唐 嵐，姜燕清，計燕萍，馬列峰，單偉光

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.嘉興學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001)

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大孔樹脂純化秋茄葉總黃酮及其抗氧化活性研究

唐 嵐1，姜燕清1，計燕萍2，馬列峰1，單偉光1

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.嘉興學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001)

研究秋茄葉總黃酮的大孔樹脂純化工藝及其抗氧化活性.以總黃酮吸附量和解吸率為指標(biāo)，考察大孔樹脂純化秋茄葉總黃酮的最佳工藝條件.采用DPPH自由基、還原力體系，檢測了秋茄葉總黃酮的體外抗氧化活性.結(jié)果表明：HPD722樹脂純化效果最佳，經(jīng)最佳工藝條件純化后，提取物中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)77.48%.秋茄葉總黃酮具有良好的清除DPPH自由基活性和還原能力，EC50分別為21.8 μg/mL和1.09 mg/mL.HPD722樹脂純化秋茄葉總黃酮的效果顯著，秋茄葉總黃酮具有較強的抗氧化活性.

秋茄葉；總黃酮；大孔吸附樹脂；純化；抗氧化活性

秋茄(Kandeliacandel)為紅樹林秋茄屬植物，生長在海岸潮間帶或海灣平坦泥灘上，秋茄根、葉和果和枝均可藥用，作為民間藥用植物在我國已有很長歷史.秋茄主要含有黃酮類、甾醇類、萜類、多糖及鞣質(zhì)等物質(zhì)，秋茄已報道具有抗氧化、止血、抑菌、抗腫瘤和降血脂功效[1-5].大孔樹脂是一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)人工合成的聚合物吸附劑，具有吸附選擇性強、脫附再生容易、性能穩(wěn)定和操作簡單等優(yōu)點[6-8]，被廣泛的用于黃酮類、皂苷類和生物堿類等的分離純化[9-12].秋茄葉中富含黃酮類成分，李寶才[1]使用乙醇萃取秋茄葉，經(jīng)DA201大孔離子交換樹脂分離純化得總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為29.3%的秋茄黃酮粉末，并證明其有顯著的抗氧化活性.紀(jì)麗麗等[3]以AB-8大孔離子交換樹脂分離純化秋茄葉乙醇提取液，得總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.8%的秋茄黃酮粉末，并證明其具有抑菌活性.筆者從秋茄葉中提取黃酮類物質(zhì)，得率約為7%，為秋茄資源的進(jìn)一步開發(fā)利用，得到更高純度總黃酮，本實驗采用大孔樹脂純化方法從秋茄葉提取物中獲得較高純度的秋茄葉總黃酮，并從清除DPPH自由基和還原力方面考察秋茄葉總黃酮的抗氧化能力.

1 材料和儀器

秋茄葉(采自浙江省溫州樂清市西門島南岙村濱海濕地，由浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院楚楚副教授鑒定)；蘆丁對照品(北京恒元啟天化工技術(shù)研究院，批號：MUST-13040302，純度≥98%)；HPD722，HPD417，HPD100，DM130，AB-8，D101，HPD826型號大孔樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)；1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH·，阿拉丁)；維生素C、三氯乙酸均購于杭州昊天生物技術(shù)有限公司；鐵氰化鉀(溫州市化學(xué)用料廠)；三氯化鐵(如皋市金陵試劑廠)；紫外-可見分光光度計(RF-540型，日本島津)；中藥材粉碎機(FW500，鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司)；恒溫?fù)u床(ZHWY-2102型，上海比朗儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R210型，瑞士BUCHI)；恒溫水浴鍋(H-1012398，上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；低溫高速臺式離心機(17R型號，賽默飛世爾).

2 方法與結(jié)果

2.1 秋茄葉總黃酮的測定

2.1.1 對照品溶液的配制

精密稱取蘆丁對照品10 mg，用60%乙醇溶解并稀釋至50 mL，即得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的對照品儲備液.

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取蘆丁儲備液0，0.5，1.5，2.0，2.5 mL于10 mL比色管中，加5% NaNO2溶液0.6 mL，搖勻，加10% Al(NO3)3溶液0.6 mL，搖勻靜置6 min，再加入1 mol/L NaOH溶液6 mL，最后用60%乙醇定容至刻度，搖勻，測定500 nm波長處吸光度.以蘆丁對照品溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為A=12.641 1C-0.002 9，r=0.999 9.

