韓一嘯 周 偉 賈 敏 祝令偉 紀 雪孫 洋 劉 軍 王海軍 郭學軍*

(1.吉林農業(yè)大學動物科技學院，長春，130118；2.軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，長春，130122；3.吉林省野生動物救護繁育中心，長春，130122)

馴鹿產氣莢膜梭菌的分離鑒定

韓一嘯1，2周 偉2賈 敏2祝令偉2紀 雪2孫 洋2劉 軍2王海軍3郭學軍2*

(1.吉林農業(yè)大學動物科技學院，長春，130118；2.軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，長春，130122；3.吉林省野生動物救護繁育中心，長春，130122)

修回日期：2016-03-14

發(fā)表日期：2016-05-10

馴鹿；

產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)又稱魏氏梭菌，是一種革蘭氏陽性產芽孢桿菌，廣泛分布在土壤、污水、飼料、食物和糞便等環(huán)境樣本中，能引起多種動物壞死性腸炎、腸毒血癥及人類食物中毒和創(chuàng)傷性氣性壞疽，是一種重要的人獸共患病原菌[1]。魏氏梭菌能產生多種外毒素，根據其產生的主要毒素(α、β、ε、ι)可將菌株分為A、B、C、D和E等5種毒素型[2]。該菌在全球范圍內流行，能感染牛、羊、豬、家兔等多種家養(yǎng)動物，也有野生動物如大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)、鹿(Cervidae)、獅(Pantheraleo)、牦牛(Bosgrunniens)等感染產氣莢膜梭菌的報道，其中以A型毒素型流行最廣[3-4]。目前在臨床上尚無有效的治療方法，發(fā)病迅猛，一旦發(fā)病，多數(shù)來不及治療均以死亡告終。

馴鹿(Rangifertarandus)主要分布于北半球的環(huán)北極地區(qū)，包括在歐亞大陸和北美洲北部及一些大型島嶼。在中國馴鹿只見于大興安嶺東北部林區(qū)。馴鹿不僅具有很高藥用和食用價值，而且具有一定的旅游和文化價值。馴鹿非常溫順，是唯一可以用于使役的鹿科動物，鄂溫克族就會使用馴鹿作為交通工具[5]。馴鹿已被列入中國國家林業(yè)局2000年8月1日發(fā)布的《國家保護的有益的或者有重要經濟、科學研究價值的陸生野生動物名錄》中。

2015年5月，本實驗室從猝死馴鹿的肝、脾、腎、血的樣本中分離獲得一株產氣莢膜梭菌，進行了毒素型鑒定，為野生動物疾病防控提供了參考病例數(shù)據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

無菌采集猝死馴鹿的血、腎、肝和脾編號為1號、2號、3號、4號，低溫保存送回實驗室，制作觸片革蘭氏染色鏡檢。

1.2 病原鑒定

1.2.1 培養(yǎng)特性鑒定

依據國家標準GB 4789.13-2012《食品微生物學檢驗 產氣莢膜梭菌檢驗》，厭氧培養(yǎng)的情況下在胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸(TSC)瓊脂平板上生長黑色菌落，接種到液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FTG)可觀察到大量產氣的現(xiàn)象，初步判定為產氣莢膜梭菌。

分別取血、腎、肝和脾樣本分別劃線接種含5%兔血瓊脂平板、TSC瓊脂平板和FTG液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)12 h，觀察細菌生長狀態(tài)。

1.2.2 分子生物學鑒定

挑取TSC瓊脂平板上生長的黑色菌落接種FTG液體培養(yǎng)基進行純培養(yǎng)，取1 mL純培養(yǎng)液離心收集菌體，經滅菌生理鹽水洗滌2遍后，用200 μL滅菌蒸餾水重懸，水浴煮沸10 min作為PCR模板。由長春庫美生物公司合成細菌16S rRNA通用引物[6]，產氣莢膜梭菌α毒素、β毒素、ε毒素、ι毒素、腸毒素、β2毒素特異性引物[7]，進行PCR擴增并測序比對分析，血清型PCR結果可根據表1進行判定[8]。

表1產氣莢膜梭菌毒素型

Tab.1 Toxin types of Clostridium perfringens

1.3 藥敏試驗

取新鮮液體純培養(yǎng)物0.1 mL均勻涂布TSC瓊脂培養(yǎng)基上，正面放置待菌液完全吸收后，無菌夾取頭孢吡肟、頭孢匹羅、頭孢曲松、吡利霉素、頭孢他啶、氨曲南、左氧氟沙星、四環(huán)素、阿莫西林、環(huán)丙沙星、阿米卡星、氨芐青霉素、復方磺胺甲噁唑藥敏試紙片(購自寶泰克)置于培養(yǎng)基上壓實，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，量取抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 病情報告

