張 玉，楊 先，姜麗萍，劉桂波，王雙雙

·實(shí)驗(yàn)論著·

BMP-2在C57BL/6小鼠形覺(jué)剝奪性近視眼鞏膜中表達(dá)的變化

張 玉，楊 先，姜麗萍，劉桂波，王雙雙

Department of Ophthalmology，the Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266003，Shangdong Province，China

Correspondence to:Xian Yang.Department of Ophthalmology，the AffiliatedHospitalofQingdaoUniversity，Qingdao266003，Shangdong Province，China.yangxian_zhao@126.com

·AIM:Toidentifythepresencechangeofbone morphogenetic protein-2（BMP-2）in sclera of form deprivation myopic（FDM）eyes in C57BL/6 mice and to investigate its role in sclera remodeling.

·METHODS:A total of 64 C57BL/6 mice which were 3～4wk were randomized into FDM-21d group（n=16），a normal control group（n=16）；FDM-28d group（n=16）and a normal control group（n=16）.FDM models were established by sutured 0.5mL PCR plastic caps to the skin surrounding the right eye for 21 days and 28 days in experimental group，and the fellow eyes served as the self-control eyes.Diopter and axial length of all eyes was tested by retinoscopy optometry and vernier calipers before and after the form deprivation.As the models established，the sclera of the mice were obtained and hematoxylin and eosin（H-E）staining were used for observingthemorphologicalchangeinthetissue. Immunohistochemicalstainingandfluorescence quantificational real-timepolymerasechainreaction（QRT-PCR）were applied to investigate the expression of BMP-2 protein and mRNA.

·RESULTS:After 21 and 28d，the diopter of the deprived eyes was-1.60±1.03D and-3.10±1.19D and the axial length wasprolongedby 16±12μmand 21±13μm respectively.The differences were statistically significant，compared to self-control eyes and to normal control groups（P＜0.05）.After stained by H-E，the sclera from the deprived eyes became thinner and the sequence of collagenous fiberdisappeared.Theresultsfromthe immunohistochemical staining and QRT-PCR showed that mRNA and protein of BMP-2 decreased significantly，and the differences were statistically significant，compared to self-control eyes and to normal control groups（P＜0.05）. ·CONCLUSION:The expressions of the BMP-2 in sclera down-regulate significantly in FDM eyes，which suggests that BMP-2mayplayanimportantroleinsclera remodeling during myopia development.

目的：觀察C57BL/6小鼠形覺(jué)剝奪性近視（formdeprivation myopia，F(xiàn)DM）鞏膜中BMP-2表達(dá)的變化，研究其在鞏膜重塑中發(fā)揮的作用。

方法：選擇3～4周齡的C57BL/6小鼠64只，以隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為形覺(jué)剝奪21d組（16只）、同齡對(duì)照組（16只）；形覺(jué)剝奪28d組（16只）、同齡對(duì)照組（16只）。形覺(jué)剝奪前后對(duì)所有小鼠進(jìn)行帶狀光剪影驗(yàn)光檢測(cè)小鼠眼球的屈光狀態(tài)，游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠的眼軸長(zhǎng)度，造模后分別于21d和28d取小鼠的鞏膜組織，蘇木素-伊紅（HE）染色觀察小鼠鞏膜組織形態(tài)學(xué)變化，用熒光定量RT-PCR和免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組小鼠鞏膜BMP-2 mRNA和其蛋白的表達(dá)水平。

結(jié)果：小鼠形覺(jué)剝奪21d和28d后，剝奪眼分別誘導(dǎo)出-1.60±1.03D和-3.10±1.19D的相對(duì)近視，眼軸分別拉長(zhǎng)16±12μm和21±13μm，與自身對(duì)照組和正常對(duì)照相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HE染色行鞏膜形態(tài)學(xué)觀察，可觀察到剝奪眼鞏膜變薄，膠原纖維排列紊亂。熒光定量RT-PCR和免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)眼BMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，與自身對(duì)照和正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

結(jié)論：C57BL/6小鼠形覺(jué)剝奪眼鞏膜中BMP-2呈下調(diào)趨勢(shì)，BMP-2可能參與了近視發(fā)展過(guò)程中的鞏膜重塑作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

C57BL/6小鼠；骨形態(tài)發(fā)生蛋白；形覺(jué)剝奪性近視；鞏膜

引用：張玉，楊先，姜麗萍，等.BMP-2在C57BL/6小鼠形覺(jué)剝奪性近視眼鞏膜中表達(dá)的變化.國(guó)際眼科雜志2016；16（3）: 423-427

0　引言

目前普遍認(rèn)為，近視的發(fā)生受遺傳和環(huán)境等多因素的綜合影響［1］，但確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。在近視的發(fā)展過(guò)程中，鞏膜膠原聚集減少，降解增加，這些改變導(dǎo)致鞏膜干重的下降，以及鞏膜后極部膠原纖維平均直徑變小，膠原纖維分布紊亂［2］。關(guān)于鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)（extracellar matrix，ECM）的改變已經(jīng)有了相關(guān)的研究，McBrien［3］發(fā)現(xiàn)BMP/TGF-β信號(hào)通路有調(diào)控鞏膜ECM的作用。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族中的一員。BMPs超家族在細(xì)胞的許多功能當(dāng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，其與多種組織的形態(tài)發(fā)育和細(xì)胞外基質(zhì)重塑相關(guān)，被稱為“體形態(tài)發(fā)生蛋白”。研究證明，BMP-2可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的人類鞏膜成纖維細(xì)胞（human scleral fibroblasts，HSFs）中ECM的合成［4］。王青等［5］發(fā)現(xiàn)豚鼠近視模型中，14d后近視眼鞏膜中BMP-2的表達(dá)明顯下降。Liu等［6］發(fā)現(xiàn)BMP2K基因異常與高度近視密切相關(guān)，說(shuō)明BMP-2與近視的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本文通過(guò)建立C57BL/6小鼠形覺(jué)剝奪性近視模型，研究BMP-2在鞏膜中的變化，探討其在鞏膜重塑中的作用。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用3～4周齡C57BL/6雄性小鼠64只（購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)），體質(zhì)量10～13g，排除患有眼疾及雙眼屈光參差＜1.5D的小鼠，每籠4只，室溫控制在20℃～25℃，光照/黑暗周期為14h/10h，室內(nèi)控制照明調(diào)節(jié)在250～350Lu。給予小鼠專用飼料，并每日給予新鮮蔬菜水果，自由飲水，動(dòng)物的飼養(yǎng)及處理經(jīng)青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.1.2主要試劑與儀器 帶狀光剪影鏡（蘇州六六）、兔抗鼠多克隆抗體BMP-2（BA0585-1）購(gòu)于武漢博奧森公司，SP試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Ver.3.0型RNA PCR試劑盒（100次量）購(gòu)于大連寶生物試劑公司，SYBY（日本，TaKaRa）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（德國(guó)Eppendorf），PCR引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.2方法

1.2.1小鼠形覺(jué)剝奪性近視模型的建立 64只3～4周齡雄性近交系C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為形覺(jué)剝奪組（n=32）和正常對(duì)照組（n=32）:（1）形覺(jué)剝奪組選取右眼為剝奪眼，佩戴0.5mL EP管蓋子，左眼作為自身對(duì)照眼，依據(jù)形覺(jué)剝奪時(shí)間21d、28d不同時(shí)間建立近視動(dòng)物模型。（2）正常對(duì)照組，在頸部佩戴塑料項(xiàng)圈，雙眼不做任何處理，年齡與實(shí)驗(yàn)組相同。小鼠用5%枸櫞酸芬太尼注射液以4mg/kg麻醉后，將0.5mL EP管蓋子用5-0縫線縫4～6針在小鼠眼周，被遮眼能瞬目，不壓迫眼球，頸部佩戴項(xiàng)圈，防止小鼠將眼罩抓脫。每天用棉簽擦拭小鼠對(duì)側(cè)眼及眼周，防止感染，每天3次檢查小鼠眼罩是否掉針，脫落，以保證小鼠被遮眼一直處于被遮狀態(tài)。誘導(dǎo)21d和28d后，分別檢查所有動(dòng)物的屈光度和眼軸長(zhǎng)度，并取鞏膜組織進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2屈光度及眼軸長(zhǎng)度的測(cè)量 小鼠在清醒的狀態(tài)下，用復(fù)方托吡卡胺散瞳，每5min 1次，連續(xù)3次后，驗(yàn)光由有經(jīng)驗(yàn)的驗(yàn)光師在暗室條件下，手持帶狀光檢影鏡檢測(cè)屈光度，每只小鼠測(cè)3次，取平均值并記錄屈光值（D）。脫頸法處死小鼠后，迅速取出眼球，在顯微鏡下去除多余筋膜及肌肉組織，用生理鹽水沖洗后，用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量眼軸的長(zhǎng)度（角膜的前頂點(diǎn)到眼球后極部之間的直線距離），精確到0.01mm，測(cè)量3次后取平均值并記錄。

1.2.3標(biāo)本的處理 所有操作均在顯微鏡觀察下在冰床上進(jìn)行，取出眼球后，用眼科鑷和眼科剪剝離眼球周圍筋膜，沿角膜緣將眼球剪開(kāi)，去除眼球內(nèi)的玻璃體，并將視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜分離，取鞏膜組織，隨機(jī)各組取6只小鼠眼球置于4%甲醛固定48h，行常規(guī)HE染色及免疫組織化學(xué)染色，各組另10只小鼠眼球的鞏膜組織置于500mL Trizolz液中，并立即震蕩充分裂解后，保存于-80℃以提取RNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。

1.2.4HE染色觀察小鼠鞏膜組織形態(tài)學(xué)變化和免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)BMP-2蛋白的表達(dá) 在各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中取6只小鼠眼球，予以常規(guī)石蠟包埋，所有組織塊于后極部以3μm的厚度連續(xù)切片4張，一張用于蘇木素-伊紅（HE）染色，1張用做陰性對(duì)照，2張用于免疫組織化學(xué)染色:（1）石蠟切片置于60℃溫箱中烤片過(guò)夜；（2）行常規(guī)梯度酒精脫蠟至水；（3）高壓抗原修復(fù):0.01mol/L檸檬鈉溶液500mL于高壓鍋中煮沸后，放入石蠟切片，中火至冒氣，再改為小火2min，然后冷卻至室溫，蒸餾水沖洗3遍；（4）3%H2O2室溫孵育15min，蒸餾水沖洗，PBS漂洗3min ×3次；（5）正常山羊血清工作液封閉，室溫孵育15min，傾去血清，勿洗，滴加1∶100稀釋兔抗鼠多克隆抗體BMP-2單克隆抗體工作液，37℃濕盒孵育2h；（6）滴加生物素化二抗工作液，室溫孵育15min，PBS漂洗5min×3次；（7）滴加PV-6001工作液，室溫孵育15min，PBS漂洗5min×3次；（8）DAB顯色5min，在顯微鏡下掌握染色程度，自來(lái)水沖洗終止染色；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核10s，1%鹽酸酒精分化脫色，自來(lái)水洗1遍；（9）60℃溫箱中烤干后，樹(shù)膠封固，顯微鏡下觀察、拍片。光鏡下分別觀察各組標(biāo)本中BMP-2的顯色程度、分布范圍及密度，以細(xì)胞核或細(xì)胞漿然染成棕黃色為陽(yáng)性。使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析檢測(cè)圖像，用平均光密度值表示BMP-2的相對(duì)蛋白表達(dá)量。以PBS代替一抗為陰性對(duì)照。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠鞏膜中BMP-2 mRNA表達(dá) 提取總RNA:從-80℃冰箱內(nèi)取出凍存的小鼠鞏膜組織，用Trizol法提取總RNA。目的基因應(yīng)用primer design基因分析軟件設(shè)計(jì)引物，并由TaKaRa生物公司合成。BMP-2上下游引物分別為:5'-TGACTGGATCGTGGCACCTC-3'，5'-CAGAGTCTGCACTATGGCATGGTTA-3'，產(chǎn)物片段長(zhǎng)為156bp；內(nèi)參β-action上、下游引物分別為:5'-GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC-3'，5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度301bp。常規(guī)提取總RNA，采用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定光密度OD260與OD280，OD260與OD280比值在1.8～2.0之間，表明提取的RNA蛋白污染少，純度較好。逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增BMP-2目的基因，Syber Green熒光定量PCR檢測(cè):PCR熱循環(huán)參數(shù)為95℃30s，95℃5s，然后第二步反應(yīng)60℃30s，95℃15s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，于每個(gè)循環(huán)的第二步（95℃15s）收集熒光信號(hào)。擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)入分析結(jié)果界面，以β-actin作為內(nèi)參照基因，與對(duì)照組相比較得到目的基因的相對(duì)定量值RQ（RQ=2-△△Ct）。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)SPSS 17.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，實(shí)驗(yàn)眼與自身對(duì)照眼相比采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)眼及自身對(duì)照眼與正常對(duì)照組相比采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　各組小鼠FDM后屈光度和眼軸長(zhǎng)度的變化±s

表1　各組小鼠FDM后屈光度和眼軸長(zhǎng)度的變化±s

注:aP＜0.01，bP＜0.01 vs自身對(duì)照眼；cP＜0.05，eP＜0.05 vs正常對(duì)照眼。

時(shí)間組別眼數(shù)屈光度（D）眼軸長(zhǎng)度（mm）FDM21d正常對(duì)照眼163.04±0.533.134±0.032自身對(duì)照眼163.01±1.263.137±0.028實(shí)驗(yàn)眼161.45±1.15a，c3.155±0.032a，cFDM28d正常對(duì)照眼162.48±0.673.241±0.041自身對(duì)照眼162.45±0.543.243±0.038實(shí)驗(yàn)眼16-0.57±0.28b，e3.271±0.041b，e

表2　正常對(duì)照組與FDM自身對(duì)照眼及實(shí)驗(yàn)眼小鼠鞏膜BMP-2平均光密度值±s

表2　正常對(duì)照組與FDM自身對(duì)照眼及實(shí)驗(yàn)眼小鼠鞏膜BMP-2平均光密度值±s

注:aP＜0.05 vs自身對(duì)照眼；cP＜0.05 vs正常對(duì)照眼；bP＜0.01 vs自身對(duì)照眼；dP＜0.01 vs正常對(duì)照眼。

時(shí)間眼數(shù)正常對(duì)照眼自身對(duì)照眼實(shí)驗(yàn)眼FDM 21d60.662±0.029 0.627±0.006 0.215±0.022a，cFDM 28d60.748±0.010 0.714±0.011 0.198±0.020b，d

圖1　小鼠正常眼后極部各層結(jié)構(gòu)HE染色（×400） 從上到下依次為:NFL:神經(jīng)纖維層（nerve fibre layer）；GCL:神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層（ganglon cell layer）；IPL:內(nèi)叢狀層（inner plexiform layer）；INL:內(nèi)核層（inner nuclear layer）；OPL:外叢狀層（outer plexiform layer）；ONL:外核層（outer nuclear layer）；IS:內(nèi)節(jié)（inner segment）；OS:外節(jié)（out segment）；RPE:視網(wǎng)膜色素上皮層（retinal pigment epithelium）；Choriod:脈絡(luò)膜；Sclera:鞏膜。

2　結(jié)果

2.1各組小鼠屈光度和眼軸長(zhǎng)度結(jié)果 實(shí)驗(yàn)前，正常對(duì)照組、自身對(duì)照組以及實(shí)驗(yàn)組的平均屈光度數(shù)為4.31± 1.35、3.71±1.14、4.22±1.47D，實(shí)驗(yàn)前屈光度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。形覺(jué)剝奪21d后，實(shí)驗(yàn)眼較自身對(duì)照眼偏向近視方向-1.50D，與自身對(duì)照和正常對(duì)照眼屈光度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-12.275，P=0.000；t= -13.971，P=0.000），實(shí)驗(yàn)眼的眼軸也較自身對(duì)照眼和正常眼明顯延長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.723，P= 0.011；t=6.118，P=0.007）。隨著形覺(jué)剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)，剝奪28d后，實(shí)驗(yàn)眼相對(duì)自身對(duì)照眼偏向近視約-3.0D，實(shí)驗(yàn)眼與自身對(duì)照眼（t=-14.832，P=0.000）及正常對(duì)照眼（t=-16.123，P=0.000）相比均產(chǎn)生明顯的近視。眼軸長(zhǎng)度增長(zhǎng)了21±13μm，實(shí)驗(yàn)眼與自身對(duì)照及正常對(duì)照相比組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.437，P=0.012；t=7.812，P=0.002）。形覺(jué)剝奪前后各組的實(shí)驗(yàn)眼、自身對(duì)照眼和正常對(duì)照眼屈光狀態(tài)和眼軸長(zhǎng)度的變化見(jiàn)表1。

2.2各組小鼠光鏡下鞏膜的改變 小鼠正常眼后極部各層組織HE染色見(jiàn)圖1，可以觀察到小鼠鞏膜成纖維細(xì)胞核染成藍(lán)紫色，呈長(zhǎng)梭型，細(xì)胞外基質(zhì)為粉紅色，對(duì)照眼鞏膜自赤道部向后極部鞏膜逐漸增厚，而實(shí)驗(yàn)眼缺乏這種特征。各組小鼠眼后極部結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2，形覺(jué)剝奪21d時(shí)，可以觀察到實(shí)驗(yàn)眼分別與自身對(duì)照眼及正常眼相比較鞏膜變薄，成纖維細(xì)胞排列紊亂；形覺(jué)剝奪28d后，實(shí)驗(yàn)眼分別與自身對(duì)照眼及正常眼相比較可以觀察到鞏膜變薄，膠原纖維紊亂、粗細(xì)不均，成纖維細(xì)胞之間的間隙變大。

2.3各組小鼠免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 BMP-2陽(yáng)性蛋白表達(dá)于正常小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、內(nèi)核細(xì)胞層、外核細(xì)胞層、內(nèi)外節(jié)細(xì)胞及鞏膜細(xì)胞的胞漿中，呈棕黃色顆粒狀，胞核呈現(xiàn)藍(lán)色。成纖維陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)胞漿染成深棕色，染色明顯。在小鼠形覺(jué)剝奪21d后BMP-2表達(dá)逐漸下調(diào)，胞漿著色減弱；形覺(jué)剝奪28d后，成纖維細(xì)胞著色最淺。用圖像分析軟件Image proplus6.0檢測(cè)BMP-2蛋白表達(dá)的強(qiáng)度，用平均光密度值表示（表2），其值越大說(shuō)明染色越深，BMP-2蛋白表達(dá)越高；反之表示染色越淺，說(shuō)明BMP-2蛋白表達(dá)量小。形覺(jué)剝奪21d實(shí)驗(yàn)眼分別與自身對(duì)照眼及正常對(duì)照眼相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-4.461，P= 0.012；t=-5.521，P=0.007），隨著形覺(jué)剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)，形覺(jué)剝奪28d實(shí)驗(yàn)眼染色越淺，與自身對(duì)照眼及正常眼相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-9.907，P=0.000；t=-8.025，P= 0.000，圖3）。

2.4各組小鼠鞏膜BMP-2 mRNA的表達(dá) 根據(jù)熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，各組鞏膜組織均有BMP-2 mRNA的表達(dá)。形覺(jué)剝奪21d后，可觀察到實(shí)驗(yàn)眼BMP-2 mRNA的表達(dá)量為0.432±0.041，與自身對(duì)照組（0.872± 0.032）和正常對(duì)照組（0.913±0.026）相比，BMP-2 mRNA的表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-4.465，P= 0.016；t=-4.827，P=0.011）。近視誘導(dