劉真真, 齊沛沛, 王新全, 陳文學(xué), 吳莉宇, 王 強(qiáng)*

(1. 海南大學(xué)食品學(xué)院, 海南 海口 570228; 2浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所, 浙江 杭州 310021)

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研究論文

超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定果蔬中維生素C

劉真真1,2, 齊沛沛2, 王新全2, 陳文學(xué)1, 吳莉宇2, 王 強(qiáng)1,2*

(1. 海南大學(xué)食品學(xué)院, 海南 ?？?570228; 2浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所, 浙江 杭州 310021)

利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF/MS)快速與高分辨的分析優(yōu)勢(shì),通過(guò)系統(tǒng)地考察樣品制備、儀器分析中影響維生素C響應(yīng)靈敏度和穩(wěn)定性的各主要因素,建立了果蔬中維生素C的定量分析方法。果蔬樣品在干冰保護(hù)下高速勻漿獲得均勻的勻漿液,用0.1%(v/v)甲酸溶液提取后,采用Waters Acquity-UPLC T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)分析,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣量為5 μL,流動(dòng)相為0.05%(v/v)甲酸-甲醇溶液(8∶2, v/v),流速為0.25 mL/min。提取的定量離子為[M-H]-(m/z175.023 8),定性離子為[M-C3H4O3]-(m/z87.007 7),質(zhì)量允許誤差為5×10-6(5 ppm)。結(jié)果表明:維生素C在0.02～5.0 mg/L范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度呈線性,線性相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 2;檢出限及定量限分別為0.008 mg/L(S/N=3)和0.02 mg/L(S/N=10);在不同添加水平下,維生素C的平均回收率為89.3%～113%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.40%。在優(yōu)化的條件下,對(duì)32批次的國(guó)產(chǎn)和新西蘭獼猴桃樣品進(jìn)行檢測(cè),國(guó)產(chǎn)獼猴桃中維生素C的含量范圍為498～1 625 mg/kg,新西蘭進(jìn)口獼猴桃中維生素C的含量范圍為247～449 mg/kg。該方法操作簡(jiǎn)便,重復(fù)性良好,可用于果蔬中維生素C含量的準(zhǔn)確測(cè)定。

超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜;維生素C;果蔬

維生素C又名L-抗壞血酸,是一種天然的抗氧化劑,主要以還原型維生素C的形式存在于新鮮的果蔬中[1]。它可以與生育酚、還原型輔酶Ⅱ在體內(nèi)協(xié)同清除自由基,發(fā)揮抗氧化作用[2-4];同時(shí),它能夠阻止亞硝胺的形成,具有防癌和增加機(jī)體抵抗力的作用[5,6]。

目前,果蔬中維生素C的測(cè)定方法有氧化還原滴定法、自動(dòng)電位滴定法、分光光度法和高效液相色譜法等[7-17]。氧化還原滴定法因人為判定終點(diǎn),易造成偏差;自動(dòng)電位滴定法依據(jù)電極變化率判定終點(diǎn),可避免人為因素偏差,但易受基質(zhì)中還原性物質(zhì)的影響;分光光度法通過(guò)測(cè)定維生素C的紫外吸光度而定量,而果蔬基質(zhì)在紫外區(qū)也存在本底吸收,易干擾測(cè)定結(jié)果;高效液相色譜法通常利用紫外檢測(cè)器測(cè)定,因此同樣存在基質(zhì)干擾的情況。

質(zhì)譜檢測(cè)具有高選擇性、高靈敏度、特異性強(qiáng)等特點(diǎn),檢出限低,可以進(jìn)行低濃度樣品的定量檢測(cè),在分析中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。近年來(lái)已有報(bào)道采用液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜等用于維生素C的分析測(cè)定[18,19]。而超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF/MS)兼具超高效液相色譜和飛行時(shí)間質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì),是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的定性定量分析技術(shù)[20,21]。超高效液相色譜系統(tǒng)使樣品的色譜分離更快速;四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜則具有高分辨率、高選擇性的特點(diǎn),可以通過(guò)精確相對(duì)分子質(zhì)量和碎片信息匹配等方式來(lái)排除三重四極桿質(zhì)譜可能存在的假陽(yáng)性問(wèn)題,實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的化合物定性功能。而目前尚未有研究報(bào)道利用UPLC-Q-TOF/MS分析果蔬中的維生素C。因此,本研究基于UPLC-Q-TOF/MS快速、高分辨等優(yōu)勢(shì),選擇富含維生素C的典型果蔬品種——獼猴桃、橙子及番茄為分析對(duì)象,建立果蔬中維生素C的快速準(zhǔn)確測(cè)定方法。

