郭茂娟，索艷榮，曾文赟，楊琳，李虎虎，姜希娟

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津　300193）

·實(shí)驗(yàn)研究·

銀杏葉提取物EGB761對(duì)AS家兔PON-1和ox-LDL的影響*

郭茂娟，索艷榮，曾文赟，楊琳，李虎虎，姜希娟

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

［目的］觀察銀杏葉提取物EGB761對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化家兔對(duì)氧磷酶-1（PON-1）和氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的影響。［方法］將24只日本大耳白兔隨機(jī)分為正常組、模型組、EGB761組（n=8）。正常組給予普通飲食，模型組和EGB761組高脂飲食10周。EGB761組從第7周起給予EGB761 50 mg/（kg·d）灌胃4周，正常組和模型組給予等量生理鹽水。采用酶免疫吸附法（ELISA法）和生化法檢測(cè)PON-1的活性和含量，ELISA法檢測(cè)ox-LDL的含量。［結(jié)果］模型組PON-1活性和含量明顯降低（P＜0.05），ox-LDL的含量明顯升高，銀杏葉提取物組PON-1活性和含量明顯升高，ox-LDL明顯降低（P＜0.05）。［結(jié)論］銀杏葉提取物EGB761降低ox-LDL、抗動(dòng)脈粥樣?；ˋS）的機(jī)制可能與其上調(diào)PON-1活性和含量有關(guān)。

銀杏葉提取物EGB761；對(duì)氧磷酶-1；氧化低密度脂蛋白；動(dòng)脈粥樣硬化

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是諸多心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，而血脂紊亂，尤其是低密度脂蛋白（LDL）、極低密度脂蛋白（VLDL）的升高是形成AS的物質(zhì)基礎(chǔ)。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)，氧化應(yīng)激增強(qiáng)，脂質(zhì)過(guò)氧化，沉積于內(nèi)膜下的LDL被氧化修飾成氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），ox-LDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，可損傷內(nèi)皮，導(dǎo)致更多LDL沉積于內(nèi)皮下，同時(shí)募集單核細(xì)胞侵入內(nèi)皮并分化為巨噬細(xì)胞后吞噬ox-LDL，形成泡沫細(xì)胞，促進(jìn)AS形成［1］。

對(duì)氧磷酶-1（PON-1）是一種由355個(gè)氨基酸組成的具有類似過(guò)氧化物酶活性的糖蛋白，廣泛存在于哺乳動(dòng)物的肝、脾、腦等組織及血液中，尤以肝及血液中的活性較高［2］。其主要由肝臟合成，分泌入血后與高密度脂蛋白（HDL）表面的apoA-I緊密結(jié)合，保護(hù)HDL免受氧化修飾［3］。同時(shí)PON-1亦可水解芳香族羧酸酯類及脂質(zhì)過(guò)氧化物，使LDL免受氧化修飾［4］。現(xiàn)代研究表明PON-1第283位的Cys是發(fā)揮抗LDL氧化修飾的關(guān)鍵基團(tuán)［5］。

EGB761是從銀杏葉中分離純化的提取物，其主要成分是24%的銀杏黃酮苷和6%的萜烯內(nèi)酯。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究均證實(shí)銀杏葉提取物EGB761具有明顯抗AS效應(yīng)［6-7］，然而，其具體機(jī)制是否與調(diào)控PON-1活性及含量，進(jìn)而抑制ox-LDL形成有關(guān)，還有待進(jìn)一步深入研究。本文將從調(diào)控PON-1活性及含量入手，探討EGB761降低ox-LDL含量以發(fā)揮抗AS作用。

1　材料和方法

1.1藥品、試劑和儀器銀杏葉提取物（EGB761）（商品名：金納多），由德國(guó)威瑪舒培博士藥廠生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：9840808。PON-1活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)置于上海鈺博生物科技有限公司。PON-1酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)試劑盒、ox-LDL ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于上海雅吉生物科技有限公司。高脂飼料由2%膽固醇（購(gòu)置于天津市英博生化試劑有限公司，含量純度＞98%）、10%金龍魚(yú)色拉油（市售）、88%普通飼料（由天津市武清區(qū)科達(dá)養(yǎng)殖中心提供）混合配成。儀器：離心機(jī)（CENCEL530），酶標(biāo)儀（BIO-RAD）。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物日本大耳白兔24只（購(gòu)置于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），雄性，體質(zhì)量（2.4±0.2）kg，飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及造模方法24只日本大耳白兔，于溫度（28±2）℃、濕度37%～48%的清潔級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組：正常組（n=8）給予普通兔飼料；模型組（n=8）和EGB761組（n=8）給予高脂飼料，自由飲水。