某動物園雄性馴鹿，4歲，身體狀況良好，2014年9月引進。白天園區(qū)內散養(yǎng)，夜晚補飼青草、花生殼、苔蘚、玉米面、豆餅、胡蘿卜和蘋果。在2015年4月22晚未正?；厝Γ?3日7：00發(fā)現(xiàn)已死亡。尸體表觀特點為腹脹、肛門四周污穢、鼻孔有血性黏液。剖檢皮下出血、腸管破裂、腹腔有大量腸內容物、大腸段腸壁薄、脾臟腫大、肝臟土黃色、心包積血、肺充血。

2.2 鏡檢觀察

對血、腎、肝和脾制作的觸片進行革蘭氏染色鏡檢。均可見革蘭氏陽性、菌體兩端鈍圓、呈粗桿狀、單個、成雙或者成短鏈狀存在，個別菌體有芽孢(圖1)，芽孢不大于菌體寬度，為單極芽孢，革蘭氏染色不能著色。

圖1 本試驗中樣本革蘭氏染色Fig.1 Sample gram staining in this experiment

2.3 病原分離與鑒定

2.3.1 TSC瓊脂平板黑色菌落觀察

依據國家標準GB 4789.13-2012《食品微生物學檢驗 產氣莢膜梭菌檢驗》，產氣莢膜梭菌在厭氧培養(yǎng)條件下在胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸(TSC)瓊脂平板上生長黑色菌落，可初步判定為產氣莢膜梭菌。該菌僅在厭氧條件下生長為專性厭氧菌，將血、腎、肝和脾樣本分別劃線接種于TSC瓊脂培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)12 h，均可見到有大量表面光滑、正圓形、球狀突起的黑色菌落生長(圖2)。

圖2 在TSC瓊脂平板上長出的黑色菌落Fig.2 The black colony on TSC agar

2.3.2 FTG液體培養(yǎng)產氣情況觀察

在TSC瓊脂平板上挑取黑色單菌落接種于FTG液體，培養(yǎng)約12 h，可見細菌生長并伴有輕微產氣現(xiàn)象。

2.3.3 血瓊脂平板實驗

將分離菌株劃線接種于5%兔鮮血瓊脂平板厭氧培養(yǎng)12 h后，形成灰白色的圓整、表面濕潤、黏稠、隆起的菌落，大小約1.5～2.0 mm，菌落周圍呈雙環(huán)溶血(圖3)。

圖3 血瓊脂平板實驗Fig.3 The test od blood agar plate

2.4 分子生物學鑒定

2.4.1 細菌16S rRNA

細菌16S rRNA基因產物由長春庫美生物公司測序，獲得1 357 bp目的片段序列，經NCBI Blast同源性比對，與產氣莢膜梭菌ATCC 13124的同源性為100%?；?6S rRNA序列，采用MEGA 6.0(Neighbor-Joining)構建系統(tǒng)進化樹如圖4。XL-1與產氣莢膜梭菌標準菌株ATCC13124親緣關系最近，與蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)ATCC11778、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ATCC6633遺傳距離較遠。

圖4 基于16S rRNA構建系統(tǒng)進化樹Fig.4 The phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence

2.4.2 血清型PCR鑒定

PCR檢測結果如圖5所示：陽性對照為ATCC 13124 B型產氣莢膜梭菌的標準菌株，PCR檢測血液和各臟器僅有α目的條帶，表明本次分離菌株攜帶α毒素基因，為A型產氣莢膜梭菌。

圖5 PCR檢測結果M：DL2 000；0：陽性對照1-4：分別為血、腎、肝、脾分離的菌株Fig.5 PCR test resultsM：DL2 000；0：Positive control；1-4：The isolated strains were isolated from blood, kidney, liver and spleen.

2.5 藥敏試驗

參照美國NCCLS標準，比較抑菌圈直徑結果表明，分離菌株對頭孢替坦、吡利霉素、頭孢他啶、氨曲南敏感，對頭孢吡肟、阿米匹羅、頭孢曲松、左氧氟沙星中度敏感，對四環(huán)素、阿莫西林、環(huán)丙沙星、阿米卡星、氨芐青霉素、復方磺胺甲噁唑耐藥(表2)。