本工作針對(duì)維生素C在水溶液及堿性條件下易被氧化的特性,采用0.1%(v/v)的甲酸作為提取溶劑,并著重研究色譜柱及流動(dòng)相組成對(duì)其分離和響應(yīng)的影響,結(jié)合UPLC-Q-TOF/MS建立了果蔬中維生素C的定量分析方法,為果蔬中維生素C的測(cè)定提供新的方法依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀ACQUITYTMUPLC和飛行時(shí)間質(zhì)譜儀Xevo G2-S-Q-TOF/MS(美國(guó)Waters公司); Waters Acquity-UPLC T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm,美國(guó)Waters公司)。Waters UPLC-BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美國(guó)Waters公司), Phenomenon LC-HILIC色譜柱(150 mm×2 mm, 3 μm,美國(guó)Phenomenon公司)。IKA T18 basic Ultra-Turrax勻漿機(jī)(德國(guó)IKA公司); Filter Unit濾膜(0.22 μm,天津Agela Technologies公司);甲酸(色譜純,美國(guó)ACS公司),甲醇(色譜純,美國(guó)Merck公司),實(shí)驗(yàn)用水為超純水(Milli-Q超純水系統(tǒng),美國(guó)Millipore公司)。

維生素C標(biāo)準(zhǔn)品(含量99.7%)購(gòu)于上海伯奧生物科技有限公司。獼猴桃、西紅柿、橙子購(gòu)于浙江省杭州市超市。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

將果蔬樣品去皮洗凈,分別快速切碎混勻。準(zhǔn)確稱取20.00 g (±0.05 g)于勻漿杯中,加入20 mL 0.2%(v/v)的甲酸,然后加入20 g干冰,放置于組織勻漿機(jī)中勻漿。準(zhǔn)確稱取2.00 g (±0.05 g)勻漿液于燒杯中,加入適量0.1%(v/v)甲酸溶液將其轉(zhuǎn)容至500 mL棕色容量瓶中,并定容至刻度(將燒杯進(jìn)行多次洗滌,保證果蔬樣品完全轉(zhuǎn)入容量瓶中),充分混勻,靜置提取20 min,用0.22 μm濾膜過(guò)濾待測(cè)(實(shí)驗(yàn)均避光操作)。

1.2.2 UPLC-Q-TOF/MS分析

采用UPLC-Q-TOF/MS對(duì)獼猴桃中的維生素C進(jìn)行測(cè)定分析。色譜柱為Waters Acquity-UPLC T3(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)。流動(dòng)相為水和甲醇(8∶2, v/v),其中水相中加入0.05%(v/v)甲酸。流速為0.25 mL/min,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣量為5 μL。質(zhì)譜條件:采用MS和分辨率模式分析,電噴霧負(fù)離子源(ESI-),毛細(xì)管電壓為2.00 kV,錐孔電壓為40 V,脫溶劑氣和進(jìn)樣錐孔氣流速分別為800 L/h和50 L/h,脫溶劑氣溫度為450 ℃,離子源溫度為120 ℃,碰撞氣為高純氬氣,霧化氣為高純氮?dú)?提取的定量離子為[M-H]-(m/z175.023 8),定性離子為[M-C3H4O3]-(m/z87.007 7)(碰撞能量(CE): 20 eV),質(zhì)量允許誤差為5×10-6(5 ppm); Lockspray采用亮氨酸腦啡肽(leueine enkephalin)進(jìn)行質(zhì)量數(shù)實(shí)時(shí)校準(zhǔn),系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)采集分析采用MassLynxTM4.1軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的確定

