曾建剛, 孫化鵬, 阮琴妹, 張 珉, 鐘曉紅
(1.漢壽縣林業(yè)局, 湖南 漢壽 415900; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學, 湖南 長沙 410128; 3.湖南省林業(yè)科學院, 湖南 長沙 410004)
大孔吸附樹脂純化常春藤皂苷C工藝研究
曾建剛1, 孫化鵬2, 阮琴妹2, 張 珉3, 鐘曉紅2
(1.漢壽縣林業(yè)局, 湖南 漢壽 415900; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學, 湖南 長沙 410128; 3.湖南省林業(yè)科學院, 湖南 長沙 410004)
通過靜態(tài)吸附試驗比較7種樹脂對常春藤皂苷C的吸附與解吸,篩選出效果最佳樹脂,通過動態(tài)吸附試驗對最佳樹脂的上樣pH、上樣體積、洗脫液濃度、洗脫體積、洗脫流速進行優(yōu)化。結(jié)果表明:HPD-100樹脂對常春藤皂苷C的吸附與解吸性能最好,HPD-100樹脂對常春藤皂苷C純化的最佳條件為:上樣體積為6 BV,洗脫液乙醇濃度為80%,洗脫體積為7 BV,洗脫流速為1 BV/h。
常春藤皂苷C; 吸附; 洗脫; 大孔吸附樹脂
洋常春藤(Hederahelix)為五加科常春藤屬的多年生常綠攀援藤本植物,全株均可入藥[1]。研究表明其主要功能成分是三萜皂苷類化合物[2],其中常春藤皂苷C在洋常春藤中含量最高,歐洲藥典和英國藥典收錄洋常春藤作為植物藥也是以洋常春藤葉片中常春藤皂苷C含量高于3%為主要含量指標[3]。目前很多歐洲制藥企業(yè)生產(chǎn)的常春藤成藥劑型都是以常春藤皂苷C為含量指標的提取物作為原料,而我國作為植物提取物的主要出口國,生產(chǎn)常春藤皂苷C提取物并進入歐洲市場有著良好的發(fā)展前景。大孔吸附樹脂具有吸附量大、機械強度高、速度快、選擇性好、易解吸附、可再生處理等優(yōu)點,其在中草藥成分的分離純化中越來越普及[4-8]。研究表明,利用大孔吸附樹脂來純化皂苷類化合物可達到較好的效果[9-12]。我們在上述研究的基礎上探討大孔吸附樹脂對常春藤皂苷C的純化工藝,旨在篩選出效果最佳的樹脂,并對最佳樹脂的上樣、洗脫條件進行優(yōu)化,為進一步的實驗研究及常春藤皂苷C標準化提取物的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。
1.1材料
洋常春藤鮮葉于2014年8月采自湖南省長沙市,洗凈后置于鼓風干燥箱中60 ℃烘干至恒質(zhì)量,粉碎后過60目篩,密封保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2儀器與試劑
Shimadzu高效液相色譜儀,包括Shimadzu SPD20A檢測器、Shimadzu SIL20A自動進樣器、Shimadzu LCSolutions工作站;電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏試驗設備有限公司);AL204電子天平(梅特勒-托利多上海有限公司);KQ-5200DB數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);THZ-92B恒溫搖床(上海浦東物理儀器廠);循環(huán)水多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);DR-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。
HPD-750型、D101型、HPD-100型、AB-8型、NKA-9型、ADS-17型、DM-130型樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司),無水乙醇為分析純,乙腈、磷酸為色譜純,蒸餾水(自制)。常春藤皂苷C標準品(≥98%,南京春秋生物工程有限公司)。
2.1HPLC測定常春藤皂苷C含量
2.1.1 HPLC色譜條件 色譜柱:Unitary C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流動相:乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)。二元高壓梯度洗脫:0~35 min,20%~50%A;35~40 min,50%~60%A。檢測波長210 nm,流速1.0 mL/min,進樣量20 μL,柱溫25 ℃。
2.1.2 標準品溶液的制備 精密稱取常春藤皂苷C標準品5.1 mg,甲醇溶解定容至5 mL,配成濃度為1.02 mg/mL的儲備液。
2.1.3 標準曲線的制作 分別將標準品溶液用甲醇稀釋1、2、3、4、5倍,搖勻,按2.1.1項色譜條件進樣檢測。以標準品常春藤皂苷C的濃度(mg/mL)為橫坐標,以色譜峰面積為縱坐標,繪制標準曲線。
2.1.4 常春藤皂苷C含量測定 將樣品溶液按2.1.1項的色譜條件測定峰面積,根據(jù)標準曲線線性方程計算得出常春藤皂苷C的含量,從而計算常春藤皂苷C得率。
2.2樹脂的預處理
選取HPD-750、D101、HPD-100、AB-8、NKA-9、ADS-17、DM-130七種型號的樹脂進行試驗,各樹脂用無水乙醇浸泡24 h,使其充分溶脹后,用蒸餾水反復清洗至流出液無渾濁且無醇味,其次用2%HCl溶液浸泡2 h,用蒸餾水沖洗至中性,再用5%NaOH溶液浸泡2 h,用蒸餾水沖洗至中性,將樹脂儲藏備用。
2.3常春藤皂苷C粗提液的制備
取200 g洋常春藤粉末按照文獻記載[13]的最佳提取工藝條件進行提取,即乙醇濃度69.4%,提取時間43.5 min,料液比35∶1,超聲提取2次,過濾且合并濾液,減壓濃縮至一定體積,得常春藤皂苷提取溶液,密封保存,備用。
2.4不同型號大孔樹脂的篩選
將預處理好的7種大孔樹脂去除表面水分,待干燥后,各精密稱取2 g置于100 mL錐形瓶中,分別加入30 mL已知濃度的常春藤皂苷C提取液,在20 ℃搖床中振蕩吸附24 h,將吸附飽和的樹脂過濾,按照2.1中的HPLC法測定濾液中常春藤皂苷C的含量,并按下面公式計算出樹脂對常春藤皂苷C的吸附率。然后取上述各吸附飽和的樹脂,用30 mL體積分數(shù)為95%乙醇在搖床中解吸24 h,取出并測定解吸液中常春藤皂苷C的含量,分別按下面公式計算各樹脂的解吸率。比較各種型號樹脂對常春藤皂苷C的吸附量和解吸率,篩選解吸最佳樹脂。重復平行3次試驗,取平均值。
吸附量=(C0-C1)V1/W
(1)
吸附率=(C0-C1)/C0×100%
(2)
解吸率=C2V2/(C0-C1)V1×100%
(3)
式中:C0為吸附液初始濃度(mg/mL);C1為吸附后樣液中剩余的濃度(mg/mL);C2為洗脫液的質(zhì)量濃度(mg/mL);V1為吸附液體積(mL);V2為洗脫液體積(mL);W為大孔吸附樹脂質(zhì)量(g)。
2.5pH值對吸附率的影響
精密稱取由靜態(tài)吸附試驗篩選出的最佳樹脂2 g,分別置于100 mL錐形瓶中,加入30 mL已知濃度的常春藤皂苷C提取液,用HCl和NaOH調(diào)節(jié)提取液pH值為2、4、6、8、10、12。在20 ℃搖床中振蕩吸附24 h,使樹脂吸附飽和,將提取液過濾,并分別計算出各pH的常春藤皂苷C吸附率,重復平行3次試驗,取平均值。
2.6泄露曲線確定上樣體積
取預處理好的大孔樹脂進行濕法裝柱,層析柱口徑為1 cm,柱體積為20 mL,用已知濃度的常春藤皂苷提取液以1 BV/h的流速進行上樣,每3 mL收集一管流出液,并檢測流出液中常春藤皂苷C的濃度,以吸附液體積為橫坐標,吸附液中常春藤皂苷C的濃度為縱坐標,繪制泄露曲線,從而確定適合的上樣體積。重復平行3次試驗,取平均值。
2.7乙醇濃度對解吸率的影響
取預處理好的大孔樹脂濕法裝柱,層析柱口徑為1 cm,柱體積為20 mL,取120 mL已知濃度的常春藤皂苷C提取液以1 BV/h的流速進行上樣,上樣完成后用2 BV的蒸餾水初步洗脫,去除水溶性色素、無機鹽及多糖等水溶性雜質(zhì),再用5 BV蒸餾水或濃度為30%、45%、60%、75%、90%的乙醇以1 BV/h的流速進行洗脫,計算洗脫液中常春藤皂苷C的解吸率。用移液管吸取10 mL洗脫液置于已稱質(zhì)量的蒸發(fā)皿中用水浴鍋蒸干,放入105 ℃烘箱中,烘2 h取出,移入干燥器中冷卻至室溫后稱質(zhì)量,再次放入烘箱1 h,直到兩次質(zhì)量之差小于2 mg,通過蒸發(fā)皿質(zhì)量之差可得洗脫液的干物量,由常春藤皂苷C的含量與干物量可計算出洗脫液中常春藤皂苷C的純度。常春藤皂苷C回收率和純度較高的即為最佳洗脫濃度。重復平行3次試驗,取平均值。
2.8洗脫體積對解吸率的影響
取預處理好的HPD-100樹脂進行濕法裝柱,層析柱口徑為1 cm,柱體積為20 mL,用6 BV已知濃度的常春藤皂苷C提取液以1 BV/h的流速上樣,上樣完成后用2 BV的蒸餾水初步洗脫,去除水溶性色素、無機鹽及多糖等水溶性雜質(zhì),再用1 BV、2 BV、3 BV、4 BV、5 BV、6 BV最佳濃度的洗脫液進行洗脫,洗脫流速為1 BV/h,計算洗脫液中常春藤皂苷C的解吸率。重復平行3次試驗,取平均值。
2.9洗脫流速對解吸率的影響
取預處理好的樹脂進行濕法裝柱,層析柱口徑為1 cm,柱體積為20 mL,用6 BV已知濃度的常春藤皂苷C提取液以1 BV/h的流速上樣,上樣完成后用2 BV的蒸餾水初步洗脫,取5 BV濃度為75%的乙醇以1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h的流速進行洗脫,計算洗脫液中常春藤皂苷C的回收率與純度。重復平行3次試驗,取平均值。
2.10洗脫條件的正交試驗
在單因素試驗結(jié)果的基礎上,選取洗脫濃度、洗脫體積、洗脫流速三個影響解吸率及常春藤皂苷C純度的因素,設計L9(34)正交表,通過回收率和純度綜合考察確定最佳洗脫條件,并對最佳洗脫工藝進行驗證試驗。
表1 正交試驗因素水平表Tab 1 Thefactorsandlevelsoforthogonalexperiment水平因素A濃度(%)B體積(BV)C流速(BV/h)160512706238073
3.1常春藤皂苷C的HPLC檢測方法的確定
通過不斷調(diào)整流動相比例,在2.1.1項二元高壓梯度洗脫時,樣品溶液色譜圖基線平穩(wěn),目標組分常春藤皂苷C峰型對稱且與其他物質(zhì)峰分離度好,詳見圖1。
按2.1.3項試驗方法得出常春藤皂苷C標準曲線線性方程為:Y=1.7×106X-7 972.3,R2=0.999 3。該結(jié)果表明,常春藤皂苷C的濃度與峰面積線性關系良好,常春藤皂苷C檢出范圍為0.06~1.02 mg/mL,HPLC測定常春藤皂苷C含量的試驗方法有效可行。
3.2大孔樹脂的篩選
圖1 對照品與樣品的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of the standard and the sample
由于各樹脂的極性、孔徑、比表面積、孔容等理化性質(zhì)的不同,導致樹脂對不同化合物的純化效果也大不相同。評價大孔樹脂的性能要從靜態(tài)吸附率和解吸率兩方面綜合考察,不但要吸附率高,而且解吸率也要高,才能保證有效成分的充分利用及回收[14]。按照2.4項的方法測定七種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附率與解吸率,結(jié)果如表2所示。
表2 7種型號樹脂對常春藤皂苷C的吸附率和解吸率Tab 2 ComparisonofadsorptionanddesorptioncapabilityofseventypesofmacroporousresinonhederacosideC樹脂型號極性吸附率(%)解吸率(%)HPD-750中極性70 197 3D-101非極性17 779 4HPD-100非極性81 996 7AB-8弱極性78 590 8NKA-9極性48 589 5ADS-17中極性9 592 1DM-130弱極性61 587 4
由表2可以看出,七種大孔吸附樹脂對常春藤皂苷C的吸附和解吸有著較大的差異,其中HPD-100及AB-8兩種型號的樹脂對常春藤皂苷C的吸附效果較好,吸附率較高。從理化性質(zhì)上看,除D-101外其它非極性或弱極性樹脂的吸附效果要好于極性或中極性樹脂,說明非極性或弱極性樹脂能更好地吸附常春藤皂苷C。實驗結(jié)果表明,HPD-100型樹脂吸附率最高,與理論相符。同樣,解吸效果也與樹脂理化性質(zhì)相關,一般比表面積較大的樹脂容易被洗脫,由實驗數(shù)據(jù)可知,七種樹脂的解吸率均較高,其中HPD-750和HPD-100都達到了96%以上,但HPD-750吸附率較低,綜合確定HPD-100樹脂為純化常春藤皂苷C的最佳樹脂。
3.3pH值對吸附率的影響
不同pH上樣液對常春藤皂苷C吸附率的影響結(jié)果如圖2所示,可以看出,上樣液的pH值對HPD-100樹脂純化常春藤皂苷C的影響不大,吸附率均在84%左右,經(jīng)統(tǒng)計分析無顯著差異,試驗結(jié)果的微小差距也可能是操作誤差引起的。因此下面試驗均采用上樣液本身的pH條件進行。
圖2 上樣液pH值對吸附率的影響Fig.2 Effects of pH values of sample solution on adsorption
3.4泄露曲線確定上樣體積
通過繪制泄露曲線,可以充分利用和保留目標成分,確定上樣終點,提高生產(chǎn)效率。一般認為,當泄露流出的吸附液濃度達到上樣液濃度的1/10時為泄露點,即上樣終點[15]。通過2.1項的HPLC法檢測出上樣液中常春藤皂苷C的濃度為1.72 mg/mL。HPD-100對常春藤皂苷C的泄露曲線見圖3,當吸附液流出90 mL時,高效液相色譜檢測出常春藤皂苷C開始有泄露,到流出120 mL時,檢測出泄露液中常春藤皂苷C濃度為0.18 mg/mL,濃度為上樣液的十分之一,將其確定為最佳上樣體積。后續(xù)流出的吸附液到150 mL時泄漏量趨于平緩。為了盡可能保留有效成分,最佳上樣體積為120 mL(6 BV)。
圖3 泄露曲線Fig.3 Leakage curve
3.5洗脫液濃度對解吸率的影響
洗脫液濃度對洗脫效果有較大的影響。作為對照,先用水作為洗脫液進行洗脫,結(jié)果發(fā)現(xiàn),解吸率幾乎為零,由此可認為常春藤皂苷C不能用水洗脫。由圖4可知,隨著乙醇濃度的增加,解吸率逐漸升高,乙醇濃度大于60%后,解吸率增長平緩??蛇x擇60%~90%乙醇濃度進行洗脫,洗脫效果較優(yōu)。
為了達到更好的純化效果,除了考察乙醇濃度對解吸率的影響,還應考慮常春藤皂苷C占干物質(zhì)量的純度。洗脫液中常春藤皂苷C含量占上樣液常春藤皂苷C含量的百分比為回收率,能更直觀地體現(xiàn)純化效果。乙醇濃度對常春藤皂苷C回收率及純度的影響見表3,由表3可知,濃度為75%和90%的乙醇對常春藤皂苷C的回收率較高,但90%濃度的乙醇洗脫純度較低,綜合考慮確定洗脫常春藤皂苷C的最佳乙醇濃度為75%。
3.6洗脫體積對解吸率的影響
洗脫劑用量越大,解吸率越高,但為了盡可能地減少試劑用量,節(jié)約成本,必須考察洗脫液體積對解吸率的影響。由圖5可知,隨著洗脫液體積倍數(shù)的增加,解吸率逐漸升高,當洗脫液達到5 BV時,基本洗脫完全,解吸率高達96.8%,趨于平衡。因此,選擇5 BV作為最佳洗脫體積。
圖4 乙醇濃度對解吸率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on desorption rate
表3 不同乙醇濃度對回收率及純度的影響Tab 3 Therecoveryrateandpuritywithdifferentethanolconcentration乙醇濃度(%)回收率(%)干物量(mg)純度(%)3023 511151 94548 823052 26075 740246 37580 542246 99081 654936 5
3.7洗脫流速對解吸率的影響
一般認為,洗脫流速越慢,洗脫越完全,但工業(yè)生產(chǎn)中需要節(jié)約生產(chǎn)時間,提高設備效率,因此需考察洗脫流速對解吸率的影響。由圖6可知,解吸率隨著洗脫流速的增加逐漸降低,1 BV/h和2 BV/h的流速解吸率均較高,在96%以上,洗脫效果較佳。而3 BV/h和4 BV/h洗脫效果稍差,其解吸率在92%以上。
圖5 乙醇用量對解吸率的影響Fig.5 Effects of ethanol volumes on desorption rate
圖6 乙醇流速對解吸率的影響Fig.6 Effects of ethanol flow velocities on desorption rate
同樣為了達到更好的純化效果,除了考察洗脫流速對解吸率的影響,還應考慮常春藤皂苷C占干物質(zhì)量的純度。由表4可知,洗脫流速在1~3 BV/h時,常春藤皂苷C的回收率及純度都較高,純化效果較佳,工業(yè)生產(chǎn)中為了提高效率,可采用3 BV/h的流速進行洗脫。試驗室為了達到最優(yōu)的純化效果,可選用1 BV/h的流速進行洗脫。
表4 不同洗脫流速對回收率及純度的影響Tab 4 Therecoveryrateandpuritywithdifferentelutionvelocity洗脫流速(BV/h)回收率(%)干物量(mg)純度(%)181 830042 7280 729842 4380 029442 6478 831339 4
3.8正交試驗結(jié)果分析
根據(jù)單因素試驗結(jié)果,設計正交試驗。試驗結(jié)果見表5,由表中極差(R)可知,各因素對洗脫效果的影響順序為A>C>B,即乙醇濃度>洗脫流速>洗脫體積。方差分析見表6,結(jié)果表明,乙醇濃度及洗脫流速對常春藤皂苷C的洗脫效果影響顯著,而洗脫液體積對洗脫效果影響不大。另外,正交設計9組試驗的純度值均為45%左右,方差分析無顯著性,因此忽略對純度的影響。根據(jù)直觀分析表及上述結(jié)果分析得出HPD-100樹脂對常春藤皂苷C最佳純化工藝條件為A3B3C1,即乙醇濃度為80%、洗脫體積為7 BV,洗脫流速為1 BV/h。
表5 正交試驗結(jié)果及極差分析Tab 5 Theresultsoforthogonalexperiment試驗號ABC回收率(%)111180 2212276 0313375 6421276 7522375 9623181 9731380 7832183 4933281 8K177 26779 20081 833K278 16778 16778 167K381 96779 76777 400極差(R)4 7001 3344 433 注:Kn=∑提取率n,n為因素的因子。 極差R=maxRn-minRn
表6 正交試驗方差分析表Tab 6 Varianceanalysisoforthogonalexperiment方差來源偏差平方和自由度F值顯著性A乙醇濃度37 340224 453顯著B洗脫體積2 68721 760C洗脫流速33 687222 061顯著誤差1 532
通過對七種不同型號樹脂對常春藤皂苷C的靜態(tài)吸附與解吸性能的比較研究,確定了HPD-100樹脂為純化常春藤皂苷C的最佳樹脂,其吸附率為81.9%,解吸率為96.7%。通過動態(tài)吸附對影響純化效果的pH、上樣體積、洗脫液濃度、洗脫體積、洗脫流速進行深入研究,最終確定HPD-100樹脂對常春藤皂苷C純化的最佳條件:上樣體積為6 BV,洗脫液乙醇濃度為80%,洗脫體積為7 BV,洗脫流速為1 BV/h。
童星[11]系統(tǒng)地比較了硅藻土純化法、溶劑萃取-硅膠柱層析純化法、聚酰胺純化法、大孔吸附樹脂純化法純化常春藤皂苷類化合物的效果,最終確定AB-8型大孔吸附樹脂純化常春藤中皂苷類化合物效果最好。本研究在此基礎上進一步深入研究大孔吸附樹脂對常春藤皂苷的純化效果,并篩選出效果更優(yōu)的HPD-100型樹脂。通過對HPD-100樹脂純化常春藤皂苷C的各影響因素的深入研究,優(yōu)化了常春藤皂苷C的純化工藝,為下一步的實驗研究奠定了良好的基礎,同時也為工業(yè)化生產(chǎn)常春藤皂苷C提供了參考依據(jù)。
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PurifyingprocessofhederacosideCbymacroreticularresin
ZENG Jiangang1, SUN Huapeng2, RUAN Qinmei2, ZHANG Min3, ZHONG Xiaohong2
(1.Forestry Bureau of Hanshou County, Hanshou 415900, China; 2.Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China; 3.Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, China)
The best macroreticular resin was selected by comparing adsorption and elution performance of seven kinds of macroreticular resin through static adsorption experiment.And purifying process parameters such as the pH and volume of sample loading,concentration of washing solution,elution volume,and elution flow rate were optimized through dynamic state absorbance experiment.The results showed that HPD-100 macroreticular resin had the best adsorption and elution performance.The optimum conditions of purification of hederacoside C were sample loading volume on 6 BV,elution volume on 7 BV with 80% ethanol,elution velocity was 1 BV/h.
hederacoside C; adsorption; elution; macroporous resin
2015-11-30
湖南省教育廳科研項目(15A089);湖南省研究生科研創(chuàng)新項目(CX2014B290)。
曾建剛(1988-),男,湖南武岡人,碩士,研究方向為藥用植物開發(fā)與利用。
鐘曉紅,教授,博士生導師;E-mail:xh-zhong@163.com
TQ 464.3
A
1003-5710(2016)01-0053-08
10.3969/j.issn.1003-5710.2016.01.000
(文字編校:張 珉)