表2 分離菌對14種抗生素的敏感性實驗

Tab.2 Fourteen antibiotic sensitivity test

注：根據1994年12月版美國NCCLS藥敏試驗紙片擴散法法規(guī)判定:“S”敏感 “I”中介 “R”耐藥

3 討論

產氣莢膜梭菌在繁殖過程中會產生多種毒素蛋白，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)12種毒素，根據產生的毒素不同，可將其分為A型、B型、C型、D型、E型5個血清型。其中A型產氣莢膜梭菌的致病因子是其產生的α毒素，α毒素可通過破壞細胞膜的完整性，導致細胞裂解，從而使A型產氣莢膜梭菌具有細胞毒性、溶血性、致死性和皮膚壞死性等特性[9]。

產氣莢膜梭菌是一種條件性致病菌，其發(fā)病原因與菌株特性和環(huán)境因素密切相關。該菌株在自然界中分布廣泛，形成芽孢以后對自然環(huán)境的抵抗能力較強，可長期存在于土壤中，當畜舍環(huán)境衛(wèi)生條件較差時，動物采食了被產氣莢膜梭菌污染的飼草或飲用水后，可引發(fā)此病[10]。正常情況下，在動物的腸道中存在一定數(shù)量的魏氏梭菌，腸道內容物的酸堿度和氧飽和度等內環(huán)境因素的變化會影響魏氏梭菌的繁殖。而腸道內環(huán)境的變化易受食物成分、動物年齡、動物營養(yǎng)狀況、飼養(yǎng)環(huán)境溫度突變的影響，如動物過量采食高蛋白和高能量的食物，采食粗纖維飼料少，導致消化不良，都可為腸道內魏氏梭菌增殖和毒素生成提供營養(yǎng)介質[11]。該病暴發(fā)時危害嚴重，發(fā)病急，病程短，動物常未見癥狀即突然死亡[12]。感染魏氏梭菌的家畜臨床癥狀并不明顯，死亡后的尸體外觀出現(xiàn)腹脹明顯、肛門擴張有少量粘液滲出，眼結膜紅等特征，主要的剖檢變化為心臟心肌纖維腫脹，有充血、壞死灶；肝臟壞死有色素顆粒沉著；脾臟腫大局部有出血及壞死；腎臟充血，壞死較嚴重；腸道十二指腸肌層薄，局部有凝固性壞死，大量散在的炎性細胞，絨毛層脫落，有出血、充血[13]。

本起疫情中的馴鹿死亡突然，根據尸體外觀變化和剖檢病變觀察，我們懷疑是由魏氏梭菌感染引起，為進一步確診，進行了病原分離培養(yǎng)及鑒定試驗。從各臟器樣本中分離到有相同形態(tài)特征的菌落，后經培養(yǎng)特性、菌落形態(tài)及分子生物學特性觀察，最終判定導致馴鹿死亡的病原為A型產氣莢膜梭菌，這與高文偉等[14]研究報道的引起鹿科動物死亡的病原菌主要為A型產氣莢膜梭菌的結果一致。馴鹿發(fā)病在晝夜溫差相對較大的4月，再加上馴鹿采食過量易導致其腸道內魏氏梭菌大量繁殖，這可能是致其猝死的主要原因。

產氣莢膜梭菌病死亡癥狀與一些化學物質中毒有很多相似之處，容易被診斷為化學物質中毒[15]。另外，該病的突然死亡特征與炭疽也有相似之處，所以必須要進行細菌學、毒物學檢查來進行確診。由于存在細菌耐藥性問題，通過藥敏實驗篩選合適的藥物治療，是十分必要的。此次分離出的菌株對頭孢替坦、吡利霉素、氨曲南等藥物敏感，這與艾地云等[16]和寇敘等[17]的分離菌株藥敏結果存在著差異，在每次疫情防控中，需要針對流行菌株檢測其藥物敏感性，選用合適的藥物來進行治療。此次病情發(fā)生在馴鹿身上，雖然國內對從野生大動物中分離出產氣莢膜梭菌的情況有少量報道，但就我們所知，這是首次報道產氣莢膜梭菌致死馴鹿的病例，這表明產氣莢膜梭菌不僅能引起家畜發(fā)病死亡，也能引起野生動物發(fā)病死亡。有關部門應予以重視并采取必要的預防措施，希望本次檢測結果對今后馴鹿產氣莢膜梭菌感染研究提供有力參考。

[1] Miwa N，Masuda T，Terai K，et al.Bacteriological investigation of an outbreak ofClostridiumperfringensfood poisoning caused by Japanese food without animal protein [J].International Journal of Food Microbiology，1999，49(1)：103-106.

[2] 陸承平.獸醫(yī)微生物學[M].3版.北京：中國農業(yè)出版社，2001：318-320.

[3] 李云霄，金鑫，張營，等.魏氏梭菌病診斷方法研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2007，28(7)：88-93.

