郭清蓮潘凌立楊立云何 歡張業(yè)中劉 義,*

（1武漢大學(xué)中南醫(yī)院，武漢 430071；2黃石市中心醫(yī)院，湖北 黃石 435002；3武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院化學(xué)系，武漢 430072）

吡蟲啉與人血清白蛋白相互作用熱力學(xué)行為

郭清蓮1潘凌立2楊立云3何 歡3張業(yè)中3劉 義3,*

（1武漢大學(xué)中南醫(yī)院，武漢 430071；2黃石市中心醫(yī)院，湖北 黃石 435002；3武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院化學(xué)系，武漢 430072）

在模擬人體生理條件下，綜合利用熒光光譜、紫外吸收光譜、圓二色譜和分子模擬等方法，研究了吡蟲啉（IMI）和人血清白蛋白（HSA）相互作用的熱力學(xué)行為。熒光光譜和紫外吸收光譜的分析表明：吡蟲啉能有效猝滅HSA的內(nèi)源熒光，猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅；通過所獲取的相互作用熱力學(xué)參數(shù)，可知兩者之間的相互作用是一個吉布斯自由能降低的自發(fā)過程，且二者之間的主要作用力為氫鍵和范德華力。位點(diǎn)競爭實驗和分子模擬的結(jié)果表明：吡蟲啉在HSA的主要結(jié)合位置為位點(diǎn)I。圓二色譜、同步熒光光譜和三維熒光的分析發(fā)現(xiàn)：吡蟲啉引起HSA的構(gòu)象發(fā)生改變，其α-螺旋含量降低，無規(guī)卷曲含量升高，肽鏈結(jié)構(gòu)在吡蟲啉的作用下有所伸展。

吡蟲啉； 人血清白蛋白； 相互作用； 熱力學(xué)參數(shù)

1 引 言

蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)具有重要生理功能的大分子，對一切生命過程都起著至關(guān)重要的作用，也是生命科學(xué)研究的重要對象1,2。血清白蛋白是血液中最豐富的載體蛋白，它具有貯運(yùn)內(nèi)源和外源化合物的作用3,4。許多生物活性物質(zhì)，如代謝物、醫(yī)藥及其他有機(jī)物，與血清白蛋白的親和性，影響它們在體內(nèi)的分布和新陳代謝5–8。研究白蛋白與藥物分子的相互作用，可以了解藥物在體內(nèi)的運(yùn)輸過程以及作用機(jī)制，對藥物化學(xué)和藥物分子設(shè)計具有重要的意義。

吡蟲啉（imidacloprid） ［1-（6-氯-3-吡啶甲基）-N-硝基咪唑烷-2-基胺］作為一種新型氯代煙堿類殺蟲劑，可以選擇性地抑制煙酸乙酰膽堿酯酶的受體，進(jìn)而阻斷昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)的正常傳導(dǎo)，起到殺蟲作用9–11。一般認(rèn)為吡蟲啉對哺乳動物低毒，但越來越多的證據(jù)顯示其嚴(yán)重的毒副作用，如可以產(chǎn)生基因毒性和免疫毒性12,13。隨著吡蟲啉農(nóng)藥的長期大量使用，勢必會影響人體的健康，吡蟲啉對人類的毒性作用，可以導(dǎo)致定向障礙、嗜睡、頭暈、心悸和嘔吐，嚴(yán)重的會造成心動過緩和心肺驟停14。吡蟲啉還會破壞成年人的內(nèi)分泌，干擾性腺類固醇性能，從而影響成年人的生殖系統(tǒng)15。研究吡蟲啉與蛋白質(zhì)的結(jié)合，有助于了解吡蟲啉在體內(nèi)的分布和代謝情況，對于闡明吡蟲啉對人的毒副作用機(jī)制具有重要意義。近年來，吡蟲啉與蛋白質(zhì)作用引起了國內(nèi)外許多研究人員的關(guān)注。Kazuhiko等16通過電化學(xué)與計算模擬的方法，研究了吡蟲啉與α4β2煙堿乙酰膽堿受體的相互作用，發(fā)現(xiàn)吡蟲啉主要結(jié)合在α4β2煙堿乙酰膽堿受體的loop C和loop D區(qū)域。Sun等14通過熒光光譜、紫外吸收光譜等手段，研究了吡蟲啉與血紅蛋白的相互作用。Ding和Peng17運(yùn)用多種光譜手段和分子模擬的方法，研究了吡蟲啉對多種人體球蛋白的抑制作用。