在高脂飼養(yǎng)6周后，EGB761組給予銀杏葉提取物EGB761 50 mg/（kg·d）灌胃4周，正常組和模型組則給予等量生理鹽水。

1.4樣本的獲取和處理10周后各組動(dòng)物禁食不禁水12 h，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后，經(jīng)耳緣靜脈取血，3 000 r/min離心15 min，吸取上層血清，置于-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5指標(biāo)檢測(cè)方法及步驟血清PON-1和ox-LDL含量的檢測(cè)參照ELISA試劑盒說(shuō)明書。PON-1酶活力的檢測(cè)：以對(duì)氧磷為酶作用底物，依據(jù)酶學(xué)動(dòng)力學(xué)原理，對(duì)其在405 nm處4 min內(nèi)產(chǎn)物的生成速率進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，酶活性以每毫升血清每分鐘生成產(chǎn)物對(duì)硝基酚的納摩爾數(shù)表示1個(gè)PON-1酶活性單位值（單位U/mL）。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，組間比較使用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1EGB761對(duì)PON-1含量和活性的影響見(jiàn)表1。

表1　EGB761對(duì)PON-1含量和活性的影響（±s）

表1　EGB761對(duì)PON-1含量和活性的影響（±s）

注：與正常組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別nPON-1含量（ng/L）PON-1活性（U/mL）正常組8564.50±36.83102.00±16.08模型組8420.83±31.51**69.33±16.51** EGB761組8506.67±42.55##88.67±9.03#

由表1可以看出，與正常組相比模型組PON-1的含量和活性均明顯降低（P＜0.01）；而EGB761組與模型組相比，PON-1的含量（P＜0.01）及活性（P＜0.05）明顯提高。

2.2EGB761對(duì)ox-LDL含量的影響見(jiàn)表2。

表2　EGB761對(duì)ox-LDL含量的影響（±s）

表2　EGB761對(duì)ox-LDL含量的影響（±s）

注：與正常組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05。

組別nox-LDL（μg/L）正常組8250.83±38.22模型組8630.50±136.02** EGB761組8480.83±51.31#

以上結(jié)果說(shuō)明，模型組的ox-LDL含量明顯升高，與正常組相比具有顯著性差異（P＜0.01）；而EGB761組與模型組相比，ox-LDL的含量明顯降低（P＜0.05）。

3　討論

AS的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，血脂紊亂、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能失調(diào)、慢性炎癥反應(yīng)等被認(rèn)為是AS發(fā)生發(fā)展的重要因素。其中氧化應(yīng)激參與并促進(jìn)AS的發(fā)生、發(fā)展，在AS病程中發(fā)揮重要作用［8］。

流行病學(xué)調(diào)查顯示，引起AS的關(guān)鍵是氧化修飾性脂蛋白，尤其是血液中的LDL被活性氧（ROS）等自由基氧化后形成ox-LDL。ox-LDL作為氧化應(yīng)激的特異性產(chǎn)物，在被氧化過(guò)程中，可以產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的溶血磷脂損傷內(nèi)皮細(xì)胞，加速泡沫細(xì)胞形成，促進(jìn)AS的病程進(jìn)展［9］。

前期實(shí)驗(yàn)［10］發(fā)現(xiàn)EGB761可以改變AS家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊形態(tài)，而本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)EGB761干預(yù)的AS家兔血清中的ox-LDL較模型組下調(diào)，提示EGB761可能通過(guò)干預(yù)LDL的氧化修飾防治AS。