2.1.3 供試品溶液的制備及測定方法

取秋茄葉藥材粗粉適量，用15倍量體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇于80 ℃水浴下回流提取2 次，每次0.5 h，抽濾，合并濾液，減壓濃縮至溶液無醇味，加適量蒸餾水溶解稀釋，離心，得上清液樣品.精密吸取適當(dāng)體積原樣液、經(jīng)靜態(tài)和動態(tài)吸附后樣液于10 mL比色管中，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”方法操作，經(jīng)NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色后于測定500 nm波長處吸光度，計算總黃酮質(zhì)量濃度.

2.2 大孔樹脂的預(yù)處理

大孔樹脂經(jīng)體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸泡處理后，濕法裝柱，繼續(xù)用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇沖洗至V(流出液)∶V(水)=1∶5無白色渾濁為止，然后用蒸餾水洗至無醇味，備用.

2.3 大孔樹脂的篩選

2.3.1 不同大孔樹脂對秋茄葉總黃酮靜態(tài)吸附-解吸性能考察

分別取不同型號已預(yù)處理好的濕樹脂，每份1 mL，置250 mL磨口三角瓶中，加入一定濃度提取液樣品80 mL，放置恒溫?fù)u床中25 ℃，100 r/min恒溫振蕩 12 h后將樹脂濾出，濾液定容于100 mL量瓶，測定濾液中總黃酮濃度.將吸附平衡的樹脂用蒸餾水洗滌后放入錐形瓶中，加入95%乙醇80 mL，25 ℃，100 r/min振蕩12 h進(jìn)行洗脫，然后將樹脂濾出，濾液定容于100 mL量瓶，測定洗脫液中總黃酮濃度，計算總黃酮吸附量和解吸率，結(jié)果見表1.結(jié)果表明：HPD100，HPD722和HPD826對秋茄葉總黃酮的吸附量和解吸率明顯優(yōu)于其他幾種樹脂，故選擇這3種進(jìn)行動態(tài)吸附-解吸的考察，從中篩選出較佳的大孔樹脂.

吸附量Q和解吸率R計算公式分別為

(1)

(2)

其中：C1，C2分別為吸附前、后樣品溶液中總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；C3為洗脫液中總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；V0為樹脂體積，mL；V1為樣品液體積，mL；V2為吸附液體積，mL；V3為洗脫液體積，mL.

表1 靜態(tài)吸附-解吸考察結(jié)果

2.3.2 不同大孔樹脂對秋茄葉總黃酮動態(tài)吸附-解吸附性能考察

取預(yù)處理好的大孔樹脂裝柱(固定徑高比1∶6)，加入一定濃度的提取液至流出液中顯色反應(yīng)呈陽性后靜置30 min，用蒸餾水洗柱至無色，收集蒸餾水并測體積和吸光度.用80%乙醇進(jìn)行洗脫至顯色反應(yīng)陰性，收集洗脫液測體積和吸光度，計算吸附量和解吸率.由表2可知：HPD722在動態(tài)吸附和解吸方面，明顯優(yōu)于其他兩種型號的樹脂，故宜選用HPD722型大孔吸附樹脂作為秋茄葉總黃酮富集和純化的載體.

吸附量Q和解吸率R計算公式分別為

(3)

(4)

式中：C上為上樣液中黃酮質(zhì)量濃度； V上為上樣液總體積；C殘為過柱流出液中黃酮平均質(zhì)量濃度；V殘為過柱流出液總體積；C水洗為蒸餾水洗脫下來的黃酮平均質(zhì)量濃度；V水洗為洗脫的蒸餾水體積；C醇為乙醇洗脫下來的黃酮平均質(zhì)量濃度 ；V醇為洗脫的乙醇總體積；V為樹脂體積.

表2 動態(tài)吸附-解吸考察結(jié)果

2.4 HPD722大孔樹脂純化秋茄葉總黃酮工藝的優(yōu)化

2.4.1 上樣質(zhì)量濃度的確定

取大孔吸附樹脂3份分別裝入樹脂柱，分別加入總黃酮質(zhì)量濃度為1.5，2.8，5.0 mg/mL樣品液，上樣流速2 mL/min進(jìn)行動態(tài)吸附.1% FeCl3乙醇溶液顯色檢查流出液，當(dāng)顯色反應(yīng)呈陽性時，停止上樣，靜置1 h后，用水洗至無色，合并收集流出液和水洗液，測總黃酮含量，計算總黃酮吸附量，結(jié)果分別為13.16，18.77，22.98 mg/mL.由結(jié)果可知：上樣質(zhì)量濃度較高為好，但質(zhì)量濃度超過5 mg/mL容易堵塞樹脂柱，因此確定上樣質(zhì)量濃度約為5 mg/mL.