人血清白蛋白（HSA）是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，由585個氨基酸殘基組成。血清白蛋白是循環(huán)系統(tǒng)中含量最多的可溶性蛋白質(zhì)，約占總蛋白的55%，在血漿中的含量約為0.05 g·mL–1, 維持血液循環(huán)系統(tǒng)的滲透壓。其生理功能主要表現(xiàn)為：維持體內(nèi)生理環(huán)境相對穩(wěn)定；可以結(jié)合多種藥物和生物活性小分子，便于其在血液中的運(yùn)輸18。人血清白蛋白對藥物在生物體內(nèi)的運(yùn)輸有著重要的生理作用，無論從藥物動力學(xué)還是從臨床藥理學(xué)角度，研究血清蛋白與藥物的作用有助于了解藥物的體內(nèi)運(yùn)輸性質(zhì)和作用機(jī)制。當(dāng)然，從當(dāng)今藥物研發(fā)的過程和經(jīng)驗來看，新藥發(fā)現(xiàn)始于化學(xué)，但離不開藥理學(xué)的指導(dǎo)和臨床醫(yī)學(xué)的檢驗。

本文選擇人血清白蛋白作為模型蛋白，利用多種光譜手段和分子模擬的方法，研究了血清白蛋白與吡蟲啉的相互作用機(jī)制，獲取了兩者相互作用的系列熱力學(xué)參數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)和作用力類型等，并研究了吡蟲啉對人血清白蛋白構(gòu)象的影響。

2 實驗部分

2.1 儀器和試劑

帶恒溫系統(tǒng)的 Perkin Elmer LS55 熒光光度計（美國Perkin Elmer公司），TU-1901紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司），圓二色（CD）光譜儀（英國應(yīng)用光物理公司），BS110S電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

采用Sybyl 8.1中Surflex-Dock模塊進(jìn)行計算模擬，軟件購自Tripos公司，運(yùn)行環(huán)境為CentOS系統(tǒng)。

人血清白蛋白（HSA）（電泳純試劑）購自Sigma公司，吡蟲啉（IMI）購自沙隆達(dá)農(nóng)藥公司。HSA溶液均用濃度為0.05 mol·L–1，pH = 7.4的Tris-HCl緩沖溶液配成，保存于4 °C的避光處。三羥甲基氨基甲烷（Tris, 2-amino-2-（hydroxymethyl）-1,3-propanediol）純度不低于99.5%，NaCl、HCl等均為分析純。吡蟲啉溶液用無水乙醇配成，在整個實驗中的水均為Millipore純水。

2.2 實驗方法

2.2.1 熒光光譜

熒光猝滅光譜：設(shè)定激發(fā)波長為λex= 280nm，激發(fā)狹縫寬度為15 nm，發(fā)射狹縫寬度為4.0 nm。在模擬人體生理條件下，測定加入不同量的IMI時HSA的熒光發(fā)射光譜，記錄溫度為292、298、304、310 K，波長在300–450 nm范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜。為了避免濾波效應(yīng)，在實驗中使用極稀溶液（HSA 2.0 × 10–6mol·L–1， IMI 的濃度范圍為0–1.6 × 10–5mol·L–1）。

位點(diǎn)競爭實驗：選擇華法林（warfarin）和布洛芬（ibuprofen）兩種熒光探針作為位點(diǎn)標(biāo)記劑來研究IMI和HSA之間的結(jié)合位點(diǎn)。HSA的濃度固定為2 × 10–6mol·L–1，然后在HSA-warfarin或HSA-ibuprofen的混合物中，逐漸滴加IMI。設(shè)定激發(fā)波長為λex= 280 nm，記錄波長為300–475 nm范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜。

同步熒光光譜：固定Δλ = 60 nm，記錄IMI與HSA相互作用的同步熒光光譜。

三維熒光光譜：初始激發(fā)波長為200 nm，發(fā)射波長為200–500 nm，掃描次數(shù)為31，增量為5 nm，其它參數(shù)與HSA的熒光猝滅光譜一致。

2.2.2 紫外-可見吸收光譜

紫外-可見吸收光譜均用TU-1901紫外-可見分光光度計測量，波長范圍500–200 nm。

2.2.3 圓二色譜

記錄持續(xù)氮?dú)饬鳁l件下，室溫時波長范圍為200–260 nm內(nèi)樣品的CD光譜。比色皿的光路長為0.1 mm，掃描速度200 nm·min–1。在相同實驗條件下，緩沖溶液作為空白，從樣品光譜圖中扣除，實驗的結(jié)果由SELCON3.0軟件處理。

