張計(jì)育， 黃勝男， 程競卉， 王　剛， 潘德林， 郭忠仁,①

〔1. 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014； 2. 延邊朝鮮族自治州種子管理站， 吉林 延吉 133001〕

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植物激素處理和環(huán)境脅迫對(duì)‘金魁’獼猴桃AdRAVs基因表達(dá)特性的影響

張計(jì)育1， 黃勝男1， 程競卉2， 王剛1， 潘德林1， 郭忠仁1,①

〔1. 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014； 2. 延邊朝鮮族自治州種子管理站， 吉林 延吉 133001〕

以‘金魁’獼猴桃(Actinidiadeliciosa‘Jinkui’)組培苗及2年生扦插苗為實(shí)驗(yàn)材料，采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)0.1 mmol·L-1水楊酸(SA)、0.05 mmol·L-1茉莉酸甲酯(MeJA)、0.01 mmol·L-11-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)和0.01 mmol·L-1脫落酸(ABA)4種植物激素處理后0、 4、 12和48 h，低溫(4 ℃)和0.2 mol·L-1NaCl脅迫0、4、12 和48 h，高溫(48 ℃)脅迫0、2和4 h及恢復(fù)培養(yǎng)6 h，以及干旱脅迫14 d后葉片中AdRAV1、AdRAV2和AdRAV3基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示：不同處理?xiàng)l件下3個(gè)AdRAVs基因相對(duì)表達(dá)量的變化存在一定差異。SA、MeJA和ACC處理后4和12 h，AdRAV1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著(P<0.05)升高，但ABA處理后該基因的相對(duì)表達(dá)量無明顯變化；SA、MeJA、ACC和ABA處理后48 h，AdRAV2基因的相對(duì)表達(dá)量顯著降低；4種植物激素處理后4、12和48 h，AdRAV3基因的相對(duì)表達(dá)量總體上顯著降低。低溫脅迫下，AdRAV1和AdRAV2基因的相對(duì)表達(dá)量無明顯變化，但脅迫48 h時(shí)AdRAV3基因的相對(duì)表達(dá)量卻顯著升高。NaCl脅迫12 h時(shí)，AdRAV1和AdRAV2基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高， 而AdRAV3基因的相對(duì)表達(dá)量則顯著降低。 高溫脅迫4 h時(shí)，AdRAV1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，AdRAV2基因的相對(duì)表達(dá)量顯著升高；脅迫2 h時(shí)，AdRAV3基因的相對(duì)表達(dá)量顯著降低；恢復(fù)培養(yǎng)6 h時(shí)，3個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量均無法恢復(fù)至起始水平。干旱脅迫14 d后，AdRAV1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照(正常澆水)；AdRAV2的相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照，而AdRAV3基因的相對(duì)表達(dá)量則低于對(duì)照，且均與對(duì)照無顯著差異。研究結(jié)果表明：不同脅迫條件對(duì)‘金魁’獼猴桃AdRAVs基因的表達(dá)特性有不同誘導(dǎo)效應(yīng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)AdRAV1、AdRAV2和AdRAV3基因可能參與SA、MeJA、ACC和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及耐鹽和耐高溫過程;并且，AdRAV1基因還可能參與耐旱過程，而AdRAV3基因則可能參與耐寒過程。

‘金魁’獼猴桃；AdRAVs基因； 植物激素； 環(huán)境脅迫； 相對(duì)表達(dá)量； qRT-PCR技術(shù)

AP2/ERF是植物體內(nèi)一個(gè)龐大的轉(zhuǎn)錄因子基因家族，存在于所有植物中，因具有由60～70個(gè)氨基酸組成的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域而得名。AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子能夠參與植物的生長，花、果實(shí)和種子的發(fā)育以及果實(shí)香味形成等生長發(fā)育過程，并能夠參與植物對(duì)病菌的防御過程以及對(duì)損傷、高鹽和干旱等非生物脅迫的響應(yīng)[1-2]。AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子不但在水楊酸、茉莉酸、乙烯和脫落酸等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起作用，而且是逆境信號(hào)交叉途徑的連接因子[1]。根據(jù)序列相似性和AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，AP2/ERF基因家族可分成AP2、ERF和RAV 3類[3]，其中，RAV類基因編碼的蛋白質(zhì)均含有AP2/ERF和B3結(jié)構(gòu)域各1個(gè)，且多數(shù)植物含有2個(gè)以上的RAV類基因[4-7]。研究發(fā)現(xiàn)，RAV類基因在植物的乙烯響應(yīng)[8]、油菜素內(nèi)酯響應(yīng)[9]、生物和非生物脅迫響應(yīng)[10]過程中發(fā)揮重要作用。但關(guān)于木本植物中RAV類基因功能及作用的研究報(bào)道甚少。