采用蠕動(dòng)泵進(jìn)樣來(lái)優(yōu)化樣品,其中樣品為維生素C的標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1%(v/v)甲酸溶解并定容),質(zhì)量濃度為2 mg/L,流速為5 μL/min。在負(fù)離子源模式下,采用Q-TOF/MS對(duì)維生素C進(jìn)行質(zhì)譜掃描,通過(guò)優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、脫溶劑氣流速等質(zhì)譜條件,獲得較高響應(yīng)的質(zhì)荷比(m/z為175.023 8),而維生素C的[M-H]-的m/z理論為175.024 3,質(zhì)量相對(duì)偏差為2.86 ppm,在測(cè)定允許精度5 ppm的范圍內(nèi)。進(jìn)一步對(duì)母離子m/z175.023 8施加CE 10、12、15、20 eV,獲得其二級(jí)質(zhì)譜圖(見圖1)。由圖1可知,[M-H]-(m/z175.023 8)隨著CE的增大發(fā)生不同程度的裂解,產(chǎn)生更多的碎片離子,CE為10、12、15 eV時(shí),離子豐度最高的特征碎片為115.004 0,對(duì)應(yīng)于[M-C2H5O2]-(m/z理論值為115.003 1),質(zhì)量相對(duì)偏差為7.83 ppm; CE為20 eV時(shí),豐度最高的特征碎片為m/z87.007 7,對(duì)應(yīng)于[M-C3H4O3]-(m/z理論值87.008 0),質(zhì)量相對(duì)偏差為3.45 ppm,各碎片離子的結(jié)構(gòu)如圖1所示。同時(shí),隨著CE的增加,母離子和碎片離子的響應(yīng)都呈下降趨勢(shì),因此,為實(shí)現(xiàn)對(duì)維生素C的準(zhǔn)確定量,選擇定量離子為[M-H]-(m/z175.023 8),定性離子為[M-C3H4O3]-(m/z87.007 7)(CE: 20 eV),質(zhì)量允許誤差為5 ppm。

圖 1 不同碰撞能量下維生素C的質(zhì)譜圖Fig. 1 Mass spectra of vitamin C on different collision energies

2.1.2 色譜柱的選擇

本研究考察了3種色譜柱(C18、T3和HILIC)對(duì)維生素C的保留和響應(yīng)的影響。流動(dòng)相流速均設(shè)定為0.25 mL/min,柱溫為30 ℃。C18和T3色譜柱采用水和甲醇(8∶2, v/v)為流動(dòng)相,水相中加入0.05%(v/v)的甲酸;HILIC柱的流動(dòng)相為水和乙腈(2∶8, v/v)。對(duì)同等濃度的維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液的分析結(jié)果如圖2所示,可以看出,維生素C在HILIC柱上出現(xiàn)嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象,說(shuō)明其不適用于維生素C等酸性化合物的分離測(cè)定;維生素C在C18、T3色譜柱上的保留時(shí)間相當(dāng),但在T3色譜柱上的響應(yīng)明顯高于C18色譜柱。因此,選取T3色譜柱用于維生素C的分析測(cè)定。

圖 2 維生素C在3種色譜柱上的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of vitamin C on three chromatographic columns

圖 3 不同流動(dòng)相條件下維生素C的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of vitamin C with different mobile phasesFA: formic acid; MT: methanol.

2.1.3 流動(dòng)相的選擇

反相色譜的流動(dòng)相通常由水和有機(jī)溶劑(如甲醇、乙腈)等組成,并通過(guò)加入能與流動(dòng)相互溶的修飾劑來(lái)改善化合物的保留和色譜峰峰形,如甲酸銨、甲酸、乙酸銨、乙酸等,尤其是與質(zhì)譜聯(lián)用時(shí),必須使用揮發(fā)性緩沖溶液[22-26]。由于維生素C屬于酸性極性化合物,且性質(zhì)不穩(wěn)定[13],因此,嘗試通過(guò)加入不同體積分?jǐn)?shù)(0.05%、0.1%、0.2%、0.5%)的甲酸作為修飾劑,一方面使其保持穩(wěn)定狀態(tài),另一方面可以抑制維生素C電離,增強(qiáng)保留,并改善峰形[22]。在不同甲醇及甲酸用量條件下分析維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖3。