2.2.4 分子對接實驗

HSA的晶體結(jié)構(gòu)來自于數(shù)據(jù)庫Protein Data Bank （PDB），本實驗選擇了蛋白編號為1h9z的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)19，原始晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)經(jīng)去水、加氫、加電荷處理。小分子三維結(jié)構(gòu)由軟件Sybyl8.1構(gòu)建，并用最小能量法簡單優(yōu)化。應(yīng)用選擇HSA中配體的方法定義對接原型分子，配體選擇為1h9z中配體WRR2001。

3 結(jié)果與討論

3.1 熒光猝滅機(jī)制及猝滅常數(shù)

任何能夠通過相互作用（如激發(fā)態(tài)反應(yīng)，分子重排，能量轉(zhuǎn)移，形成基態(tài)復(fù)合物及碰撞猝滅等）使熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度下降的現(xiàn)象，都可稱為熒光猝滅作用20。圖1給出了pH = 7.4時在不同濃度IMI作用下的HSA的熒光猝滅光譜。可以看出，隨著IMI的不斷加入，其濃度增大，同時HSA的熒光強(qiáng)度逐漸降低，但最大發(fā)射波長并沒有明顯的移動，表明IMI可以有效猝滅HSA的內(nèi)源熒光。

圖1 加入不同濃度IMI之后HSA的熒光發(fā)射光譜Fig.1 Fluorescence emission spectra of HSA in the presence of various concentrations of IMI

通常，熒光猝滅過程被認(rèn)為是猝滅劑和熒光團(tuán)之間的碰撞過程或者是二者之間形成了復(fù)合物，即動態(tài)猝滅或者是靜態(tài)猝滅21,22。不同的猝滅機(jī)制可以根據(jù)溫度對結(jié)合常數(shù)和粘度的影響及測定熒光壽命的方法來加以區(qū)分。一般情況下，對于靜態(tài)猝滅，猝滅常數(shù)KSV隨著溫度的升高而減?。幌喾吹兀瑢τ趧討B(tài)猝滅，猝滅常數(shù)KSV隨著溫度的升高而增大23,24。

表1 pH = 7.4時不同溫度下IMI與HSA相互作用的猝滅常數(shù)Table 1 Quenching constants for the interaction of IMI with HSA at different temperatures and pH = 7.4

為了判斷上述體系的猝滅機(jī)制，對猝滅過程的熒光實驗結(jié)果按照Stern-Volmer方程25進(jìn)行處理：

式（1）中F0和F分別表示不存在和存在猝滅劑時熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度；KSV表示Stern-Volmer猝滅常數(shù)；［Q］表示猝滅劑的濃度；kq表示生物大分子的猝滅速率常數(shù)；τ0表示不存在猝滅劑時生物大分子的平均熒光壽命。很明顯：

生物大分子的熒光平均壽命為10–8s，kq可以通過式（2）計算得到。不同溫度下KSV和kq的計算結(jié)果列在表1中。由上述的分析結(jié)果可知：KSV的值隨著溫度的升高而減小，且kq值遠(yuǎn)大于生物大分子的最大碰撞猝滅常數(shù)（2.0 × 1010Lmol–1s–1）26，可以判斷上述實驗中的熒光猝滅是由于形成了復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程。

為進(jìn)一步證實IMI與HSA相互作用的猝滅機(jī)制，測定了室溫條件下HSA、IMI 和HSA-IMI的紫外-可見吸收光譜（如圖2所示）。對于動態(tài)猝滅，只涉及熒光分子的激發(fā)態(tài)，因而猝滅劑對熒光物質(zhì)的吸收光譜一般不產(chǎn)生影響；而靜態(tài)猝滅，由于基態(tài)復(fù)合物的形成，該過程一般會改變熒光物質(zhì)的吸收光譜27。顯然，HSA的吸收光譜在加入IMI前后發(fā)生了改變，進(jìn)一步證明了IMI對HSA的猝滅是靜態(tài)猝滅過程。

圖2 IMI與HSA相互作用的紫外-可見吸收光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectra of interaction of HSA and IMI

對于靜態(tài)猝滅過程，可以使用修正的Stern-Volmer方程，進(jìn)一步分析熒光猝滅數(shù)據(jù)28：式中，ΔF表示體系在無猝滅劑與猝滅劑濃度為［Q］時的熒光強(qiáng)度的差值；fa表示熒光團(tuán)可接近猝滅劑的部分；Ka表示有效猝滅常數(shù)，此值相當(dāng)于IMIHSA作用體系的結(jié)合常數(shù)。圖3顯示了F0/ΔF與1/［Q］呈線性關(guān)系，且計算得到的相應(yīng)的Ka值列于表2中。從表2可以看出：隨著溫度上升，Ka值下降，表明盡管IMI和HSA發(fā)生了結(jié)合作用，但當(dāng)溫度升高時其作用力減弱。