‘金魁’獼猴桃(Actinidiadeliciosa‘Jinkui’)為美味獼猴桃〔Actinidiadeliciosa(A. Chev.) C. F. Liang et A. R. Ferguson〕的主要栽培品種，具有果實(shí)品質(zhì)極佳、耐貯運(yùn)、抗逆性強(qiáng)、豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、貨架期長等優(yōu)點(diǎn)，深受果農(nóng)和消費(fèi)者的喜愛。目前，江蘇省中國科學(xué)院植物研究所已經(jīng)完成水澇脅迫下‘金魁’獼猴桃轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序工作(登錄號(hào)SRR2048539)[11]，共獲得91個(gè)AP2轉(zhuǎn)錄因子。在受到水澇脅迫時(shí)，其中的14個(gè)AP2轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)表達(dá)，另有14個(gè)AP2轉(zhuǎn)錄因子下調(diào)表達(dá)；在上述28個(gè)AP2轉(zhuǎn)錄因子中有3個(gè)RAV類基因，其中AdRAV1(comp100639_c0_seq2)和AdRAV2(comp100786_c0_seq3)為上調(diào)表達(dá)基因，AdRAV3(comp104656_c0_seq4)為下調(diào)表達(dá)基因[11]。然而，關(guān)于這3個(gè)RAV類基因的功能特性并不十分清楚。

鑒于此，作者以‘金魁’獼猴桃組培苗和2年生扦插苗為試材，利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)0.1 mmol·L-1水楊酸(SA)、0.05 mmol·L-1茉莉酸甲酯(MeJA)、0.01 mmol·L-11-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)和0.01 mmol·L-1脫落酸(ABA)4種植物激素處理后0、4、12 和48 h，4 ℃低溫和0.2 mol·L-1NaCl脅迫0、4、12 和48 h，48 ℃高溫脅迫0、2和4 h及恢復(fù)培養(yǎng)6 h，以及干旱脅迫14 h后‘金魁’獼猴桃葉片中AdRAV1、AdRAV2和AdRAV3基因相對(duì)表達(dá)量的變化進(jìn)行分析和比較，以期為獼猴桃抗逆基因的篩選及其抗逆分子機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

供試材料為江蘇省中國科學(xué)院植物研究所經(jīng)濟(jì)植物研究中心保存的‘金魁’獼猴桃組培苗和2年生扦插苗；其中，組培苗用于植物激素處理以及低溫和高溫脅迫實(shí)驗(yàn)，扦插苗用于NaCl和干旱脅迫實(shí)驗(yàn)，SA、MeJA、ACC、ABA、低溫、NaCl和高溫脅迫實(shí)驗(yàn)每處理16株苗，干旱脅迫實(shí)驗(yàn)每處理8株苗，均重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)前組培苗需在生根培養(yǎng)基(含0.6 mg·mL-1NAA的1/2MS培養(yǎng)基)中培養(yǎng)1個(gè)月，培養(yǎng)條件為溫度約25 ℃、空氣相對(duì)濕度40%、光照時(shí)間16 h·d-1、光照度2 000 lx；扦插苗種植于塑料營養(yǎng)盆(上口徑13 cm、 高度20 cm)中， 培養(yǎng)基質(zhì)為V(泥炭土)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=7∶2∶1的混合基質(zhì)，置于溫度約25 ℃、空氣相對(duì)濕度60%、光照時(shí)間16 h·d-1、光照度2 000 lx的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)用SA、MeJA、ACC和ABA均購自美國Sigma公司，DNA消化酶(Code No.D2215)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Code No.RR047Q)、熒光定量試劑SYBR?Premix Ex TaqTM(Code No.DRR041A)等購自寶生物工程(大連)有限公司。ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1處理方法激素處理方法：參考張計(jì)育等[12]的方法進(jìn)行植物激素處理。將0.1 mmol·L-1SA、 0.05 mmol·L-1MeJA、 0.01 mmol·L-1ACC和0.01 mmol·L-1ABA分別噴灑在組培苗葉片的表面，每株組培苗噴灑處理溶液約15 mL，使葉片表面濕潤；在噴灑0(CK)、4、12 和48 h后，每個(gè)處理組隨機(jī)選擇4株組培苗，采集所有葉片，迅速放入液氮中冷凍并置于-70 ℃冰箱中保存、備用。

