373908)；浙江理工大學(xué)科研啟動(dòng)項(xiàng)目(14042008-Y)；浙江理工大學(xué)研究生創(chuàng)新研究項(xiàng)目(YCX14036)

于海征 (1989-)，男，河南南陽人，碩士研究生，主要從事藥用植物次生代謝調(diào)控方面的研究。

梁宗鎖，E-mail：liangzs@ms.iswc.ac.cn

Q943.2

A

1673- 3851 (2016) 06- 0906- 06 引用頁碼： 110702