圖3 pH = 7.4時四個不同溫度下IMI猝滅人血清白蛋白熒光的修正Stern-Volmer曲線Fig.3 Modified Stern-Volmer plots for the quenching of HAS by IMI at four different temperatures and pH 7.4

表2 不同溫度下IMI與HSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Thermodynamic parameters of the interaction of HSA and IMI at different temperatures

3.2 IMI與HSA間的作用模式

通常，藥物等活性小分子與蛋白質(zhì)等生物大分子之間的相互作用力可分為四類：疏水作用力、氫鍵、范德華力和靜電作用力29。為了說明HSA-IMI體系的作用模式，計算了四個不同溫度下的熱力學(xué)參數(shù)（ΔH、ΔS、ΔG），根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)的符號和大小可以得出相互作用的主要的作用力類型。利用van't Hoff方程30，可以計算反應(yīng)的焓變ΔH和熵變ΔS：

其中，Ka為相應(yīng)溫度下的有效猝滅常數(shù)，R是氣體常數(shù)。吉布斯自由能變（ΔG）由下式計算：

圖4 HSA與IMI相互作用的范特霍夫曲線Fig.4 Van′t Hoff plot for the interaction of HSA and IMI

如圖4所示，以lnKa對1/T作圖，由斜率和截距，可以分別計算出焓變ΔH和熵變ΔS，進(jìn)而可以得到不同溫度下的自由能變ΔG，計算結(jié)果列于表2。負(fù)的ΔG值，表明結(jié)合過程是自發(fā)的。此外，ΔH

和ΔS均小于0，根據(jù)Ross理論31可以推測：在結(jié)合過程中，氫鍵和范德華力是主要作用力。

3.3 IMI在HSA上結(jié)合部位的確定

HSA由三個主要的結(jié)構(gòu)域（I、II、III）組成，每個區(qū)域又包含兩個亞域（A和B）。兩個結(jié)合位點(diǎn)site I和siteII，分別位于亞域IIA和亞域IIIA的疏水腔內(nèi)32。我們選擇華法林（warfarin）和布洛芬（ibuprofen）分別作為site I和site II位點(diǎn)標(biāo)記物，進(jìn)行位點(diǎn)競爭實驗，希望得到IMI在HSA上的結(jié)合部位的信息。

如圖5（B）所示，華法林加入后，HSA的熒光強(qiáng)度明顯下降，繼續(xù)向warfarin-HSA體系中滴加IMI，HSA的熒光強(qiáng)度逐漸穩(wěn)定降低，但是與圖1相比，其熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)低于不存在華法林時的熒光強(qiáng)度。而加入布洛芬后（如圖5（A）），體系的熒光猝滅變化趨勢與未加之前相似，因此可以推斷華法林占據(jù)了部分與HSA結(jié)合的IMI的位置，布洛芬并沒有影響IMI在HSA上的結(jié)合，說明IMI在HAS上的結(jié)合位點(diǎn)與華法林的結(jié)合位點(diǎn)相同33,34。

圖5 位點(diǎn)探針對IMI-HSA體系的影響Fig.5 Effect of site markers on IMI-HSA system

此外，為了便于比較說明華法林和布洛芬對體系的影響，采用修正的Stern-Volmer方程，對相應(yīng)的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行了處理（如圖6所示），結(jié)果列于表3中。顯然，加入華法林標(biāo)記物后，Ka值是未加時的66%；而加入布洛芬后與未加時的結(jié)合常數(shù)相近。說明華法林對IMI與HSA的結(jié)合作用會產(chǎn)生很大的影響，而布洛芬?guī)缀醪划a(chǎn)生影響。綜上，華法林與IMI競爭同一個位點(diǎn)，IMI與HSA的結(jié)合主要發(fā)生在site I位點(diǎn)上。

圖6 位點(diǎn)競爭實驗的修正Stern-Volmer曲線Fig.6 Modified Stern-Volmer plots of site marker competitive experiments

Site marker · 10–4Ka/（Lmol–1） R S.D. blank 5.301 0.9998 0.05 ibuprofen 4.873 0.9999 0.04 warfarin 3.021 0.9998 0.08

3.4 IMI對HSA構(gòu)象的影響

3.4.1 同步熒光

同步熒光光譜可以提供關(guān)于蛋白質(zhì)構(gòu)象改變的信息，因為其最大發(fā)射波長的偏移與蛋白質(zhì)氨基酸殘基周圍的微環(huán)境有關(guān)。當(dāng)激發(fā)波長和發(fā)射波長的波長差固定為60 nm時，可以得到色氨酸殘基周圍微環(huán)境改變的信息35。如圖7所示，隨著IMI的加入，HSA-IMI體系的同步熒光光譜發(fā)生了明顯的紅移，表明IMI的加入使HSA的構(gòu)象發(fā)生了一定的變化，致使色氨酸殘基所處的環(huán)境極性增強(qiáng)，疏水性有所減弱。