低溫處理方法：選取已生根的組培苗，置于4 ℃低溫條件下進(jìn)行脅迫處理； 在處理0(CK)、 4、 12 和48 h后，分別隨機(jī)選擇4株組培苗，采集所有葉片，迅速放入液氮中冷凍并置于-70 ℃冰箱中保存、備用。

NaCl處理方法：將0.2 mol·L-1NaCl溶液直接澆灌在扦插苗的根部， 每株扦插苗澆灌約300 mL；在澆灌0(CK)、4、12 和48 h后，分別隨機(jī)選擇4株扦插苗，采集植株頂部嫩葉，迅速放入液氮中冷凍并置于-70 ℃冰箱中保存、備用。

高溫處理方法：選取已生根的組培苗，置于48 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行脅迫處理；在處理0(CK)、2和4 h后，分別隨機(jī)選擇4株組培苗，采集所有葉片，迅速于液氮中冷凍并置于-70 ℃冰箱中保存、備用。并且，在處理4 h后將組培苗置于23 ℃條件下進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，在恢復(fù)培養(yǎng)6 h后隨機(jī)選擇4株組培苗，采集所有葉片，迅速放入液氮中冷凍并置于-70 ℃冰箱中保存、備用。

干旱處理方法：對(duì)扦插苗停止?jié)菜⒛M土壤干旱脅迫，以正常澆水的扦插苗為對(duì)照，處理14 d后分別在對(duì)照及干旱處理組中隨機(jī)選擇4株扦插苗，采集植株頂部嫩葉，迅速放入液氮中冷凍并置于-70 ℃冰箱中保存、備用。

1.2.2qRT-PCR檢測(cè)方法參考張計(jì)育等[13]的方法提取葉片的總RNA，根據(jù)DNA消化酶使用說明書對(duì)總RNA中的DNA進(jìn)行消化；取消化后的總RNA 1 μg，參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書進(jìn)行cDNA合成；將合成的cDNA稀釋10倍后置于-20 ℃冰箱中保存、備用。

根據(jù)3個(gè)目的基因片段序列分別設(shè)計(jì)引物，其中，AdRAV1基因的引物為RAV1F(5′-GCTTTTCCCGTTCAGGTCCAG-3′)和RAV1R(5′-ACACCCAAATCCCAACATCTCC-3′)；AdRAV2基因的引物為RAV2F(5′-TCGGCGGGAAGAAACAATGC-3′)和RAV2R(5′-GGTATCACCAGCCTGTTCAGC-3′)；AdRAV3基因的引物為RAV3F(5′-TTTGAAGGCGGGCGATGTC-3′)和RAV3R(5′-ACTACTATCAACACCACCACTCAC-3′)。以AdActin[14]為內(nèi)參基因，引物為AdActinF(5′-TGCATGAGCGATCAAGTTTCAAG-3′)和AdActinR(5′-TGTCCCATGTCTGGTTGATGACT-3′)。用ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體操作參照張計(jì)育等[15]的方法。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用7300 System 軟件和2-ΔΔCT法[16]進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析。