由圖3可知,同等甲醇用量條件下,水相中加入甲酸增加了維生素C在T3色譜柱上的保留時(shí)間,但甲酸含量的增加對(duì)其在色譜柱上的保留時(shí)間影響不顯著,響應(yīng)值反而逐漸降低,因此選取在水相中加入0.05%(v/v)的甲酸作為修飾劑。同等甲酸含量條件下,流動(dòng)相中甲醇比例由20%降至10%(v/v)時(shí),維生素C在T3色譜柱上的保留時(shí)間相當(dāng),但其在色譜柱上的響應(yīng)值均明顯降低,這可能是由于有機(jī)溶劑的比例降低,導(dǎo)致離子化效率的降低,從而使化合物響應(yīng)降低。因此,最終確定最佳的流動(dòng)相為水和甲醇(8∶2, v/v),其中水相中加入0.05%(v/v)甲酸。

2.1.4 樣品制備方法優(yōu)化

維生素C性質(zhì)不穩(wěn)定,在熱、氧氣及光照等條件下易氧化分解,因此,樣品制備方法也是影響結(jié)果分析準(zhǔn)確度的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為探明制樣方式對(duì)維生素C分析測(cè)定的影響,選取獼猴桃樣品為代表,將其去皮洗凈,快速切碎混勻,3等分,分別稱取20.00 g (±0.05 g)于研缽和勻漿杯中,然后加入20 mL的0.2%(v/v)的甲酸水溶液。采用研磨成漿、組織高速勻漿和干冰保護(hù)下組織高速勻漿3種方式制樣,按照優(yōu)化的樣品前處理方法及分析條件對(duì)維生素C進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明:高速勻漿法制備樣品時(shí),獼猴桃中維生素C的含量高于研磨成漿法的測(cè)定結(jié)果;而干冰保護(hù)下高速勻漿制備樣品時(shí),獼猴桃中維生素C的含量高達(dá)750 mg/kg,與研磨成漿制樣(441 mg/kg)和高速勻漿制樣(682 mg/kg)相比,其測(cè)定結(jié)果分別提高了70.1%和9.97%,且樣品間的平行性更好。這可能是由于高速勻漿條件下樣品的均勻性較好,且高速勻漿制樣僅需20～30 s,避免了人工研磨過(guò)程中樣品長(zhǎng)時(shí)間與空氣接觸造成維生素C的氧化分解;而勻漿過(guò)程加入干冰,則降低了高速勻漿過(guò)程產(chǎn)熱對(duì)維生素C造成的熱分解,進(jìn)一步提高了分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。因此,在維生素C的分析測(cè)定中,采用干冰保護(hù)下組織高速勻漿法制備樣品。

2.2 方法驗(yàn)證

2.2.1 線性關(guān)系和靈敏度

配制維生素C的標(biāo)準(zhǔn)溶液,其質(zhì)量濃度梯度為0.02、0.04、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L。經(jīng)UPLC-Q-TOF/MS分析后,以色譜峰面積(Y)對(duì)分析物質(zhì)量濃度(X, mg/L)進(jìn)行線性擬合,得出回歸方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示,維生素C在0.02～5.0 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,線性方程為Y=19 485X-732.04,線性相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 2。

通過(guò)逐級(jí)稀釋測(cè)定的方法確定本方法維生素C的LOD值為0.008 mg/L(S/N=3), LOQ值為0.02 mg/L(S/N=10)。

2.2.2 添加回收率及精密度

果蔬中維生素C含量較高,難以選取空白基質(zhì)進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。因此,根據(jù)選取的果蔬樣品的本底值設(shè)定適宜的添加水平,以驗(yàn)證該方法的回收率及精密度。

分別稱取2.00 g (±0.05 g)獼猴桃、橙子、西紅柿勻漿液進(jìn)行添加回收試驗(yàn),并根據(jù)樣品中維生素C的本底值來(lái)確定添加水平,其中獼猴桃和橙子的添加水平為100、200、300 mg/kg,西紅柿的添加水平為10、20、30 mg/kg(分別做3個(gè)平行)。在質(zhì)譜分析中,由于樣品基質(zhì)中化合物種類多樣,通常會(huì)對(duì)靶標(biāo)化合物的離子化效率產(chǎn)生影響,即產(chǎn)生基質(zhì)增強(qiáng)或抑制效應(yīng),進(jìn)而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。因此,為提高分析準(zhǔn)確度,目前通常采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)法來(lái)進(jìn)行定量計(jì)算。然而,果蔬中維生素C含量較高,難以獲取空白基質(zhì)溶液。而據(jù)研究報(bào)道[27,28],在綜合考慮儀器的靈敏度和方法檢出限的條件下,通過(guò)樣品稀釋法可以減弱基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果造成的影響,當(dāng)稀釋倍數(shù)達(dá)到100以上時(shí),基質(zhì)效應(yīng)已基本消除。本研究方法中,將樣品基質(zhì)稀釋500倍至線性范圍內(nèi)進(jìn)行分析測(cè)定,可忽略基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果所造成的影響。果蔬中維生素C在不同添加水平下的回收率結(jié)果見表1。獼猴桃中維生素C在不同添加水平下平均回收率在89.3%～113%之間,RSD為0.63%～1.13%,;橙子中維生素C在不同添加水平下平均回收率在90.0%～102%之間,RSD為0.50%～2.90%;西紅柿中維生素C在不同添加水平下平均回收率在103%～112%之間,RSD為2.79%～5.40%,說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合分析要求。

表 1 果蔬中維生素C在不同添加水平下的回收率(n=3)

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

為探明維生素C在樣品提取至完成儀器測(cè)定過(guò)程中的穩(wěn)定性,選取獼猴桃樣品為代表,按照優(yōu)化的樣品前處理和儀器分析條件制備樣品,并配制維生素C的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(質(zhì)量濃度為1 mg/L)。所有樣品放置于棕色進(jìn)樣瓶中避光存放,同等分析條件下,分別于0 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h進(jìn)行分析測(cè)定,根據(jù)維生素C的提取離子色譜峰峰面積來(lái)計(jì)算維生素C在不同時(shí)間段內(nèi)的降解率,具體結(jié)果見圖4?？梢钥闯?1 h內(nèi),標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和獼猴桃樣品中的維生素C均具有較好的穩(wěn)定性,降解率在5%以內(nèi);2 h時(shí),標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中維生素C的降解率為16.5%,獼猴桃樣品中其降解率為16.3%,兩者維生素C的降解率相當(dāng);而4 h時(shí),標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中維生素C的降解率為89.2%,獼猴桃樣品中其降解率為43.2%。因此,為了提高分析的準(zhǔn)確度,用于維生素C定量分析的標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用,并盡量在樣品提取完成、盛裝于進(jìn)樣瓶后1 h內(nèi)完成樣品分析測(cè)定。由此,綜合統(tǒng)計(jì)樣品制備、提取及儀器分析各過(guò)程所需時(shí)間,合理安排實(shí)驗(yàn)操作流程,建議在兩人配合操作的情況下,每批次可完成20個(gè)樣品,總計(jì)所需時(shí)間約為2 h;并可以以20個(gè)樣品為單元重復(fù)操作,在儀器分析時(shí)開始下一組20個(gè)樣品的制備、提取,從而可以同時(shí)保證樣品的分析效率和準(zhǔn)確度,避免在完成大批量樣品制備后再進(jìn)行批量分析所帶來(lái)的準(zhǔn)確度嚴(yán)重降低現(xiàn)象。

圖 4 維生素C在不同時(shí)間段的降解率Fig. 4 Degradation rates of vitamin C under different predetermined time

2.3 實(shí)際樣品測(cè)定

為進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的適用性,將該方法應(yīng)用于實(shí)際樣品分析。從市場(chǎng)上選購(gòu)32批次獼猴桃,其中16批次新西蘭綠果獼猴桃和16批次國(guó)產(chǎn)獼猴桃。在優(yōu)化的條件下對(duì)獼猴桃樣品進(jìn)行分析,結(jié)果如下:國(guó)產(chǎn)獼猴桃維生素C含量范圍為498～1 625 mg/kg;進(jìn)口新西蘭獼猴桃維生素C含量范圍為247～449 mg/kg。國(guó)產(chǎn)獼猴桃維生素C含量明顯高于新西蘭綠果中維生素C含量。Student T-test檢驗(yàn)結(jié)果也顯示國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口獼猴桃中維生素C含量確實(shí)存在顯著性的差異(p=0.000 021)。

同時(shí),將本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)中3種果蔬的維生素C含量進(jìn)行對(duì)比分析(見表2),可以看出,本方法測(cè)定的獼猴桃、橙子、番茄中維生素C的含量與文獻(xiàn)結(jié)果基本吻合。但是,果蔬品種、成熟度﹑貯藏條件等均會(huì)影響果蔬中維生素C的含量,故而維生素C的含量分布也相對(duì)較為分散。

表 2 本方法與文獻(xiàn)中維生素C測(cè)定值的對(duì)比

此外,在測(cè)定方法上,本方法與文獻(xiàn)方法(如氧化還原滴定法、高效液相色譜法、液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法等)相比,優(yōu)勢(shì)在于:前處理萃取效率高,操作過(guò)程簡(jiǎn)單、快速;儀器分析定性準(zhǔn)確、分析時(shí)間短,既避免了分析過(guò)程中維生素C的損失,又提高了樣品分析結(jié)果的準(zhǔn)確度;系統(tǒng)的方法驗(yàn)證工作也證實(shí)了該方法的可靠性和適用性。

3 結(jié)論

本研究采用組織高速勻漿過(guò)程加入干冰的方式制樣,0.1%(v/v)甲酸為提取溶劑,以0.05%(v/v)甲酸-甲醇溶液(8∶2, v/v)為流動(dòng)相等度洗脫,并結(jié)合UPLC-Q-TOF/MS準(zhǔn)確定性、定量的優(yōu)勢(shì),建立了果蔬中維生素C的定量分析方法,方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合分析要求。整個(gè)操作過(guò)程簡(jiǎn)單、快速、儀器分析時(shí)間短,避免了維生素C的損失,準(zhǔn)確度高,適于維生素C含量的定量分析,為維生素C的快速準(zhǔn)確測(cè)定提供新的方法依據(jù)。

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National Natural Science Foundation of China (No. 31501556); Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (No. LQ15B050001); Special Fund for Agro-Scientific Research in the Public Interest (No. 201503107).

Determination of vitamin C in fruits and vegetables by ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry

LIU Zhenzhen1,2, QI Peipei2, WANG Xinquan2, CHEN Wenxue1, WU Liyu2, WANG Qiang1,2*

(1. Food College, Hainan University, Haikou 570228, China; 2. Institute of Quality and Standard of Agro-Products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China)

A method was developed for the determination of vitamin C in fruits and vegetables by ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry. The main factors which affect the sensitivity and stability of vitamin C in the sample preparation and instrument analysis were investigated. Fruit and vegetable samples were prepared by high speed homogenate under the protection of dry CO2, and then extracted by 0.1% (v/v) formic acid solution. The analysis was performed using an Acquity-UPLC T3 column (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm) with the column temperature of 30 ℃. The injection volume was 5 μL. The mobile phase consisted of 0.05% (v/v) formic acid solution and methanol with a volume ratio of 8∶2. The flow rate was set at 0.25 mL/min. The extracted ion [M-H]-(m/z175.023 8) was selected for quantification, while extracted ion [M-C3H4O3]-(m/z87.007 7) was selected for qualification. The mass error was 5×10-6(5 ppm). The results displayed that the linearity of vitamin C ranged from 0.02 to 5.0 mg/L with the correlation coefficient (R2) of 0.999 2. The limit of detection (LOD) and the limit of quantification (LOQ) were 0.008 mg/L (S/N=3) and 0.02 mg/L (S/N=10), respectively. The recoveries of the vitamin C in the spiked samples ranged from 89.3% to 113% with the RSD less than 5.40%. The developed method was then utilized to analyze the real kiwifruit samples. The results showed that the contents of the vitamin C ranged from 498 to 1 625 mg/kg for the domestic kiwifruit samples. Regarding the New Zealand kiwifruit samples, the contents of the vitamin C ranged from 247 to 449 mg/kg. The present method demonstrated the advantages of easy operation, good precision and repeatability, making it feasible for accurate determination of vitamin C in fruits and vegetables.

ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF/MS); vitamin C; fruits and vegetables

10.3724/SP.J.1123.2016.07015

2016-07-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31501556);浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LQ15B050001);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科技專項(xiàng)(201503107).

O658

A

1000-8713(2016)11-1048-07

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(0571)86404355,E-mail:qiangwang_zaas@163.com.