2.4.2 吸附時間的確定

取大孔吸附樹脂五份分別裝入樹脂柱，按上述所確定的質(zhì)量濃度上樣進(jìn)行動態(tài)吸附，分別放置0，0.5，1.0，1.5，2.0 h后用水洗脫，收集洗脫液，測定，計算總黃酮吸附量，結(jié)果見表3.由表3可知：在靜置0.5 h后黃酮的吸附量基本不變，這可能是在0～0.5 h內(nèi)柱子中游離的秋茄葉總黃酮和樹脂空隙中的黃酮逐漸被樹脂所吸附，使得黃酮的吸附量升高.而黃酮的解吸率在各個時間點都比較高，沒有顯著性差異，因此選擇上樣后靜置吸附0.5 h.

表3 吸附時間的影響

2.4.3 上樣流速的確定

取大孔吸附樹脂三份裝入樹脂柱，加入最佳質(zhì)量濃度樣品液，分別以1，2和3 mL/min的流速進(jìn)行動態(tài)吸附.待顯色反應(yīng)呈陽性時，停止上樣，記錄上柱量，測定，計算總黃酮吸附量，結(jié)果分別為28.54，23.33，22.60 mg/mL.由結(jié)果可知：上樣流速則是越慢越好，考慮到效率問題，確定上樣流速為1 mL/min，即為3 BV/h.

2.4.4 上樣量的確定

取大孔吸附樹脂裝入樹脂柱，按上述所確定的吸附條件上樣，分段收集流出液，每10 mL收集1份，共收集25份.測定每份收集液的總黃酮質(zhì)量濃度，確定最佳上樣量，繪制泄漏曲線.由圖1可以看出：從第14份洗脫液開始，洗脫液中的黃酮質(zhì)量濃度增大明顯，說明此時秋茄葉總黃酮開始明顯泄漏.故確定樣品液的最大上柱體積為130 mL，即6.5 BV.

圖1 上樣量泄漏曲線Fig.1 Leak curve of sample volume

2.4.5 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的確定

取大孔吸附樹脂五份分別裝入樹脂柱，按上述所確定的吸附條件上樣，進(jìn)行動態(tài)吸附，先水洗后分別用20%，35%，50%，65%，80%，95%體積分?jǐn)?shù)乙醇以2 mL/min的流速洗脫至顯色反應(yīng)陰性，收集洗脫液，測定，計算總黃酮解吸率和固形物中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù).結(jié)果見表4.由表4可知：50%的乙醇洗脫黃酮的解吸率和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)都較高，因此選擇50%乙醇為洗脫劑.

表4 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)考察結(jié)果

2.4.6 洗脫流速的確定

取大孔吸附樹脂3份分別裝入樹脂柱，按上述所確定的吸附條件上樣，進(jìn)行動態(tài)吸附，解吸流速分別為1，2，3 mL/min進(jìn)行解吸，收集洗脫液，測定，計算總黃酮解吸率.結(jié)果不同洗脫流速的總黃酮解吸率分別為95.02%，94.15%，93.92%.由結(jié)果可知：洗脫流速越低，解吸率越高，解吸效果越好，因此選擇1 mL/min作為洗脫流速，即為3 BV/h.

2.4.7 洗脫劑用量的確定

取大孔吸附樹脂裝入樹脂柱，按上述所確定的吸附條件上樣、洗脫，分段收集共5份洗脫液，每份為l個樹脂柱體積(1.0 BV)，測定并計算每份洗脫液的總黃酮質(zhì)量濃度和累積洗脫率.結(jié)果見表5.由表5可知：當(dāng)收集到2倍柱體積的時候，大部分的黃酮已經(jīng)由大孔樹脂中解吸出來；當(dāng)收集到4倍柱體積的時候，積累解吸率已達(dá)到98.61%.說明此時黃酮類化合物已基本洗脫完全，從節(jié)約資源和黃酮純度的角度考慮，選擇4倍柱體積.