2　結(jié)果和分析

2.1經(jīng)植物激素處理后‘金魁’獼猴桃3個(gè)AdRAVs基因的表達(dá)特性分析

2.1.1AdRAV1基因的表達(dá)特性經(jīng)不同植物激素處理后，‘金魁’獼猴桃組培苗AdRAV1基因的相對(duì)表達(dá)量見圖1。

由圖1可以看出：經(jīng)0.1 mmol·L-1SA(圖1-A)、0.05 mmol·L-1MeJA(圖1-B)、0.01 mmol·L-1ACC(圖1-C)和 0.01 mmol·L-1ABA (圖1-D)處理后，‘金魁’獼猴桃AdRAV1基因的相對(duì)表達(dá)量均隨時(shí)間推移呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)。經(jīng)SA、MeJA和ACC處理后，該基因的相對(duì)表達(dá)量在處理后4 h最高且顯著(P<0.05)高于處理后0 h，在處理后12 h也顯著高于處理后0 h；經(jīng)ABA處理后，該基因的相對(duì)表達(dá)量在處理后4和12 h相近且均高于處理后0 h，但差異不顯著。

*： 表示與處理后0 h差異顯著(P<0.05) Representing the significant difference with 0 h after treatment (P<0.05). A： 0.1 mmol·L-1 SA； B： 0.05 mmol·L-1 MeJA； C： 0.01 mmol·L-1 ACC； D： 0.01 mmol·L-1 ABA.圖1　水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)和脫落酸(ABA)處理后 ‘金魁’獼猴桃組培苗AdRAV1基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig. 1　Change in relative expression of AdRAV1 gene from tissue culture seedling of Actinidia deliciosa ‘Jinkui’ after treated by salicylic acid (SA), methyl jasmonate (MeJA), 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) and abscisic acid (ABA)

2.1.2AdRAV2基因的表達(dá)特性經(jīng)不同植物激素處理后，‘金魁’獼猴桃組培苗AdRAV2基因的相對(duì)表達(dá)量見圖2。

由圖2可以看出：經(jīng)0.1 mmol·L-1SA(圖2-A)、0.05 mmol·L-1MeJA(圖2-B)和0.01 mmol·L-1ACC(圖2-C)處理后，‘金魁’獼猴桃AdRAV2基因的相對(duì)表達(dá)量均隨著時(shí)間推移呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)；其中，經(jīng)SA和MeJA處理后，該基因的相對(duì)表達(dá)量在處理后12 h最高但僅略高于處理后0 h，在處理后48 h最低且顯著(P<0.05)低于處理后0 h；經(jīng)ACC處理后，該基因的相對(duì)表達(dá)量在處理后4 h最高但僅略高于處理后0 h，在處理后48 h最低且顯著低于處理后0 h。經(jīng)0.01 mmol·L-1ABA處理后，‘金魁’獼猴桃AdRAV2基因的相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間推移呈波動(dòng)但總體降低的變化趨勢(shì)，并在處理后4和48 h顯著低于處理后0 h(圖2-D)。

*： 表示與處理后0 h差異顯著(P<0.05) Representing the significant difference with 0 h after treatment (P<0.05). A： 0.1 mmol·L-1 SA； B： 0.05 mmol·L-1 MeJA； C： 0.01 mmol·L-1 ACC； D： 0.01 mmol·L-1 ABA.圖2　水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)和脫落酸(ABA)處理后 ‘金魁’獼猴桃組培苗AdRAV2基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig. 2　Change in relative expression of AdRAV2 gene from tissue culture seedling of Actinidia deliciosa ‘Jinkui’ after treated by salicylic acid (SA), methyl jasmonate (MeJA), 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) and abscisic acid (ABA)

2.1.3AdRAV3基因的表達(dá)特性經(jīng)不同植物激素處理后，‘金魁’獼猴桃組培苗AdRAV3基因的相對(duì)表達(dá)量見圖3。

由圖3可以看出： 經(jīng)0.1 mmol·L-1SA(圖3-A)和0.05 mmol·L-1MeJA(圖3-B)處理后，‘金魁’獼猴桃AdRAV3基因的相對(duì)表達(dá)量均隨時(shí)間推移呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢(shì)，且均在處理后12 h降至最低；并在處理后4、 12和48 h顯著 (P<0.05)低于處理后0 h。經(jīng)0.01 mmol·L-1ACC(圖3-C)和0.01 mmol·L-1ABA(圖3-D)處理后，‘金魁’獼猴桃AdRAV3基因的相對(duì)表達(dá)量均隨時(shí)間推移呈現(xiàn)逐漸下降的變化趨勢(shì)；其中，ACC處理后4、12和48 h以及ABA處理后12和48 h該基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于處理后0 h。