圖7 IMI與HSA相互作用的同步熒光光譜Fig.7 Synchronous fluorescence spectra of HAS in the presence of IMI

3.4.2 圓二色譜

室溫條件下，使用圓二色譜，研究HSA構(gòu)象的改變，更加科學(xué)合理。如圖8所示，在208和222 nm的遠(yuǎn)紫外區(qū)，出現(xiàn)兩個負(fù)的特征肩峰譜帶，這是蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰36。當(dāng)加入IMI后，HSA的峰強(qiáng)度明顯減小，說明IMI對HSA的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。

圖8 HSA-IMI體系的圓二色譜圖Fig.8 CD spectra of IMI-HSA system

表4 由SELCON3軟件分析得到的二級結(jié)構(gòu)的含量Table 4 Fractions of different secondary structures determined by SELCON3 software

圖9 HSA （A）和IMI-HSA復(fù)合物（B）的三維熒光光譜Fig.9 Three-dimensional fluorescence spectra of HSA （A）and HSA-IMI complex （B）

由程序SELCON3，可以方便地計算出蛋白質(zhì)各二級結(jié)構(gòu)的百分比。不同摩爾比時的各二級結(jié)構(gòu)的計算結(jié)果，列于表4中。當(dāng)IMI和HSA的摩爾比達(dá)到12 : 1時，α-螺旋的含量從59.4%下降到57.6%，表明HSA分子的肽鏈結(jié)構(gòu)在IMI的作用下有所伸展。進(jìn)一步也說明了IMI與蛋白質(zhì)主要多肽鏈的氨基酸殘基結(jié)合，并且破壞了蛋白質(zhì)的氫鍵結(jié)構(gòu)37,38。當(dāng)存在和不存在IMI時，HSA的CD光譜形狀相似，表明在發(fā)生結(jié)合反應(yīng)后，HSA的結(jié)構(gòu)仍然主要是以α-螺旋為主。因此，IMI與HSA發(fā)生相互作用時，在一定程度上使HSA的構(gòu)象發(fā)生了一定的變化。

3.4.3 三維熒光光譜

三維熒光光譜不僅可以全面展現(xiàn)待測樣品的熒光信息，而且可以使蛋白質(zhì)特征構(gòu)象變化的研究更具有科學(xué)性和可靠性。它也是另外一種證實HSA構(gòu)象和微環(huán)境是否改變的方法。圖9顯示了HSA和HAS-IMI復(fù)合物的三維熒光光譜，相應(yīng)的特征參數(shù)列于表5中。

圖9中，峰a為瑞利散射峰（λem= λex），且隨著IMI的加入，峰a的熒光強(qiáng)度降低，可能原因是IMI在血清白蛋白表面結(jié)合后，破壞了蛋白質(zhì)表面的保護(hù)水層，使原來較為分散的蛋白質(zhì)更加分散，即所謂的解聚作用，引起蛋白質(zhì)粒徑減小，熒光強(qiáng)度減弱。Peak 1 （λex= 280 nm, λem= 351.0 nm）為蛋白質(zhì)熒光猝滅的熒光峰，主要顯示TRP和TYR的熒光光譜行為。另外，在peak 1旁邊有一個很強(qiáng)的新的熒光峰peak 2 （λex= 230.0 nm, λem= 352.0 nm），主要展現(xiàn)的是蛋白質(zhì)肽鏈結(jié)構(gòu)的特征熒光行為39。在加入IMI后，peak 2的熒光強(qiáng)度輕微降低，說明蛋白質(zhì)肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，這也正與CD光譜中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量的降低相吻合。表5主要反映HSA和HSA-IMI的三維熒光圖譜特征。從峰的強(qiáng)度看，加入IMI后，HSA的兩熒光峰強(qiáng)度明顯減弱，且減弱的程度有所不同。說明蛋白質(zhì)的多肽有一部分解旋，在HSA水溶液中加入IMI后，IMI在改變HSA所處微環(huán)境的同時也改變了HSA的構(gòu)象。

表5 HSA和IMI-HSA復(fù)合物的三維熒光光譜Table 5 Three-dimensional fluorescence spectral characteristics of HSA and IMI-HSA system