[4] 張紅英，盧中華，楊霞，等.我國魏氏梭菌病的流行特點[J].中國畜牧獸醫(yī)，2004，31(1)：39-41.

[5] 卡麗娜.論馴鹿鄂溫克人的馴鹿文化[J].黑龍江民族叢刊，2007，97(2)：174-178.

[6] Weisburg W G，Barns S M，Pelletier D A，et al.16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J].Journal of Bacteriology，1991，173(2)：697-703.

[7] 張小榮，文其乙，劉秀梵，等.應用多重PCR快速診斷山羊猝死癥的研究[J].中國獸醫(yī)科技，2002，32(3)：10-12.

[8] Rood J I，Cole S T.Molecular genetics and pathogenesis ofClostridiumperfringen[J].Microbiological Reviews，1991，55(4)：621-648.

[9] 許崇波.A型產氣莢膜梭菌α毒素分子生物學的研究進展[J].寧夏大學學報：自然科學版，2002，23(2)：188-192.

[10] 鄭曉麗，宋振銀，倪學勤，等.產氣莢膜梭菌對家禽業(yè)的危害及其預防[J].中國家禽，2008，30(24)：67-71.

[11] 王鳳陽，范泉水.獸醫(yī)微生物學[M].北京：科學出版社，2007：302-304.

[12] 侯安祖，盧中華，王自振，等.家畜魏氏梭菌病的診斷和防制[J].中國獸醫(yī)雜志，1998，24(10)：12-14.

[13] 張成林，劉燕，閆鶴，等.麋鹿發(fā)生C型魏氏梭菌病[J].野生動物，2012，33(5)：260-263.

[14] 高文偉，吳永春.產氣莢膜梭菌的分離鑒定[J].山西農業(yè)大學學報：自然科學版，2008，28(1)：64-68.

[15] 黃建華，陳松明.德國牧羊犬魏氏梭菌毒素中毒引起猝死的診斷報告[J].畜牧與獸醫(yī)，2013，45(2)：109-110.

[16] 艾地云，邵華斌，張騰飛，等.雞產氣莢膜梭菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].動物醫(yī)學進展，2014，35(6)：149-152.

[17] 寇敘，劉永華，唐雨順，等.一起兔產氣莢膜梭菌病爆發(fā)流行及病原體的分離鑒定[J].微生物學雜志，2014，34(1)：104-106.

Reindeer；Clostridiumperfringens；Pathogen isolation and identification

IsolationandIdentificationofClostridiumperfringensfromaReindeer

HanYixiao1，2ZhouWei2JiaMin2ZhuLingwei2JiXue2SunYang2LiuJun2WangHaijun3GuoXuejun2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，JilinAgriculturalUniversity，Changchun，130118，China；2.InstituteofMilitaryVeterinary，AMMS，KeylaboratoryofJilinProvinceforZoonosisPreventionandControl，Changchun，130122，China；3.JilinWildAnimalConservationandBreedingCenter，Changchun，130122，China)

A farmed reindeer died suddenly.According to its body appearance and autopsy lesions，we suspected that the reindeer was infected byClostridumperfringens.In order to further confirmed the causes，the liver，spleen，kidney and blood samples from the dead reindeer were collected.AClostridiumperfringenstype A strain was recovered.The strain(XL-1)was then evaluated by cultural characteristics，colony morphology，molecular biology.Drug sensitivity tests showed that XL-1 was sensitive to cefotetan，ceftazidime and aztreonam.

稿件運行過程

2016-01-05

產氣莢膜梭菌；

病原分離鑒定

S858.9

A

2310-1490(2016)02-113-05

某動物園馴鹿死亡突然，根據其尸體外觀變化和剖檢病變觀察，懷疑為產氣莢膜梭菌感染，為進一步確診，進行了病原分離培養(yǎng)及鑒定試驗。在猝死馴鹿的肝、脾、腎、血等樣本中分離獲得1株革蘭氏陽性桿菌(編號XL-1)。經細菌培養(yǎng)特性鑒定、菌落形態(tài)觀察、分子生物學鑒定，確定分離菌為A型產氣莢膜梭菌。藥敏實驗顯示，XL-1對頭孢替坦、頭孢他啶、氨曲南等藥物敏感。

國家“863”項目(2012AA022006)；軍隊醫(yī)藥衛(wèi)生課題(13CXZ024)

韓一嘯，男，26歲，碩士研究生；主要從事分子細菌學的研究工作。E-mail：15144218386@163.com

*通訊作者：郭學軍，E-mail：xuejung@yahoo.com