表5 洗脫劑用量考察結(jié)果

2.4.8 最佳工藝驗證

取未經(jīng)處理的HPD722大孔樹脂50 g共三份，樹脂預(yù)處理后，裝于徑高比分別為1∶6樹脂柱內(nèi)，以3 BV/h流速上樣，上樣液總黃酮質(zhì)量濃度為5 mg/mL，上樣體積為6.5 BV，放置30 min后，先用蒸餾水沖洗雜質(zhì)，然后用4 BV 50%乙醇洗脫，以3 BV/h流速洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮干燥得浸膏，計算總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù).結(jié)果見表6，三批浸膏粉中，總黃酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為77.48%，RSD為0.62%，表明工藝穩(wěn)定、可行.

表6 驗證試驗結(jié)果

2.5 秋茄葉總黃酮抗氧化能力研究

2.5.1 秋茄葉總黃酮對DPPH自由基清除活性的測定

DPPH自由基清除活性參考Adeolu[13]等方法.3.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液與不同質(zhì)量濃度的1.0 mL秋茄葉總黃酮溶液混合均勻，靜置室溫反應(yīng)30 min，517 nm處測定吸光度值A(chǔ)1，并與維生素C進(jìn)行比較.以1.0 mL 60%乙醇代替待測液，得吸光度A2，以3.0 mL 60%乙醇代替DPPH溶液，得吸光度A0.清除率計算公式為

(5)

由圖2可知：秋茄葉總黃酮具有良好的清除DPPH·作用，并且隨著濃度的增大，清除活性也隨之增強，其EC50為21.8 μg/mL，雖然其活性較對照組Vc低(EC50=8.75 μg/mL)，但在50 μg/mL時其活性已達(dá)到78.57%.

圖2 Vc和秋茄葉總黃酮對DPPH·的清除能力Fig.2 Scavenging activity of Vc and total flavonoids from Kandelia candel against DPPH·

2.5.2 秋茄葉總黃酮總還原能力考察

圖3 Vc和秋茄葉總黃酮的相對還原力Fig.3 Reductive activity of Vc and total flavonoids from Kandelia candel leaves

3 結(jié) 論

通過靜態(tài)吸附與解吸、動態(tài)吸附與解吸試驗，對7種大孔樹脂HPD722，HPD417，HPD100，DM130，AB-8，D101，HPD826進(jìn)行篩選，得出HPD722型樹脂對秋茄葉總黃酮有較好的吸附和解吸性能，富集效果好，因此選用HPD722樹脂進(jìn)行純化工藝研究.最佳純化工藝為：上樣液質(zhì)量濃度為5 mg/mL，上樣流速為3 BV/h，上樣體積為6.5 BV，吸附30 min后，先用蒸餾水洗脫除去雜質(zhì)，然后用4 BV 50%乙醇以3 BV/h流速洗脫.利用HPD722樹脂純化得到總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為77.48%的產(chǎn)品.且純化后的秋茄葉總黃酮具有良好的清除DPPH自由基活性和還原能力，EC50分別為

21.8 μg/mL和1.09 mg/mL，表明秋茄葉總黃酮有望成為一種優(yōu)良的天然抗氧化劑.

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(責(zé)任編輯：劉 巖)

Study on purification with macroporous resin and antioxidant activity of flavonids fromKandeliacandelleaves

TANG Lan1, JIANG Yanqing1, JI Yanping2, MA Liefeng1, SHAN Weiguang1

(1.College of Pharmacy, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China;2.Medical College of Jiaxing University, Jiaxing 314001, China)

The purification with macroporous resin and antioxidant activities of flavonoids fromKandeliacandelleaves were studied by the optimal purification technology with taking the adsorption amount and desorption rate as the evaluation index. The antioxidant activities ofKandeliacandelleaves flavonoids was detected by DPPH and reducing power. The result showed that HPD722 resin was the best resin for purification of flavonoids. The purity of total flavonoids has been increased to 77.48% after the purification under optimised conditions. The flavonoids came fromKandeliacandelleaves had strong scavenging DPPH radical(EC50=21.8 μg/mL)and reducing power(EC50=1.09 mg/mL). HPD722 resin is the best resin for the purification of flavonoids and the flavonoids fromKandeliacandelleaves has strong antioxidant activity.

Kandeliacandelleaves；total flavonoids；macroporous resin; purification; antioxidant activity

2016-03-01

浙江省科技廳公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃(2012C23028)

唐 嵐(1974—)，女，廣西玉林人，副教授，研究方向為中藥制劑，E-mail tanglan@zjut.edu.cn.

R284.2

A

1006-4303(2016)05-0519-05