圖10 （a） IMI與HSA分子對接模型， （b） IMI周圍0.5 nm范圍內(nèi)的氨基酸殘基， （c） IMI與HIS288和ARG257形成的氫鍵Fig.10 （a） Molecular docking model of IMI and HSA， （b） amino acid residues around IMI within 0.5 nm，（c） hydrogen bonds between IMI and ARG222

3.5 分子模擬

研究表明，大多數(shù)藥物分子與HSA的作用位置位于由亞結(jié)構(gòu)域IIA和亞結(jié)構(gòu)域IIIA的疏水腔內(nèi)，即site I和site II40。IMI和HSA分子對接結(jié)果的最佳構(gòu)象見圖10（a），可以看出：IMI和HSA的作用區(qū)域更趨于位于site I，即華法林位點(diǎn)，這與位點(diǎn)競爭實驗的結(jié)果一致。在0.5 nm范圍內(nèi)，IMI周圍的氨基酸殘基主要有12個，如圖10（b）所示：TYR150, PHE157, SER192, LYS195, GLN196, ARG197, HIS212, ARG257, SER287, HIS288, LYS289, LEU292。此外，IMI分子上的氧原子與HIS288、ARG257的氫原子形成了氫鍵（圖10（c）黑色虛線），這有助于IMI在HSA疏水腔中穩(wěn)定存在，這也與前面熱力學(xué)數(shù)據(jù)分析的結(jié)果相符合。

4 結(jié) 論

在模擬人生理條件下，研究了IMI與HSA相互作用的熱力學(xué)行為。由變溫滴定實驗可知，Stern-Volmer猝滅常數(shù)KSV和有效猝滅常數(shù)Ka均隨著溫度的升高而減小，HSA的吸收光譜也在IMI加入之后發(fā)生變化，說明IMI對HSA的猝滅是生成了復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程。在獲取的熱力學(xué)參數(shù)中，焓變和熵變均為負(fù)值，說明IMI與HSA之間相互作用力類型主要是氫鍵和范德華力。位點(diǎn)競爭實驗和分子模擬的結(jié)果表明IMI在HSA上的結(jié)合位點(diǎn)位于site I。同步熒光光譜、CD光譜及三維熒光光譜的結(jié)果表明IMI與HSA的結(jié)合會引起HSA構(gòu)象的改變。這些研究結(jié)果為獲得蛋白質(zhì)分子信息，了解吡蟲啉在體內(nèi)的作用機(jī)理，提供了一些具有重要理論意義的信息。

（1）Wang, N.； Liu, Z. Y.； Hu, X. L.； Bo, F. Q.； Zhao, X. Z. Chem. J. Chin. Univ. 2011， 32 （2）, 241. ［王 寧, 劉忠英, 胡秀麗, 卜鳳泉, 趙學(xué)忠. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報, 2011， 32 （2）, 241.］

（2）Ding, F.； Diao, J. X.； Sun, Y.； Sun, Y. J. Agric. Food Chem. 2012， 60, 7218. doi: 10.1021/jf300424w

（3）Bekale, L.； Agudelo, D.； Tajmir-Riahi, H. A. Colloid Surf. BBiointerfaces 2015， 130, 141. doi: 10.1016/j.colsurfb. 2015.03.045

（4）Luo, Y.； Chen, T. F.； Huang, X. C.； Wang, Y.； Huang, Y. C.；Zheng, W. J. Acta Chim. Sin. 2012， 70 （11）, 1295. ［羅 懿, 陳填峰, 黃曉純, 王 弋, 黃蔭成, 鄭文杰. 化學(xué)學(xué)報, 2012， 70 （11）, 1295.］ doi: 10.6023/A1202031

（5）Andrasi, M.； Lehoczki, G.； Nagy, Z.； Gyemant, G.； Pungor, A.；Gaspar, A. Electrophoresis 2015， 36, 1274. doi: 10.1002/elps. v36.11-12

（6）Khan, A. B.； Khan, J. M.； Ali, M. S.； Khan, R. H.； Din, K. U. Colloid Surf. B-Biointerfaces 2011， 87 （2）, 447. doi: 10.1016/j.colsurfb.2011.06.007

（7）Chi, Z.； Liu, R.； Teng, Y.； Fang, X.； Gao, C. J. Agric. Food Chem. 2010， 58, 10262.

（8）Peng, Y. L.； Wang, S. J.； Fu, L.； Zhang, C. G.； Liu, X. G. Acta Phys. -Chim. Sin. 2012， 28 （5）, 1054. ［彭玉苓. 王樹軍. 傅 麗,張成根, 劉新剛. 物理化學(xué)學(xué)報, 2012， 28 （5）, 1054.］ doi: 10.3866/PKU.WHXB201202222

（9）Uhl, P.； Bucher, R.； Schafer, R. B.； Entling, M. H.； Ling, E. Chemosphers 2015， 132, 152. doi: 10.1016/j.chemosphere. 2015.03.027

（10）Zhao, J.； Wang, M. L.； Dong, B. L.； Feng, Q.； Xu, C. X. Org. Process Res. Dev. 2013， 17, 375. doi: 10.1021/op300320a

（11）Ji, R. D.； Zhao, Z. M.； Zhang, L.； Ji, L.； Zhang, J. H.； Shen, L. B.； Lan, X. F. Spectrosc. Spect. Anal. 2013， 33 （3）, 668. ［季仁冬,趙志敏, 張 林, 季 雷, 張吉華, 沈令斌, 蘭秀風(fēng). 光譜學(xué)與光譜分析, 2013， 33 （3）, 668.］

（12）Costa, C.； Silvari, V.； Melchini, A.； Catania, S.； Heffron, J. J.；Trovato, A.； De Pasquale, R. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 2009， 672 （1）, 40. doi: 10.1016/j.mrgentox. 2008.09.018

（13）Gawade, L.； Dadarkar, S. S.； Husain, R.； Gatne, M. Food Chem. Toxicol. 2013， 51, 61. doi: 10.1016/j.fct.2012.09.009

（14）Ding, F.； Han, B. Y.； Liu, W.； Zhang, L.； Sun, Y. J. Fluoresc. 2010， 20, 753. doi: 10.1007/s10895-010-0618-0

（15）Ding, F.； Peng, W.； Diao, J. X.； Zhang, L.； Sun, Y. J. Agric. Food Chem. 2013， 61, 4497. doi: 10.1021/jf3048065

（16）Kayoko, T.； Satoshi, K.； Satoshi, K.； Atsushi, Y.； Miki, A.；David, B. S.； Kazuhiko, M. Neuropharmacology 2009， 56, 264. doi: 10.1016/j.neuropharm.2008.08.022

（17）Ding, F.； Peng, W. J. Photochem. Photobiol. B-Biol. 2015， 147, 24. doi: 10.1016/j.jphotobiol.2015.03.010

（18）Wang, J.； Li, S.； Peng, X.； Yu, Q.； Bian, H.； Huang, F.； Liang, H. J. Luminesc. 2013， 136, 422. doi: 10.1016/j.jlumin.2012.12.004

（19）Petitpas, I.； Bhattacharya, A. A.； Twine, S.； East, M.； Curry, S. J. Biol. Chem. 2013， 276, 22804.

（20）Hemmateenejad, B.； Yousefinejad, S. J. Mol. Struct. 2013， 1037, 317. doi: 10.1016/j.molstruc.2013.01.009

（21）Dangkoob, F.； Housaindokht, M. R.； Asoodeh, A.； Rajabi, O.；Zaeri, Z. R.； Doghaei, A. V. Spectroc. Acta Pt. A-Molec. Biomolec. Spectr. 2015， 137, 1106. doi: 10.1016/j.saa. 2014.08.149

（22）Song, W.； Zhang, D.； Pan, X.； Lee, D. J. J. Luminesc. 2013， 136, 80. doi: 10.1016/j.jlumin.2012.11.008

（23）Li, D. W.； He, H.； Lin, B. B.； Xu, Z. Q.； Jiang, F. L.； Liu, Y. RSC Adv. 2014， 4, 3913. doi: 10.1039/C3RA46172F

（24）Li, J. H.； Wang, S. M. J. Chem. Thermodynamics 2013， 58, 206. doi: 10.1016/j.jct.2012.11.009

（25）Zaidi, N.； Ahmad, E.； Rehan, M.； Rabbani, G.； Ajmal, M. R.；Zaidi, Y.； Subbarao, N.； Khan, R. H. J. Phys. Chem. B 2013， 117, 2595. doi: 10.1021/jp3069877

（26）Gong, Q. L.； Hu, X. G.； Fang, G. Y.； Li, X. H. J. Mol. Model. 2012， 18, 493. doi: 10.1007/s00894-011-1069-5

（27）Hu, Y. J.； Yue, H. L.； Li, X. L.； Zhang, S. S.； Tang, E.； Zhang, L. P. J. Photochem. Photobiol. B-Biol. 2012， 112, 16. doi: 10.1016/j.jphotobiol.2012.04.001

（28）Markarian, S. A.； Aznauryan, M. G. Mol. Biol. Rep. 2012， 39 （7）, 7559. doi: 10.1007/s11033-012-1590-3

（29）Banerjee, M.； Chakrabarti, A.； Basu, S. Dyes Pigment. 2013， 97,446. doi: 10.1016/j.dyepig.2013.01.005

（30）Han, X. L.； Tian, F. F.； Ge, Y. S.； Jiang, F. L.； Lai, L.； Li, D. W.；Yu, Q. L. Y.； Wang, J.； Lin, C.； Liu, Y. J. Photochem. Photobiol. B-Biol. 2012， 109, 1. doi: 10.1016/j.jphotobiol.2011.12.010

（31）Ross, P. D.； Subramanian, S. Biochemistry 1981， 20 （11）, 3096. doi: 10.1021/bi00514a017

（32）Wu, X.； Liu, J.； Huang, H.； Xue, W.； Yao, X.； Jin, J. Int. J. Biol. Macromol. 2011， 49 （3）, 343. doi: 10.1016/j.ijbiomac. 2011.05.010

（33）Wang, Q.； He, J. W.； Wu, D.； Wang, J.； Yan, J.； Li, H. J. Luminesc. 2015， 164, 81. doi: 10.1016/j.jlumin.2015.03.025

（34）Zhang, Y. Z.； Dai, J.； Xiang, X.； Li, W. W.； Liu, Y. Mol. Biol. Rep. 2010， 37, 1541. doi: 10.1007/s11033-009-9555-x

（35）Azimi, O.； Emami, Z.； Salari, H.； Chamani, J. Molecules 2010， 16 （12）, 9792.

（36）Zhang, G. W.； Ma, Y. D.； Wang, L.； Zhang, Y. P.； Zhou, J. Food Chem. 2012， 133, 264. doi: 10.1016/j.foodchem.2012.01.014

（37）Chen, T. T.； Zhu, X. T.； Chen, Q.； Ge, M.； Jia, X. P.； Wang, X.；Ge, C. W. Food Chem. 2015， 186, 292. doi: 10.1016/j.foodchem. 2014.11.041

（38）Zhang, Y. Z.； Zhou, B.； Liu, Y. X.； Zhou, C. X.； Ding, X. L.；Liu, Y. J. Fluoresc. 2008， 18, 109. doi: 10.1007/s10895-007-0247-4

（39）Punith, R.； Seetharamappa, J. Spectroc. Acta Pt. A-Molec. Biomolec. Spectr. 2012， 92, 37. doi: 10.1016/j.saa.2012.02.038

（40）Tian, F. F.； Jiang, F. L.； Han, X. L.； Xiang, C.； Ge, Y. S.； Li, J. H.； Zhang, Y.； Li, R.； Ding, X. L.； Liu, Y. J. Phys. Chem. B 2010， 114, 14842. doi: 10.1021/jp105766n

Thermodynamics of the Interaction of Imidacloprid with Human Serum Albumin

GUO Qing-Lian1PAN Ling-Li2YANG Li-Yun3HE Huan3ZHANG Ye-Zhong3LIU Yi3,*
（1Zhongnan Hospital, Wuhan University, Wuhan 430071, P. R. China；2Center Hospital of Huangshi City, Huangshi 435002, Hubei Province, P. R. China；3Department of Chemistry, College of Chemistry and Molecular Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, P. R. China）

The thermodynamics of the interaction between human serum albumin （HSA） and imidacloprid（IMI） was inνestigated using fluorescence, UV-Vis absorbance, and circular dichroism spectroscopy, in addition to molecular modeling under physiological conditions. The fluorescence quenching of HSA by IMI was a static process, which was confirmed by the UV-Vis absorption spectra. The calculated enthalpy （ΔH） and entropy （ΔS） changes implied that hydrogen bonds and νan der Waals forces played a predominant role in the binding process. Site marker competitiνe experiments along with molecular docking indicated that the binding of IMI to HSA took place primarily in site I. The circular dichroism and synchronous fluorescence spectroscopy demonstrated that the secondary structure of HSA changed after its interaction with IMI, causing the α-helix content to decrease with an increase in anunordered structure. The peptide structure extended after binding with IMI.

Imidacloprid; Human serum albumin; Interaction; Thermodynamics parameter

O642

10.3866/PKU.WHXB201511021

Received: September 21, 2015； Revised: November 2, 2015； Published on Web: November 2, 2015.

*Corresponding author. Email: yiliuchem@whu.edu.cn； Tel: +86-27-68756667.

The project was supported by the Key Project of Health and Family Planning Commission of Hubei Province, China （WJ2015MB097） and Wuhan Yellow Crane Talents Program for Science and Technology, China （2014［10］）.

湖北省衛(wèi)生計生委重點(diǎn)項目（WJ2015MB097）和武漢黃鶴英才（科技）計劃（2014［10］）資助

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