萬　群, 劉曉慶, 張大勇, 何曉蘭, 徐照龍, 寧麗華, 黃益洪, 邵宏波

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所 江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 南京 210014)

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大豆GmNAC73-like基因的克隆和表達(dá)及其對GmIFS2基因的影響

萬群, 劉曉慶, 張大勇①, 何曉蘭, 徐照龍, 寧麗華, 黃益洪, 邵宏波①

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所 江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 南京 210014)

為研究NAC轉(zhuǎn)錄因子對大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕異黃酮合成的影響，根據(jù)大豆基因組序列設(shè)計(jì)引物，從豆莢中克隆獲得GmNAC73-like基因，并對該基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示：GmNAC73-like基因包含1個(gè)長度981 bp的完整開放閱讀框，編碼326個(gè)氨基酸。GmNAC73-like蛋白的理論相對分子質(zhì)量37 000，理論等電點(diǎn)pI 6.4，為親水性蛋白，無信號(hào)肽，并被定位在細(xì)胞核上，包含核定位信號(hào)“PKRRK”。同源性比對結(jié)果顯示：GmNAC73-like蛋白與野大豆(GlycinesojaSieb. et Zucc.)、蒺藜苜蓿(MedicagotruncatulaGaertn.)、可可(TheobromacacaoLinn.)、葡萄(VitisviniferaLinn.)及擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕的NAC蛋白具有較高的相似性，相似度分別為93%、69%、73%、75%和58%。在NJ系統(tǒng)樹上，GmNAC73-like蛋白與野大豆的GsNAC8蛋白和木豆〔Cajanuscajan(Linn.) Millsp.〕的CcNAC8蛋白聚在一起，顯示出較近的親緣關(guān)系。半定量RT-PCR分析結(jié)果顯示：在大豆的三葉期、開花期和結(jié)莢期，GmNAC73-like基因在根中均不表達(dá)，在莖和葉中可不同程度表達(dá)且莖中表達(dá)量較高；而在開花期或結(jié)莢期，該基因在花或豆莢中也可表達(dá)，且豆莢中表達(dá)量較高。酵母單雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：GmNAC73-like可與異黃酮生物合成關(guān)鍵酶基因GmIFS2啟動(dòng)子中的CGTG基序結(jié)合；在大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根系中過表達(dá)GmNAC73-like基因后，除查爾酮異構(gòu)酶基因的表達(dá)量無變化外，其他異黃酮生物合成相關(guān)基因的表達(dá)量均不同程度提高，其中，肉桂酸-4-羥化酶基因和查爾酮合酶基因的表達(dá)量明顯提高。此外，在GmNAC73-like基因過表達(dá)的大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根系中總異黃酮含量顯著降低。綜合分析結(jié)果表明：GmNAC73-like可能通過與MYB轉(zhuǎn)錄因子的互作調(diào)控GmIFS2基因的表達(dá)，并在大豆異黃酮的生物合成過程中起負(fù)調(diào)控作用。

大豆;GmNAC73-like基因; 蛋白特性; 表達(dá)特性;GmIFS2基因; 總異黃酮含量

異黃酮為黃酮類化合物，主要分布在部分豆科(Fabaceae)種類中。大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕中異黃酮含量約為其他豆科植物的100倍，加之大豆是人類的主要食物營養(yǎng)來源，因此人們對大豆異黃酮進(jìn)行了廣泛的研究[1]。大豆異黃酮能減少特定癌癥的發(fā)生率[2]、減輕婦女更年期綜合征[3]、預(yù)防冠狀動(dòng)脈心臟病、積極影響神經(jīng)行為活動(dòng)[4]，對植物則能增強(qiáng)植株抗病性[5]、提高固氮能力[6]。異黃酮通過苯丙氨酸路徑的分支合成，苯丙烷代謝途徑的前3步酶促反應(yīng)依次由苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)和4-香豆素輔酶A連接酶(4CL)催化完成；香豆酰輔酶A與丙二酰輔酶A在查爾酮合酶(CHS)催化下生成查爾酮(chalcone)，從而進(jìn)入類黃酮代謝途徑；豆科植物特有的查爾酮還原酶(CHR)與CHS共同催化生成異甘草素，后經(jīng)豆科植物特有的異黃酮合酶(IFS2)催化合成各種異黃酮異構(gòu)體；而查爾酮異構(gòu)酶(CHI)催化查爾酮生成的黃烷酮產(chǎn)物柚皮素(naringenin)是類黃酮化合物的基本骨架[7-8]。

NAC蛋白是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，其N端含1個(gè)高度保守的DNA結(jié)合區(qū)域和1個(gè)核定位信號(hào)序列[9]，其C端具有較大的變異性，是轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū)[10]。NAC蛋白主要在植物的生長、發(fā)育以及激素信號(hào)中發(fā)揮作用[11]；部分NAC蛋白在生物和非生物脅迫信號(hào)中也有一定作用。除劉曉慶等[12]曾報(bào)道大豆GmNAC011基因通過參與調(diào)控GmIFS2基因的表達(dá)調(diào)控異黃酮的合成外，NAC蛋白在異黃酮代謝過程中的作用尚不十分清楚。

作者在克隆大豆GmNAC73-like基因的基礎(chǔ)上，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用半定量RT-PCR技術(shù)分析GmNAC73-like基因的組織表達(dá)特性，并采用酵母單雜交技術(shù)分析GmNAC73-like蛋白與GmIFS2基因啟動(dòng)子中CGTG基序的結(jié)合情況，同時(shí)測定GmNAC73-like基因過表達(dá)對異黃酮合成途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)及總異黃酮含量的影響，以期為NAC類轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控異黃酮合成的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料

供試材料為本實(shí)驗(yàn)室保存的大豆品種‘Williams 82’種子。

1.2方法

1.2.1播種及取樣將供試大豆種子播于盆缽并置于溫室中， 于溫度25 ℃、 光照時(shí)間16 h·d-1和光照度1 000 lx的條件下培養(yǎng)；分別在三葉期、開花期和結(jié)莢期采集根、 莖、 葉、 花和豆莢， 置于液氮中速凍，并于-80 ℃保存、備用。

1.2.2總RNA提取及cDNA合成將上述樣品分別在液氮中研磨后使用SV Total RNA Isolation Z3100 System試劑盒(美國Promega公司)提取總RNA，用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量；使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript Reverse Transcriptase D2680〔寶生物工程(大連)有限公司〕合成cDNA。

1.2.3基因克隆及序列分析根據(jù)大豆基因組序列(http：∥www.phytozome.net/soybean.php)設(shè)計(jì)1對引物 (正向引物序列為5′-ATGACATGGTGCAATGAC

TCAGA-3′，反向引物序列為5′-CTATTTTCTGTCCAT

CTTGGCTTTG-3′)，并克隆GmNAC73-like基因。擴(kuò)增體系總體積50.0 μL，包括cDNA 20 ng、5×Prime STAR buffer 10.0 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs 4.0 μL、10 mmol·L-1正向引物和反向引物各2.0 μL及PrimeSTAR?HS DNA Polymerase 1.25 U，用重蒸水補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性10 s、55 ℃復(fù)性15 s、72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物回收后連接到測序載體pEASY-Blunt Simple Cloning Kit CB111-01(北京全式金生物技術(shù)有限公司)上，送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.2.4基因表達(dá)分析采用半定量RT-PCR技術(shù)對基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，以GmActin(登錄號(hào)XM_003552652)為內(nèi)參，并根據(jù)cDNA序列設(shè)計(jì)引物(表1)。擴(kuò)增體系同上； 擴(kuò)增程序?yàn)椋?94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s，共28個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

表1用于大豆異黃酮合成途徑關(guān)鍵酶基因半定量RT-PCR擴(kuò)增的引物序列

Table 1Primer sequence used for semiquantitative RT-PCR amplification of key enzyme gene in synthesis pathway of isoflavone inGlycinemax(Linn.) Merr.

基因Gene引物序列(5'→3') Primersequence(5'→3') 正向引物Forwardprimer 反向引物ReverseprimerGmActin CGGTGGTTCTATCTTGGCATC GTCTTTCGCTTCAATAACCCTAGmNAC73-like ATGACATGGTGCAATGACTCAGA CTATTTTCTGTCCATCTTGGCTTTGGmIFS2 GACAGACCATCAGAATTCCGTC CTAACTTTGGCATCATCACCTTGmPAL TAACTGGCAGACCCAACTCC CTAACTTTGGCATCATCACCTTGmC4H GGTACCTTCCCTTTGGTGTTG TAAATTGCCCTCCTTTCTCACGm4CL ATTCTATTCTCCTCTGGCACCA CCATACCTCTCCACAGCCTTTAGmCHS AGTCGTAGTAGACGGTGGAAAAA AATCAGAGAGGTTGAAATGAAGGGmCHR TCCACTGATGCTCATCCTGAC TTCCATAGCCTCCCATATTCCGmCHI GGGTTTATTTGGAGCCAGAAG GCCAGAGATTGAATGGTTGAG

1.2.5酵母單雜交實(shí)驗(yàn)方法參照劉曉慶等[12]的方法，人工合成GmIFS2啟動(dòng)子中NAC結(jié)合元件(核心序列CGTG)的3次重復(fù)序列(Yeast-pIFS2F： ggacG

AATTCATTTTTCGTGATTCATATTTTTCGTGATTCATATTTTTCGTGATTCATACTAGTctgg；Yeast-pIFS2R：ccagACTAGTATGAATCACGAAAAATATGAATCACGAAAAATATGAATCACGAAAAATGAATTCgtcc)，并連接到pHIS2.1載體上，構(gòu)建誘餌載體pHIS2.1-IFS2；在pGADT7-Rec2載體多克隆位點(diǎn)處插入GmNAC73-likeORF序列，構(gòu)建pGAD-Rec2-GmNAC73-like載體；將2個(gè)載體分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌中并提取質(zhì)粒；用PEG/LiAc共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187，并將其涂在缺陷型培養(yǎng)基(SD/-His/-Leu/-Trp)上，3～4 d后挑取陽性克隆，涂在添加80 mmol L-13-AT的缺陷型培養(yǎng)基(SD/-His/-Leu/-Trp)上；3～4 d后觀察菌落生長情況，并分析GmNAC73-like與GmIFS2啟動(dòng)子CGTG基序的結(jié)合情況。陽性對照為p53HIS2.1+pGAD-Rec2-53，陰性對照為p53HIS2.1+pGAD-Rec2-GmNAC73-like。

1.2.6農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆發(fā)狀根系轉(zhuǎn)化及檢測參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行大豆發(fā)狀根系轉(zhuǎn)化。設(shè)計(jì)GmNAC73-likeORF引物，將GmNAC73-like基因序列克隆到pCXSN植物表達(dá)載體上，并采用凍融法將pCXSN-GmNAC73-like質(zhì)粒轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599中；挑取已轉(zhuǎn)化的K599單克隆，在LB液體培養(yǎng)基(含質(zhì)量濃度50 μg·mL-1卡那霉素)中于28 ℃震蕩培養(yǎng)48 h，離心收集菌體，用10 mmol·L-1MgCl2重懸，稀釋至OD600值為0.5，備用。

將無菌的大豆種子播種于1/2MS培養(yǎng)基中，置于溫度25 ℃、 光照時(shí)間16 h·d-1的培養(yǎng)室中培養(yǎng)5～ 6 d；于無菌條件下剪取子葉；用無菌手術(shù)刀在子葉背面挖洞，然后擺放在含質(zhì)量濃度均為250 μg·mL-1頭孢菌素酶和羧芐青霉素的Whiter培養(yǎng)基上，將上述菌液滴在子葉背面的洞中，于25 ℃條件下暗培養(yǎng)17～25 d；待發(fā)狀根系長4～8 cm時(shí)，剪下發(fā)狀根系并提取DNA；用PCR檢測轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根系，從中選取OE-1、OE-2、OE-3和OE-4共4個(gè)轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根系。

1.2.7總異黃酮含量測定參照易金鑫等[14]的方法，分別稱取上述轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根系各0.2 g，加入15 mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，勻漿，于60 ℃下提取2 h；過濾后分別在波長243、263和283 nm處比色, 計(jì)算總異黃酮含量。對照為轉(zhuǎn)K599菌液(無pCXSN-GmNAC73-like質(zhì)粒)的發(fā)狀根系。

1.3數(shù)據(jù)處理及分析

運(yùn)用Clustal Ⅹ及GeneDoc對GmNAC73-like序列進(jìn)行分析。用ExPASy(http:∥web.expasy.org/ protparam)預(yù)測蛋白的親水性和疏水性，用Swiss-Model(http:∥swissmodel.expasy.org)預(yù)測蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，用Signal(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測信號(hào)肽，用SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測Pfam結(jié)構(gòu)域和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。用WoLF PSORT(http:∥www.genscript.com/wolf-psort.html)預(yù)測亞細(xì)胞定位，用NLStradamus(http:∥www.moseslab.csb.utoronto.ca/NLStradamus/)預(yù)測核定位信號(hào)。用MEGA 5.1(http:∥www.megasoftware.net/index.html)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；采用NJ方法進(jìn)行運(yùn)算，采用Pairwise Deletion和Poisson correction模式，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap設(shè)為1 000次。

2　結(jié)果和分析

2.1GmNAC73-like基因及其編碼的蛋白質(zhì)分析

采用半定量RT-PCR技術(shù)從大豆豆莢中克隆到1條cDNA序列，測序比對結(jié)果顯示：該cDNA序列與數(shù)據(jù)庫(http:∥www.Phytozome.net/soybean.php)中GmNAC73-like基因的理論序列完全一致；通過BLASTx證實(shí)該序列為GmNAC73-like基因(登錄號(hào)XP_003529352.1)。GmNAC73-like基因含有1個(gè)長度981 bp的完整開放閱讀框(ORF)，編碼326個(gè)氨基酸。該基因編碼的蛋白質(zhì)為GmNAC73-like蛋白，理論相對分子質(zhì)量37 000，理論等電點(diǎn)pI 6.4。預(yù)測結(jié)果表明：GmNAC73-like蛋白為親水性蛋白，無信號(hào)肽，且被定位在細(xì)胞核上；NLStradamus預(yù)測其有核定位信號(hào)“PKRRK”，與轉(zhuǎn)錄因子作用部位一致。

多重序列比對分析結(jié)果(圖1)顯示：GmNAC73-like蛋白的氨基酸序列與野大豆(GlycinesojaSieb. et Zucc.，KHN09961.1)、蒺藜苜蓿(MedicagotruncatulaGaertn.，XP_013456941.1)、可可(TheobromaacaoLinn.，XP_007025530.1)、葡萄 (VitisviniferaLinn.，XP_002278661.1)和擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.，NP_194579.1〕的NAC蛋白具有較高的相似性，相似度分別為93%、69%、73%、75%和58%；GmNAC73-like蛋白的N末端有1個(gè)高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，而C末端則存在高度差異，與已知的NAC蛋白的結(jié)構(gòu)一致。GmNAC73-like蛋白在第68位至第209位氨基酸間含有NAM結(jié)構(gòu)域(Pfam02365)，為NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)構(gòu)域(圖2)；該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)含有α-螺旋和β-折疊。此外，利用SMART預(yù)測GmNAC73-like蛋白互作蛋白網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)該蛋白與MYB轉(zhuǎn)錄因子能夠互作(圖3)。

GmNAC73-like: 大豆Glycinemax(Linn.) Merr.; GsNAC8: 野大豆GlycinesojaSieb. et Zucc.; MtNAC8: 蒺藜苜蓿MedicagotruncatulaGaertn.; TcNAC73: 可可TheobromacacaoLinn.; VvNAC8: 葡萄VitisviniferaLinn.; AtNAC73: 擬南芥Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh. 實(shí)線部分為保守區(qū)域，虛線部分為非保守區(qū)域The solid line is conserved region, and the dotted line is non-conservative region.

圖1大豆GmNAC73-like蛋白與其他植物NAC蛋白的同源性比對結(jié)果

Fig. 1Result of homology alignment of GmNAC73-like protein fromGlycinemax(Linn.) Merr. with NAC protein from other species

圖2大豆GmNAC73-like蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測

Fig. 2Domain prediction of GmNAC73-like protein fromGlycinemax(Linn.) Merr.

GLYMA13G41470.1: MYB82轉(zhuǎn)錄因子MYB82 transcription factor; GLYMA06G06870.1: 纖維素合酶Cellulose synthase; MYB82: MYB82轉(zhuǎn)錄因子MYB82 transcription factor; GLYMA17G14180.1: HD1-like蛋白HD1-like protein; GLYMA12G36630.1: MYB46轉(zhuǎn)錄因子MYB46 transcription factor; GLYMA07G32250.1: NAC73-like轉(zhuǎn)錄因子NAC73-like transcription factor; GLYMA13G27310.1: MYB46轉(zhuǎn)錄因子MYB46 transcription factor; GLYMA04G06780.1: 纖維素合酶Cellulose synthase; GLYMA12G06180.2: MYB46轉(zhuǎn)錄因子MYB46 transcription factor; GLYMA11G14200.2: MYB46轉(zhuǎn)錄因子MYB46 transcription factor; GLYMA08G12400.1: 纖維素合酶Cellulose synthase.

圖3大豆GmNAC73-like蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測結(jié)果

Fig. 3Prediction result of interaction network of GmNAC73-like protein fromGlycinemax(Linn.) Merr.

2.2GmNAC73-like蛋白的親緣關(guān)系分析

通過聚類分析構(gòu)建大豆GmNAC73-like蛋白與其他12種植物NAC蛋白的NJ系統(tǒng)樹(圖4)。結(jié)果顯示： 大豆GmNAC73-like與野大豆的GsNAC8蛋白的親緣關(guān)系最近，與同科植物木豆〔Cajanuscajan(Linn.) Millsp.,KYP76320.1〕、蒺藜苜蓿和鷹嘴豆(CicerarietinumLinn.,XP_004505102.1)的NAC蛋白也有較近的親緣關(guān)系。

分支上的數(shù)據(jù)表示bootstrap百分比 Datums above the branches indicate percentage of bootstrap. GmNAC73-like: 大豆Glycinemax(Linn.) Merr.; GsNAC8: 野大豆GlycinesojaSieb. et Zucc.; CcNAC8: 木豆Cajanuscajan(Linn.) Millsp.; MtNAC8: 蒺藜苜蓿MedicagotruncatulaGaertn.; CaNAC10: 鷹嘴豆CicerarietinumLinn.; CsNAC73： 甜橙Citrussinensis(Linn.) Osbeck; RcNAC73: 蓖麻RicinuscommunisLinn.； GaNAC8: 樹棉GossypiumarboreumLinn.; TcNAC73: 可可TheobromacacaoLinn.; VvNAC8: 葡萄VitisviniferaLinn.; MdNAC8: 蘋果MalusdomesticaBorkh.； MnNAC8: 川桑MorusnotabilisSchneid.；AtNAC73: 擬南芥Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.

圖4大豆GmNAC73-like蛋白與其他植物NAC蛋白的NJ系統(tǒng)樹

Fig. 4NJ phylogenetic tree of GmNAC73-like protein fromGlycinemax(Linn.) Merr. and NAC protein from other species

2.3GmNAC73-like基因的組織表達(dá)分析

采用半定量RT-PCR方法對大豆不同發(fā)育期GmNAC73-like基因在不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行檢測(圖5)。在大豆的三葉期、開花期和結(jié)莢期，GmNAC73-like基因在根中幾乎不表達(dá)，在其他組織中均可表達(dá)；在不同發(fā)育期GmNAC73-like基因在莖和葉中均可表達(dá)，其中，莖中GmNAC73-like基因的表達(dá)量較高；此外，在開花期和結(jié)莢期該基因分別在花和豆莢中均可表達(dá)，其中，在豆莢中表達(dá)量相對較高。

R: 根Root; S: 莖Stem; L: 葉Leaf; F: 花Flower; P: 豆莢Pod. St: 三葉期Trefoil stage; Sf: 開花期Flowering stage; Sp: 結(jié)莢期Pod setting stage.

圖5不同發(fā)育期大豆不同組織中GmNAC73-like基因表達(dá)的RT-PCR分析結(jié)果

Fig. 5Result of RT-PCR analysis onGmNAC73-likegene expression in different tissues ofGlycinemax(Linn.) Merr. at different development stages

2.4GmNAC73-like與GmIFS2啟動(dòng)子中CGTG基序結(jié)合的驗(yàn)證

NAC可能的結(jié)合位點(diǎn)核心區(qū)域?yàn)镃GTA或CGTG基序[11-12]。對GmIFS2(Glyma.13G173500)啟動(dòng)子序列(起始密碼子2 000 bp)的分析結(jié)果表明，其有ARE、MRE和HD-ZIP等結(jié)合元件，同時(shí)在-1 369位置有1個(gè)CGTG基序位點(diǎn)(圖6-A)。

用酵母單雜交的方法檢測GmNAC73-like與GmIFS2啟動(dòng)子的結(jié)合情況。結(jié)果(圖6-B)顯示：在添加80 mmol·L-13-AT的缺陷型 (SD/-His/-Leu/-Trp)固體培養(yǎng)基上，陽性對照(p53HIS2.1+pGAD-Rec2-53)[15]和實(shí)驗(yàn)組(IFS2HIS2.1+pGAD-Rec2-GmNAC73-like)的菌株均能生長，而陰性對照(p53HIS2.1+pGAD-Rec2-GmNAC73-like)菌株則幾乎不能生長； 但在不添加3-AT的缺陷型 (SD/-His/-Leu/-Trp)固體培養(yǎng)基上3組菌株均可正常生長，說明GmNAC73-like與GmIFS2啟動(dòng)子中的CGTG基序可以有效結(jié)合。

p53HIS2.1+pGAD-Rec2-53: 陽性對照Positive control;p53HIS2.1+pGAD-Rec2-GmNAC73-like: 陰性對照Negative control;IFS2pHIS2.1+pGAD-Rec2-GmNAC73-like: 實(shí)驗(yàn)組Experimental group.

A:GmIFS2啟動(dòng)子順式作用調(diào)控元件cis-acting regulatory element ofGmIFS2 promoter; B: GmNAC73-like與GmIFS2啟動(dòng)子中CGTG基序結(jié)合的驗(yàn)證結(jié)果Confirmative result on GmNAC73-like binding to CGTG motif inGmIFS2 promoter.

圖6GmIFS2啟動(dòng)子中CGTG基序的位點(diǎn)及GmNAC73-like與CGTG基序結(jié)合的驗(yàn)證

Fig. 6Site of CGTG motif inGmIFS2 promoter and confirmation of binding of GmNAC73-like to CGTG motif

2.5GmNAC73-like基因過表達(dá)對異黃酮合成途徑關(guān)鍵酶基因及總異黃酮含量的影響

PCR結(jié)果(圖7)顯示：在GmNAC73-like基因過表達(dá)的大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根系中，苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶基因(C4H)、查爾酮合酶基因(CHS)、4-香豆素輔酶A連接酶基因(4CL)、查爾酮還原酶基因(CHR)和異黃酮合酶基因(IFS2)的表達(dá)量均不同程度提高，尤其是C4H和CHS的表達(dá)量明顯提高，而查爾酮異構(gòu)酶基因(CHI)的表達(dá)量則無變化。

對大豆轉(zhuǎn)基因根系中總異黃酮含量的測定結(jié)果(圖8)顯示：在GmNAC73-like基因過表達(dá)的大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根系中，總異黃酮含量明顯低于對照，差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，表明GmNAC73-like基因在大豆異黃酮生物合成過程中起負(fù)調(diào)控作用。

CK: 轉(zhuǎn)K599菌液(無pCXSN-GmNAC73-like質(zhì)粒)的發(fā)狀根系Hairy roots of transformed K599 (without pCXSN-GmNAC73-likeplasmid); OE-1,OE-2,OE-3,OE-4: 轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根系Transgenic hairy roots.GmActin: 內(nèi)參基因Reference gene;PAL: 苯丙氨酸解氨酶基因Phenylalanine ammonia-lyase gene;C4H: 肉桂酸-4-羥化酶基因Cinnamic acid-4-hydroxylase gene;CHS: 查爾酮合酶基因Chalcone synthase gene; 4CL: 4-香豆素輔酶A連接酶基因4-coumarin coenzyme A ligase gene;CHR: 查爾酮還原酶基因Chalcone reductase gene;CHI: 查爾酮異構(gòu)酶基因Chalcone isomerase gene;IFS2: 異黃酮合酶基因Isoflavone synthase gene.

圖7GmNAC73-like基因過表達(dá)對大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根系中異黃酮合成途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

Fig. 7Effect of over expression ofGmNAC73-likegene on expression of key enzyme genes in synthesis pathway of isoflavone in transgenic hairy roots ofGlycinemax(Linn.) Merr.

CK: 轉(zhuǎn)K599菌液(無pCXSN-GmNAC73-like質(zhì)粒)的發(fā)狀根系Hairy roots of transformed K599 (without pCXSN-GmNAC73-ikeplasmid); OE: 轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根系Transgenic hairy roots.

不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Different small letters indicate the significant difference (P<0.05).

圖8GmNAC73-like基因過表達(dá)對大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根系中總異黃酮含量的影響

Fig. 8Effect of over expression ofGmNAC73-likegene on total isoflavone content in transgenic hairy roots ofGlycinemax(Linn.) Merr.

3　討論和結(jié)論

上述研究結(jié)果顯示：從大豆豆莢中克隆獲得的GmNAC73-like基因，其編碼的GmNAC73-like蛋白與野大豆的GsNAC8蛋白和木豆的CcNAC8蛋白親緣關(guān)系最近，與這3種植物同為豆科種類有關(guān)；該蛋白的N端具有保守的NAC結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能夠與DNA序列結(jié)合，且被定位在細(xì)胞核上，并具有核定位信號(hào)，這些都符合轉(zhuǎn)錄因子的基本特征。

GmNAC73-like基因在大豆的莖、葉、花和豆莢中均可表達(dá)，說明該基因參與了大豆的大部分生長發(fā)育過程。GmNAC73-like基因的表達(dá)量在豆莢中較高，這與“大豆異黃酮主要在大豆種子中合成[16]”的結(jié)果相一致。推測GmNAC73-like基因與異黃酮的合成有一定的相關(guān)性。

對NAC蛋白分子生物學(xué)功能的研究，首先發(fā)現(xiàn)酵母中的NAC基因能激活CaMV35S啟動(dòng)子[17]；其后又相繼發(fā)現(xiàn)擬南芥中的3個(gè)NAC基因(NAC2、AtNAM

和ANAC019)和油菜(BrassicacampestrisLinn.)中的幾個(gè)NAC基因可以結(jié)合到CaMV35S啟動(dòng)子上[18]；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中的3個(gè)NAC蛋白可以結(jié)合到ERD1(earlyresponsivetodehydrationstress1)基因的啟動(dòng)子上，啟動(dòng)子中的1個(gè)以CACG為核心的DNA結(jié)構(gòu)能被NAC結(jié)構(gòu)域所識(shí)別[19]。劉曉慶等[12]認(rèn)為，大豆中與異黃酮合成相關(guān)的GmNAC011可以與GmIFS2基因啟動(dòng)子中的CGTG基序結(jié)合。本研究中，與大豆異黃酮合成相關(guān)的GmNAC73-like同樣可以與GmIFS2基因啟動(dòng)子中的CGTG基序結(jié)合。MYB轉(zhuǎn)錄因子可以作為調(diào)節(jié)蛋白參與異黃酮合成途徑的調(diào)控[20-21]；而大豆中R1型MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB176可以調(diào)控CHS8基因的表達(dá)并影響大豆異黃酮的合成[20]；此外，在大豆中還鑒定出1個(gè)R2R3型轉(zhuǎn)錄因子GmMYB39，能夠抑制CHS的表達(dá)活性，并進(jìn)而抑制異黃酮的生物合成[21]。大豆GmIFS2基因啟動(dòng)子中也含有MYB結(jié)合位點(diǎn)MRE，由于GmNAC73-like與GmMYB82和GmMYB46共表達(dá)，據(jù)此推測GmNAC73-like可能通過與MYB轉(zhuǎn)錄因子的互作調(diào)控GmIFS2的表達(dá)，從而負(fù)調(diào)控異黃酮的生物合成。

本研究中，GmNAC73-like基因過表達(dá)后大豆轉(zhuǎn)基因根系中與異黃酮合成途徑相關(guān)的重要基因的表達(dá)量增加，說明GmNAC73-like可參與調(diào)控異黃酮合成。另外，GmNAC73-like可以與GmIFS2基因啟動(dòng)子中的CGTG基序結(jié)合，這也進(jìn)一步說明栽培大豆的GmNAC73-like基因可通過參與調(diào)控GmIFS2基因的表達(dá)來調(diào)控大豆異黃酮的合成。

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(責(zé)任編輯： 張明霞)

Cloning and expression ofGmNAC73-likegene fromGlycinemaxand its effect onGmIFS2 gene

WAN Qun, LIU Xiaoqing, ZHANG Dayong①, HE Xiaolan, XU Zhaolong, NING Lihua, HUANG Yihong, SHAO Hongbo①

(Provincial Key Laboratory of Agrobiology, Institute of Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China),J.PlantResour. &Environ., 2016, 25(3): 12-18， 27

In order to study the effect of NAC transcription factor on isoflavone synthesis ofGlycinemax(Linn.) Merr., primers were designed according to genome sequence fromG.max,GmNAC73-likegene was cloned from pod ofG.max, and bioinformatic analysis of this gene sequence was carried out. The results show thatGmNAC73-likegene includes a whole open reading frame with length of 981 bp, 326 amino acids are encoded. Theoretical relative molecular mass of GmNAC73-like protein is 37 000, theoretical isoelectric point is pI 6.4, which is a hydrophilic protein without signal peptide, it is located in nucleus and contains nuclear localization signal “PKRRK”. The homology alignment result shows that GmNAC73-like protein has a high similarity with NAC protein fromGlycinesojaSieb. et Zucc.,MedicagotruncatulaGaertn.,TheobromacacaoLinn.,VitisviniferaLinn. andArabidopsisthaliana(Linn.) Heynh., with a similarity degree of 93%, 69%, 73%, 75% and 58%, respectively. In NJ phylogenetic tree, GmNAC73-like protein, GsNAC8 protein fromG.sojaand CcNAC8 protein fromCajanuscajan(Linn.) Millsp. are clustered together, showing close phylogenetic relationship. The semi-quantitative RT-PCR analysis result shows that at trefoil, flowering and pod setting stages,GmNAC73-likegene has no expression in root, and has different degrees of expression in stem and leaf, and has a higher expression in stem; while at flowering or pod setting stages, this gene also has expression in flower or pod, and has a higher expression in pod. The result of yeast one-hybrid experiment shows that GmNAC73-like can bind to CGTG motif in promoter of key enzyme geneGmIFS2 of isoflavone biosynthesis. After over expression ofGmNAC73-likegene in transgenic hairy roots ofG.max, except expression of chalcone isomerase gene without change, expression of other related genes of isoflavone biosynthesis is enhanced with different degrees, in which, that of cinnamic acid-4-hydroxylase gene and chalcone synthase gene is enhanced obviously. In addition, total isoflavone content in transgenic hairy roots ofG.maxwith over expression ofGmNAC73-likegene decreases significantly. The comprehensive analysis result shows that GmNAC73-like may regulate expression ofGmIFS2 gene by interaction with MYB transcription factor, and plays a negative regulation in isoflavone biosynthesis process ofG.max.

Glycinemax(Linn.) Merr.;GmNAC73-likegene; protein characteristics; expression characteristics;GmIFS2 gene; total isoflavone content

2016-05-04

江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK20130727); 江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程項(xiàng)目〔SXGC(2016)335〕; 江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目〔Cx(15)1005〕; 江蘇省“雙創(chuàng)計(jì)劃”人才項(xiàng)目

萬群(1982—)，女，四川成都人，博士，助理研究員，主要從事大豆耐鹽分子生物學(xué)方面的研究。

E-mail: cotton.z@126.com; shaohongbochu@126.com

Q786; S565.1

A

1674-7895(2016)03-0012-07

10.3969/j.issn.1674-7895.2016.03.02