PON-1具有過(guò)氧化物酶活性，血清中PON-1含量及活性的高低，反映了其抗脂質(zhì)氧化的能力。血清中的PON-1與HDL上的ApoAⅠ具有很強(qiáng)的親和力，兩者結(jié)合后，可以使PON-1形成高穩(wěn)定性和高活性的構(gòu)型，從而使其內(nèi)酯酶活性提高約20倍［11］。

這樣一方面，使HDL免于氧化修飾，提高了膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，另一方面，減少了LDL的氧化修飾，降低了溶血磷脂的產(chǎn)量，從而起到保護(hù)內(nèi)皮，預(yù)防AS的目的［12］。相反，當(dāng)AS發(fā)生時(shí)，PON-1的含量或活性下降，參與水解脂質(zhì)過(guò)氧化的能力減弱，造成脂質(zhì)過(guò)氧化物在血液中大量堆積，促進(jìn)ox-LDL形成，后者損傷內(nèi)皮，使脂質(zhì)在內(nèi)膜下大量沉積，進(jìn)一步惡化AS［13］。

臨床研究也證實(shí)血清PON-1活性下降和ox-LDL水平升高與冠心病的發(fā)生及病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)［14］。而PON-1活性下降和含量降低是ox-LDL水平升高的關(guān)鍵影響因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)高脂誘導(dǎo)復(fù)制的家兔AS模型，PON-1的活性及含量明顯降低，而經(jīng)EGB761干預(yù)后，其活性與含量都顯著提高，此結(jié)果與伍海濤［15］的研究結(jié)果基本一致。

現(xiàn)代臨床和實(shí)驗(yàn)對(duì)銀杏葉提取物保護(hù)神經(jīng)元的研究頗多［16-19］，并主要集中在抗凋亡、抑制氧化應(yīng)激等方面［20］。亦有研究從抗氧化損傷，抗炎癥角度發(fā)現(xiàn)EGB761對(duì)AS具有防治作用［21-23］，但目前關(guān)于探討EGB761在調(diào)節(jié)PON-1和ox-LDL兩者之間關(guān)系上，很少有相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用EGB761干預(yù)高脂誘導(dǎo)的AS家兔模型發(fā)現(xiàn)其可以顯著降低AS家兔血清中ox-LDL的含量，并上調(diào)PON-1的活性及含量。將ox-LDL與PON-1聯(lián)系起來(lái)，提示EGB761可能通過(guò)上調(diào)PON-1酶的活性和含量，降低LDL的氧化修飾機(jī)率，從而降低ox-LDL水平，進(jìn)而發(fā)揮抗AS的作用。

本文的研究結(jié)果只涉及到血清層面，并未涉及血管組織中ox-LDL的變化，以及具體的信號(hào)通路還有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

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Effects of EGB761 on PON-1 and ox-LDL in rabbits with atherosclerosis

GUO Mao-juan，SUO Yan-rong，ZENG Wen-yun，YANG Lin，LI Hu-hu，JIANG Xi-juan（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To observe effect of EGB761 on PON-1 and ox-LDL in rabbits with atherosclerosis.［Methods］Twenty-four Japanese white rabbits were randomly divided into normal group，model group and EGB761 group.Rabbits in normal group were fed with ordinary diet；model and EGB761 group were given high-fat diet for 10 weeks.Meanwhile，from the seventh week，rabbits in EGB761 group were given 50 mg/（kg·d）of EGB761，control group and model group were given normal saline for 4 weeks.Ten weeks later，the vitality and content of PON-1 were detected by Elisa and biochemical methods，the ox-LDL were detected by Elisa method.［Results］Compared with the model group，the vitality and content of PON1 in model group were higher（P＜0.05）and the ox-LDL levels were lower，while in EGB761 group the vitality and content of PON-1 increased significantly and ox-LDL decreased obviously（P＜0.05）.［Conclusion］The effect of EGB761 on reducing the level of ox-LDL in AS rabbits may response to raise the vitality and content of PON-1.

EGB761；PON-1；ox-LDL；AS

R285.5

A

1673-9043（2016）02-0095-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.02.07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（830472117，81202797）；天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（08JCYBJC10800）。

郭茂娟（1980-），女，副教授，主要從事中醫(yī)藥防治心血管疾病的研究。

姜希娟，E-mail：xijuanjiang@foxmail.com。

（2015-11-28）