喬中全， 王曉明， 李永欣， 蔡 能， 曾慧杰， 王湘瑩 (湖南省林業(yè)科學(xué)院 林木無(wú)性系育種技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖南 長(zhǎng)沙 410004)

桂花優(yōu)良品種‘珍珠彩桂’遺傳多樣性的ISSR分析及指紋圖譜構(gòu)建

喬中全， 王曉明， 李永欣， 蔡 能， 曾慧杰， 王湘瑩
(湖南省林業(yè)科學(xué)院 林木無(wú)性系育種技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖南 長(zhǎng)沙 410004)

利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)44個(gè)桂花品種進(jìn)行遺傳多樣性研究，從100條引物中篩選出10條引物對(duì)供試材料基因組總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出條帶122條，其中多態(tài)性條帶112條，多態(tài)性比例為91.8%。經(jīng)PopGen32軟件包分析，44個(gè)桂花品種的平均有效等位基因數(shù)為1.592 8，平均Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.341 9，平均Shannon信息指數(shù)為0.506 3，遺傳一致度介于0.475 4～0.926 2之間，說(shuō)明桂花品種間遺傳多樣性較高。UPGMA聚類(lèi)將44個(gè)品種分成7類(lèi)。建立了新品種‘珍珠彩桂’和其它43個(gè)桂花品種的DNA指紋圖譜，可從分子水平將‘珍珠彩桂’與現(xiàn)有其它桂花栽培品種進(jìn)行鑒別。研究結(jié)果為桂花分類(lèi)、品種鑒定、分子育種和子代鑒定提供了重要依據(jù)。

桂花； ISSR； 遺傳多樣性； 指紋圖譜

桂花(Osmanthusfragrans)為木犀科(Oleaceae)木犀屬(Osmanthus)常綠植物，花簇生，香味濃郁，在我國(guó)有2 500余年的栽培歷史，是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，也是優(yōu)良的園林綠化樹(shù)種和香料植物[1]。目前，我國(guó)桂花品種記載的有170多個(gè)[2]。在長(zhǎng)期栽培過(guò)程中，由于自然雜交、人工選擇及其它環(huán)境因素的影響，許多性狀發(fā)生變異，品種資源越來(lái)越豐富[3-4]。長(zhǎng)久以來(lái)，都是以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)對(duì)桂花品種進(jìn)行分類(lèi)，以葉、枝條、花、營(yíng)養(yǎng)器官的特征及花期的早晚等為依據(jù)，將桂花分為4個(gè)品種群：金桂品種群、銀桂品種群、四季桂品種群和丹桂品種群[5-8]。由于研究者對(duì)桂花品種變異和進(jìn)化規(guī)律掌握不夠清楚，導(dǎo)致不同地區(qū)的桂花品種很難進(jìn)行比較，同物異名和同名異物的現(xiàn)象非常嚴(yán)重[4]，制約了桂花良種選育的進(jìn)程。因此，使用現(xiàn)代生物學(xué)—分子標(biāo)記技術(shù)，開(kāi)展桂花品種分子標(biāo)記研究，構(gòu)建桂花品種指紋圖譜，有利于從分子水平進(jìn)行桂花品種鑒別，促進(jìn)桂花新品種選育。國(guó)內(nèi)外有利用同工酶與RAPD分子標(biāo)記進(jìn)行桂花品種分類(lèi)[9-10]的報(bào)道，目前，使用ISSR標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建桂花DNA指紋圖譜進(jìn)行品種鑒定的報(bào)道還很少。ISSR標(biāo)記技術(shù)克服了RAPD和RFLP的限制[11-12]，具有操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高和多態(tài)性水平高等特點(diǎn)，能夠檢測(cè)出豐富的遺傳多樣性。本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)‘珍珠彩桂’等44個(gè)桂花品種進(jìn)行分子標(biāo)記研究，建立‘珍珠彩桂’等桂花品種的DNA指紋圖譜，為‘珍珠彩桂’及其它桂花植物的品種鑒定、種質(zhì)資源的保護(hù)和利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1供試材料

材料為44個(gè)桂花品種(見(jiàn)表1)，均于2014年4月取自常州市開(kāi)心農(nóng)場(chǎng)，將葉片用硅膠干燥后帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2基因組DNA提取

按照北京天根生物有限公司的植物DNA提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit、離心柱型)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行基因組DNA的提取。

1.3引物篩選

實(shí)驗(yàn)所用引物為加拿大哥倫比亞大學(xué)(University of British Columbia Biotechnology，UBC)公布的植物通用ISSR引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成。從100條引物中篩選出擴(kuò)增效果好的10條引物(見(jiàn)表2)。參考Tm值，采用梯度PCR確定不同引物的退火溫度。

1.4ISSR-PCR擴(kuò)增

表1 供試材料Tab 1 MaterialsusedinISSRanalysis品種群品種品種代碼品種群品種品種代碼銀桂無(wú)名銀桂11日香桂29無(wú)名銀桂33紅日香桂30籽銀桂16金桂籽金桂11七月銀桂17曲葉金桂15無(wú)名銀桂2525紅雙喜43白潔27沉香桂32柳葉銀桂33蘇金桂22早銀桂40小葉檀香8丹桂大葉丹桂4大葉檀香13丹桂5柳葉金桂35朱砂桂6無(wú)名金桂37大花丹桂7無(wú)名籽金桂38早龍朱砂桂12老金桂44堰紅桂19小葉金桂24狀元紅2二葉金9軟葉丹桂34其它品種珍珠彩桂21橡皮朱砂桂41反紅黃桂10四季桂天香臺(tái)閣18青山桂26老四季桂23皖白桂31老四季桂28紅花籽蕾36月月桂42無(wú)名桂花2020佛頂珠14無(wú)名桂花3939

表2 ISSR引物名稱(chēng)及序列Tab 2 ThenameandsequenceofISSRprimers引物編號(hào)序列Tm值(℃)退火溫度(℃)UBC810GAGAGAGAGAGAGAGAT5251UBC811GAGAGAGAGAGAGAGAC5050UBC815CTCTCTCTCTCTCTCTG5251UBC834AGAGAGAGAGAGAGAGYT5051UBC835AGAGAGAGAGAGAGAGYC5050UBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYT5252UBC841GAGAGAGAGAGAGAGAYC5254UBC842GAGAGAGAGAGAGAGAYG5253UBC855ACACACACACACACACYT5053UBC856ACACACACACACACACYA5152

反應(yīng)體系20 μL：30 ng模板DNA、0.60 μmol/L引物、1.5U TaqDNA聚合酶、0.20 mmol/L dNTPs、10×PCR buffer(Mg2+free)、2.0 mmol/L MgCl2、無(wú)菌水。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min、 94 ℃ 30 s、50～54 ℃(不同引物不同退火溫度)45 s、72 ℃ 1.5 min、 35個(gè)循環(huán)、72 ℃ 2 min、4 ℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、凝膠成像儀拍照記錄。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次以上。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

統(tǒng)計(jì)清晰度高、重復(fù)性好、分辨率高的條帶計(jì)為1，條帶不清楚或沒(méi)有的計(jì)為0，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。用PopGen32分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1ISSR多態(tài)性

44個(gè)樣本中，10條引物共擴(kuò)增出122條效果好的條帶，其中112條為多態(tài)性條帶，分子量在200～3 000 bp之間(見(jiàn)表3、圖1)，平均每條引物可擴(kuò)增出12.2條帶，11.2條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率(PPB)為91.8%。

表3 ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性Tab 3 Amplificationresultandpolymorphismofinter?simplesequencerepeat(ISSR)primers引物擴(kuò)增總條帶數(shù)多態(tài)性條帶數(shù)多態(tài)性比率(%)UBC810111090 91UBC81112975 00UBC8151212100 00UBC834121191 67UBC8351212100 00UBC84012975 00UBC841121191 67UBC8421212100 00UBC8551212100 00UBC856151493 33總計(jì)12211291 80

圖1 UBC834擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplified result of primer UBC834

2.2桂花品種間遺傳多樣性分析及聚類(lèi)分析

通過(guò)PopGen32軟件對(duì)桂花品種分析，44個(gè)桂花品種的平均觀測(cè)位點(diǎn)數(shù)Na為1.918 0，有效等位位點(diǎn)數(shù)Ne為1.592 8，Nei’s基因多樣性H為0.341 9，Shonnon’s 信息指數(shù)為0.506 3，遺傳一致度介于0.475 4～0.926 2之間。其中，大葉丹桂和朱砂桂遺傳相似系數(shù)最高為0.926 2；天香臺(tái)閣與月月桂的相似性系數(shù)最低為0.475 4。

根據(jù)桂花品種間的遺傳相似系數(shù)，按UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析(見(jiàn)圖2)。從聚類(lèi)圖可以看出，在相似性系數(shù)0.706處可將所有品種分為7個(gè)類(lèi)群。第一類(lèi)主要包括丹桂品種群的狀元紅、大葉丹桂、朱砂桂、丹桂、大花丹桂、早龍朱砂桂、堰紅桂，金桂品種群的大葉檀香、小葉檀香、籽金桂、二葉金，四季桂品種的佛頂珠和天香臺(tái)閣，銀桂品種群的無(wú)名銀桂1和無(wú)名銀桂3，其它桂花品種群中的反紅黃桂；第二類(lèi)包括曲葉金桂、籽銀桂和七月銀桂三個(gè)品種；第三類(lèi)是無(wú)名桂花20，單獨(dú)聚為一類(lèi)；第四類(lèi)包含蘇金桂、無(wú)名銀桂25、四季桂、青山桂、白潔、小葉金桂、老四季桂和日香桂；第五類(lèi)含有紅日金桂、皖白桂、沉香桂、柳葉金桂、柳葉銀桂、軟葉丹桂、無(wú)名籽金桂38、紅花籽蕾、無(wú)名金桂37和無(wú)名桂花39；第六類(lèi)含有珍珠彩桂、橡皮朱砂桂、月月桂和早銀桂；第七類(lèi)為金桂的兩個(gè)品種，紅雙喜和老金桂。

圖2 ISSR分子聚類(lèi)分析Fig.2 Dendrogram of UPGMA cluster based on ISSR Markers

2.3桂花品種鑒定

利用10條ISSR引物對(duì)44個(gè)桂花品種進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，每條引物鑒定桂花品種的數(shù)量在22-44個(gè)之間，存在很大的差異，鑒定數(shù)量最多的是UBC856，共鑒定出44個(gè)桂花品種，鑒定數(shù)量最少的是UBC815、UBC834和UBC855，僅鑒定出22個(gè)桂花品種(見(jiàn)表4)。有5條引物可鑒定出30個(gè)以上桂花品種，分別是UBC810、UBC840、UBC841、UBC842和UBC856，表明篩選出的ISSR引物能很好地進(jìn)行桂花品種鑒定。

表4 ISSR引物對(duì)桂花品種鑒定Tab 4 IdentificationofvarietiesofOsmanthusfragransbasedonISSRprimers引物編號(hào)鑒定數(shù)量鑒定品種編號(hào)UBC810341、3、8、10、11、13、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44UBC811252、5、8、11、12、14、17、18、19、20、23、24、26、27、28、29、30、32、34、36、39、40、41、42、44UBC815221、2、3、6、9、12、14、17、18、19、21、22、25、28、29、32、34、36、38、39、41、42、43UBC834221、2、15、16、17、20、22、23、26、28、29、30、31、33、36、37、38、39、40、42UBC835261、3、7、8、11、12、15、16、17、18、22、23、24、25、27、31、32、33、35、36、37、38、39、40、43、44UBC840301、3、9、10、14、17、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、36、37、38、39、40、41、42、43、44UBC841301、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、22、23、24、25、31、35、36、37、40、41、42、UBC842381、2、3、4、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、27、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、43、44UBC855221、6、10、12、15、20、21、22、23、25、27、28、30、31、32、33、35、36、38、40、43、44UBC856441、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44

2.4桂花品種DNA指紋圖譜構(gòu)建

10條ISSR引物中，UBC856能夠?qū)?4個(gè)品種進(jìn)行很好地鑒定，因此，利用UBC856對(duì)44個(gè)桂花品種進(jìn)行DNA指紋圖譜構(gòu)建。UBC856對(duì)44個(gè)桂花品種均能進(jìn)行很好的擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在300～1700 bp之間，條帶清晰，多態(tài)性條帶豐富。片段長(zhǎng)度小于300 bp或大于1700 bp，擴(kuò)增片段模糊不清，因此不予統(tǒng)計(jì)。根據(jù)擴(kuò)增條帶的有無(wú)，有條帶記為“1”，沒(méi)條帶記為“0”，建立44個(gè)桂花品種的計(jì)算機(jī)化DNA指紋圖譜，如表5所示。

表5 桂花品種的計(jì)算機(jī)化DNA指紋圖譜Tab 5 ThecomputerizedDNAfingerprintofvarietiesofOsmanthusfragrans編號(hào)名稱(chēng)計(jì)算機(jī)化DNA指紋圖譜編號(hào)名稱(chēng)計(jì)算機(jī)化DNA指紋圖譜編號(hào)名稱(chēng)計(jì)算機(jī)化DNA指紋圖譜1無(wú)名銀桂101100110101110013大葉檀香00011111100110125無(wú)名銀桂250000001000111012狀元紅01101110101110014佛頂珠01111110101110026青山桂0000001011011113無(wú)名銀桂300101011101111115曲葉金桂00001111001111027白潔0000001001011014大葉丹桂01101111111110116籽銀桂00000111101110028四季桂0000011110111115丹桂01101111101110117七月銀桂01111011100101029日香桂0100101001011106朱砂桂00111111101110018天香臺(tái)閣11001010101111130紅日香桂0000101000111007大花丹桂01101110101111119堰紅桂00001110101110131皖白桂0000111000011118小葉檀香00001010101110020無(wú)名桂花2000100111010111032沉香桂0100101001011019二葉金00000011101111121珍珠彩桂00000110110111133柳葉銀桂01001110000110110反紅黃桂01011110101110122蘇金桂00000010001111134軟葉丹桂00000110011111111籽金桂00001110101110123老四季桂01000110100111035柳葉金桂00001010010110112早龍朱砂桂01011110101111024小葉金桂01000110100111136紅花籽蕾010000100001110

續(xù)表5 桂花品種的計(jì)算機(jī)化DNA指紋圖譜ContinuedTab 5 ThecomputerizedDNAfingerprintofvarietiesofOsmanthusfragrans編號(hào)名稱(chēng)計(jì)算機(jī)化DNA指紋圖譜37無(wú)名金桂00000110010110138無(wú)名籽金桂01001111010111139無(wú)名桂花3901001110010110140早銀桂01001110000111041橡皮朱砂桂00001010001110142月月桂00000110000111043紅雙喜11000111010111044老金桂110011100101100

3 結(jié)論與討論

采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)44個(gè)桂花品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，得到的多態(tài)性條帶比率(PPB)達(dá)到91.8%，說(shuō)明桂花品種間的變異較大，品種資源較豐富。這與我國(guó)勞動(dòng)人民長(zhǎng)期的栽培和選育密切相關(guān)。聚類(lèi)分析結(jié)果(見(jiàn)圖2)表明，花色較深的金桂品種群和丹桂品種群中的多個(gè)品種往往聚在一起，說(shuō)明這兩個(gè)品種群中某些品種有較近的親緣關(guān)系，這與趙小蘭等[13]同工酶分析、韓遠(yuǎn)記等[14]AFLP聚類(lèi)分析及邱英雄等[15]ISSR聚類(lèi)分析的結(jié)果基本一致?；ㄉ^淺的銀桂品種群和四季桂品種群中的多個(gè)品種聚在一起，說(shuō)明某些花色較淺的品種之間遺傳變異程度較低，存在著較近的親緣關(guān)系。而銀桂中的某些品種與金桂和丹桂類(lèi)品種又有較高的遺傳相似度，表明基于形態(tài)學(xué)的品種分類(lèi)體系與基于ISSR標(biāo)記的品種分類(lèi)體系不一致。本研究中所用的珍珠彩桂為新選育出的桂花新品種，其究竟屬于哪一個(gè)桂花品種群目前一直沒(méi)有確定。從聚類(lèi)結(jié)果看，珍珠彩桂與橡皮朱砂桂、月月桂和早銀桂聚為一類(lèi)，并不能判斷珍珠彩桂屬于哪個(gè)品種群，但在遺傳距離較遠(yuǎn)處珍珠彩桂又與花色較淺的品種聚為一類(lèi)，因此結(jié)合其開(kāi)花特性將其歸為銀桂品種群。由此可見(jiàn)單獨(dú)的ISSR分子標(biāo)記并不能確定其品種群的歸屬。

本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)建立了珍珠彩桂及其它43個(gè)桂花品種的DNA指紋圖譜，可以將桂花品種很好地區(qū)分開(kāi)。本研究所選的10條引物中有5條能單獨(dú)區(qū)分出30個(gè)以上品種，鑒定品種最多的是引物UBC856，可以鑒定出全部44個(gè)品種。構(gòu)建桂花DNA指紋圖譜，有利于桂花品種鑒定和真?zhèn)伪鎰e，有利于桂花新品種培育，子代檢測(cè)、鑒定，同時(shí)還可為桂花雜交育種提供指導(dǎo)，具有重要意義。

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GeneticdiversityandfingerprintconstructionofvarietiesofOsmanthusfragrans‘ZhenzhuCaigui’byISSRmarkers

QIAO Zhongquan， WANG Xiaoming， LI Yongxin， CAI Neng， ZENG Huijie， WANG Xiangying

(Hunan Academy of Forestry，Trees Clones Breeding Technology Key Laboratory of Hunan Province，Changsha 410004，China)

The genetic diversity of 44 varieties ofOsmanthusfragranswas analyzed by inter-simple sequence repeats(ISSR).10 ISSR primers which were selected from 100 ISSR primers were amplified by PCR.A total of 122 bands were amplified，112 of which were polymorphic bands，polymorphic ratio was 91.8%.After PopGen32 package analysis，the average effective number of alleles 44Osmanthusfragranswas 1.592 8，the average Nei’s genetic diversity index was 0.341 9，the average Shannon information index was 0.506 3，genetic identity between 0.475 4～0.926 2.This showed a high genetic diversity amongOsmanthusfragrans.These 44 varieties ofOsmanthusfragranswere divided into seven groups by UPGMA based on the similarity coefficient.The fingerprint of 44 varieties ofOsmanthusfragranswas established.The result could be used as a basis for classification ofOsmanthusfragrans，variety identification，molecular breeding and offspring identify.

Osmanthusfragrans； ISSR； genetic diversity； fingerprint

2016-03-23

長(zhǎng)沙市科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(科051003-22)。

喬中全(1985-)，男，山東曹縣人，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)橹参锓肿佑N。

S 685.13

A

1003 — 5710(2016)03 — 0001 — 05

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2016. 03. 001

(文字編校：張 珉)