總體上看，在‘金魁’獼猴桃的3個(gè)AdRAVs基因中，經(jīng)不同植物激素處理后AdRAV1基因的相對(duì)表達(dá)量最高，AdRAV2基因的相對(duì)表達(dá)量次之，而AdRAV3基因的相對(duì)表達(dá)量最低。

*： 表示與處理后0 h差異顯著(P<0.05) Representing the significant difference with 0 h after treatment (P<0.05). A： 0.1 mmol·L-1 SA； B： 0.05 mmol·L-1 MeJA； C： 0.01 mmol·L-1 ACC； D： 0.01 mmol·L-1 ABA.圖3　水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)和脫落酸(ABA)處理后 ‘金魁’獼猴桃組培苗AdRAV3基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig. 3　Change in relative expression of AdRAV3 gene from tissue culture seedling of Actinidia deliciosa ‘Jinkui’ after treated by salicylic acid (SA), methyl jasmonate (MeJA), 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) and abscisic acid (ABA)

2.2環(huán)境脅迫條件下‘金魁’獼猴桃3個(gè)AdRAVs基因的表達(dá)特性分析

2.2.1低溫脅迫條件下3個(gè)AdRAVs基因的表達(dá)特性在4 ℃低溫脅迫條件下‘金魁’獼猴桃組培苗3個(gè)AdRAVs基因的相對(duì)表達(dá)量見圖4。

結(jié)果顯示：在低溫脅迫條件下，AdRAV1基因的相對(duì)表達(dá)量在脅迫4、12和48 h時(shí)變化較小但均略高于脅迫0 h(圖4-A)；AdRAV2基因的相對(duì)表達(dá)量在脅迫4、12和48 h時(shí)變化較小且均與脅迫0 h時(shí)無顯著差異(圖4-B)；AdRAV3基因的相對(duì)表達(dá)量隨脅迫時(shí)間延長呈現(xiàn)逐漸升高的變化趨勢(shì)(圖4-C)，并在脅迫48 h時(shí)達(dá)到最高且顯著高于脅迫0 h。

*： 表示與處理0 h差異顯著(P<0.05) Representing the significant difference with treating for 0 h (P<0.05).

A:AdRAV1; B:AdRAV2; C:AdRAV3.

圖4低溫(4 ℃)脅迫條件下‘金魁’獼猴桃組培苗3個(gè)AdRAVs基因相對(duì)表達(dá)量的變化

Fig. 4Change in relative expression of threeAdRAVsgenes from tissue culture seedling ofActinidiadeliciosa‘Jinkui’ under condition of low temperature (4 ℃) stress

總體上看，低溫脅迫處理0～12 h時(shí)，3個(gè)AdRAVs基因的相對(duì)表達(dá)量無明顯差異，但在低溫脅迫48 h時(shí)，AdRAV3基因的相對(duì)表達(dá)量明顯高于AdRAV1和AdRAV2基因。

2.2.2NaCl脅迫條件下3個(gè)AdRAVs基因的表達(dá)特性在0.2 mol·L-1NaCl脅迫條件下‘金魁’獼猴桃扦插苗3個(gè)AdRAVs基因的相對(duì)表達(dá)量見圖5。

結(jié)果顯示：在0.2 mol·L-1NaCl脅迫條件下，AdRAV1和AdRAV2基因的相對(duì)表達(dá)量隨脅迫時(shí)間延長呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)(圖5-A，B)，并在脅迫12 h時(shí)達(dá)到最高值且與脅迫0 h時(shí)差異顯著；AdRAV3基因的相對(duì)表達(dá)量隨脅迫時(shí)間延長呈現(xiàn)逐漸下降的變化趨勢(shì)(圖5-C)，且在脅迫4、12和48 h時(shí)與脅迫0 h時(shí)差異顯著。

總體上看，NaCl脅迫12 h時(shí)，AdRAV1和AdRAV2基因的相對(duì)表達(dá)量明顯提高，且明顯高于AdRAV3基因的相對(duì)表達(dá)量；在整個(gè)脅迫過程中，AdRAV3基因的相對(duì)表達(dá)量低于AdRAV1和AdRAV2基因，而后二者相對(duì)表達(dá)量的差異較小。

*： 表示與處理0 h差異顯著(P<0.05) Representing the significant difference with treating for 0 h (P<0.05). A: AdRAV1; B: AdRAV2; C: AdRAV3.圖5　NaCl(0.2 mol·L-1)脅迫條件下‘金魁’獼猴桃扦插苗3個(gè)AdRAVs基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig. 5　Change in relative expression of three AdRAVs genes from cutting seedling of Actinidia deliciosa ‘Jinkui’ under condition of NaCl (0.2 mol·L-1) stress

2.2.3高溫脅迫條件下3個(gè)AdRAVs基因的表達(dá)特性在48 ℃高溫脅迫條件下‘金魁’獼猴桃組培苗3個(gè)AdRAVs基因的相對(duì)表達(dá)量見圖6。

結(jié)果顯示：在高溫脅迫條件下，AdRAV1基因的相對(duì)表達(dá)量在脅迫2 h時(shí)略高于脅迫0 h(圖6-A)，在脅迫4 h時(shí)顯著降低，在恢復(fù)培養(yǎng)6 h時(shí)雖明顯升高但仍低于脅迫0 h；AdRAV2基因的相對(duì)表達(dá)量隨脅迫時(shí)間延長呈現(xiàn)逐漸升高的變化趨勢(shì)，在脅迫4 h時(shí)達(dá)到最高且顯著高于脅迫0 h，在恢復(fù)培養(yǎng)6 h時(shí)雖明顯下降但仍高于脅迫0 h(圖6-B)；AdRAV3基因的相對(duì)

t1: 脅迫4 h后于23 ℃條件下恢復(fù)培養(yǎng)6 h Recovery culturing for 6 h under 23 ℃ condition after stressed for 4 h; *： 表示與處理0 h差異顯著 (P<0.05) Representing the significant difference with treating for 0 h (P<0.05).

A:AdRAV1; B:AdRAV2; C:AdRAV3.

圖6高溫(48 ℃)脅迫條件下‘金魁’獼猴桃組培苗3個(gè)AdRAVs基因相對(duì)表達(dá)量的變化

Fig. 6Change in relative expression of threeAdRAVsgenes from tissue culture seedling ofActinidiadeliciosa‘Jinkui’ under

condition of high temperature (48 ℃) stress

表達(dá)量在脅迫2 h時(shí)顯著低于脅迫0 h，在脅迫4 h時(shí)雖明顯升高但僅略高于脅迫0 h，在恢復(fù)培養(yǎng)6 h時(shí)明顯下降且略低于脅迫0 h(圖6-C)。

總體上看，在實(shí)驗(yàn)過程中，AdRAV2基因的相對(duì)表達(dá)量相對(duì)較高，特別是在脅迫4 h和恢復(fù)培養(yǎng)6 h時(shí)，其相對(duì)表達(dá)量明顯高于AdRAV1和AdRAV3基因。

2.2.4經(jīng)干旱脅迫處理后3個(gè)AdRAVs基因的表達(dá)特性經(jīng)干旱脅迫處理14 d后，‘金魁’獼猴桃扦插苗3個(gè)AdRAVs基因的相對(duì)表達(dá)量見圖7。

結(jié)果顯示：經(jīng)干旱脅迫14 d后，AdRAV1和AdRAV2基因的相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照(正常澆水)(圖7-A，B)，其中，AdRAV1基因的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照差異顯著；AdRAV2基因的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照差異不顯著；AdRAV3基因的相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照，但無顯著差異(圖7-C)。

總體上看，對(duì)照條件下3個(gè)AdRAVs基因的相對(duì)表達(dá)量基本處于同一水平； 但經(jīng)干旱脅迫14 d后， 3個(gè)AdRAVs基因中，AdRAV2基因的相對(duì)表達(dá)量顯著提高，而AdRAV3基因的相對(duì)表達(dá)量則有所降低。

CK: 對(duì)照(正常澆水) The control (normal watering); DS: 干旱脅迫 Drought stress. *： 表示與對(duì)照差異顯著(P<0.05) Representing the significant difference with the control (P<0.05).

A:AdRAV1; B:AdRAV2; C:AdRAV3.

圖7干旱脅迫14 d 后‘金魁’獼猴桃扦插苗3個(gè)AdRAVs基因相對(duì)表達(dá)量的變化

Fig. 7Change in relative expression of threeAdRAVsgenes from cutting seedling ofActinidiadeliciosa‘Jinkui’ after drought stressed for 14 d

3　討論和結(jié)論

相關(guān)研究結(jié)果表明：植物激素和環(huán)境因子脅迫均能夠誘導(dǎo)植物RAV基因的表達(dá)。Sohn等[10]和Kim等[17]認(rèn)為，SA、乙烯和NaCl脅迫均能夠顯著誘導(dǎo)辣椒品種‘Bukang’(Capsicumannuum‘Bukang’)中CaRAV1基因的表達(dá)，而ABA、甘露醇和冷害脅迫則對(duì)該基因的表達(dá)無明顯影響；SA、MeJA、乙烯和ABA處理以及NaCl脅迫、冷害和傷害均能夠顯著誘導(dǎo)辣椒品種‘Nockwang’(C.annuum‘Nockwang’)中CaRAV1基因的表達(dá)。Zhuang等[18]認(rèn)為，受低溫、NaCl和聚乙二醇(PEG)脅迫后油菜品種‘HuYou 15’(Brassicanapus‘HuYou 15’)的BnaRAV-1-HY15基因均可表達(dá)，但該基因表達(dá)不受ABA誘導(dǎo)。吳致君等[19]的研究結(jié)果表明：高溫、低溫和NaCl脅迫均能夠誘導(dǎo)茶樹品種‘安吉白茶’(Camelliasinensis‘Anjibaica’)和‘迎霜’(C.sinensis‘Yingshuang’)中CsRAV2基因的表達(dá)，PEG脅迫則對(duì)該基因的表達(dá)無明顯影響。綜上所述，不同植物種類或不同作物品種以及不同基因家族成員在植物激素和環(huán)境脅迫條件下的表達(dá)模式各異。

本研究中，0.1 mmol·L-1SA、0.05 mmol·L-1MeJA、0.01 mmol·L-1ACC和0.01 mmol·L-1ABA處理后4和12 h‘金魁’獼猴桃組培苗AdRAV1基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著提高，但經(jīng)0.01 mmol·L-1ABA處理后該基因的相對(duì)表達(dá)量則未能顯著提高；而這4種植物激素處理后48 h‘金魁’獼猴桃AdRAV2和AdRAV3基因的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，處理后4和12 hAdRAV3基因的相對(duì)表達(dá)量也顯著降低。4 ℃低溫脅迫能夠誘導(dǎo)AdRAV1基因的表達(dá)但誘導(dǎo)效果不顯著，脅迫48 h能顯著誘導(dǎo)AdRAV3基因的表達(dá)， 但4 ℃低溫脅迫對(duì)AdRAV2基因的表達(dá)無明顯影響。0.2 mol·L-1NaCl脅迫12 h能顯著誘導(dǎo)AdRAV1和AdRAV2基因的表達(dá)，并顯著抑制AdRAV3基因的表達(dá)。48 ℃高溫脅迫2 h能顯著抑制AdRAV3基因的表達(dá)，而脅迫4 h能顯著誘導(dǎo)AdRAV2基因的表達(dá)并顯著抑制AdRAV1基因的表達(dá)。干旱脅迫14 d能誘導(dǎo)AdRAV1和AdRAV2基因的表達(dá)，并且對(duì)AdRAV1基因的表達(dá)有顯著影響，但對(duì)AdRAV3基因的表達(dá)有一定抑制效應(yīng)。因此，在不同植物激素處理及環(huán)境脅迫條件下‘金魁’獼猴桃AdRAVs基因的表達(dá)模式各異，它們的基因功能也存在差異。

依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)‘金魁’獼猴桃的AdRAV1、AdRAV2和AdRAV3基因可能參與SA、MeJA、ACC和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；并且，AdRAV1基因還可能參與植株抵抗鹽害、高溫和干旱脅迫的過程，AdRAV2基因還可能參與植株抵抗鹽害和高溫脅迫的過程，AdRAV3基因還可能參與植株抵抗冷害、鹽害和高溫脅迫的過程。然而，關(guān)于‘金魁’獼猴桃這3個(gè)AdRAVs基因的功能則需要通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)或基因敲除技術(shù)等進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。

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(責(zé)任編輯： 佟金鳳)

Effects of phytohormone treatment and environmental stress on expression characteristics ofAdRAVsgene fromActinidiadeliciosa‘Jinkui’

ZHANG Jiyu1, HUANG Shengnan1, CHENG Jinghui2, WANG Gang1, PAN Delin1, GUO Zhongren1,①

(1. Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210014, China; 2. Seed Management Department of Yanbian KoreanAutonomous Prefecture, Yanji 133001, China),J.PlantResour. &Environ., 2016, 25(3): 28-35

Taking tissue culture seedling and two-year-old cutting seedling ofActinidiadeliciosa‘Jinkui’ as experimental materials, relative expression ofAdRAV1,AdRAV2 andAdRAV3 genes in leaf after 0, 4, 12and48 htreatedbyfourphytohormonesincluding0.1mmol·L-1salicylicacid(SA),0.05mmol·L-1methyl jasmonate (MeJA), 0.01 mmol·L-11-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) and 0.01 mmol·L-1abscisic acid (ABA), stressed by low temperature (4 ℃) and 0.2 mol·L-1NaCl for 0, 4, 12 and 48 h, stressed by high temperature (48 ℃) for 0, 2 and 4 h and recovery culturing for 6 h, and stressed by drought for 14 d were determined by qRT-PCR technique. The results show that there are some differences in change of relative expression of threeAdRAVsgenes under different treatment conditions. After 4 and 12 h treated by SA, MeJA and ACC, relative expression ofAdRAV1 gene increases significantly (P<0.05), but it does not change obviously after treated by ABA. After 48 h treated by SA, MeJA, ACC and ABA, relative expression ofAdRAV2 gene decreases significantly. After 4, 12 and 48 h treated by four phytohormones, relative expression ofAdRAV3 gene decreases significantly as a whole. Under low temperature stress, relative expression ofAdRAV1 andAdRAV2 genes has no obvious change, but that ofAdRAV3 gene increases significantly when stressing for 48 h. When NaCl stressing for 12 h, relative expression ofAdRAV1 andAdRAV2 genes increases significantly, while that ofAdRAV3 gene decreases significantly. When high temperature stressing for 4 h, relative expression ofAdRAV1 gene decreases significantly, that ofAdRAV2 gene increases significantly; when stressing for 2 h, that ofAdRAV3 gene decreases significantly; when recovery culturing for 6 h, that of three genes all cannot return to the starting level. After drought stressed for 14 d, relative expression ofAdRAV1 gene is significantly higher than that of the control (normal watering); relative expression ofAdRAV2 gene is higher than that of the control, while relative expression ofAdRAV3 gene is lower than that of the control, both of them have no significant difference with the control. It is suggested that different stress conditions have different inductive effects on expression characteristics ofAdRAVsgene fromA.deliciosa‘Jinkui’. According to the experimental results, it is speculated thatAdRAV1,AdRAV2 andAdRAV3 genes may be involved in SA, MeJA, ACC and ABA signal transduction pathway and resistance process of salt and high temperature, andAdRAV1 gene also may be involved in drought resistance process, whileAdRAV3 gene does in cold resistance process.

Actinidiadeliciosa‘Jinkui’;AdRAVsgene; phytohormone; environmental stress; relative expression; qRT-PCR technique

2015-11-24

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31401854)； 江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK20140760)； 江蘇省科技計(jì)劃項(xiàng)目(BE2015350)； 泰州市科技支撐計(jì)劃(農(nóng)業(yè))項(xiàng)目(TN201511)

張計(jì)育(1982—)，男，山西沁縣人，博士，副研究員，主要從事獼猴桃抗逆分子生物學(xué)研究。

E-mail: zhongrenguo@cnbg.net

Q786; Q946-33; S663.4

A

1674-7895(2016)03-0028-08

10.3969/j.issn.1674-7895.2016.03.04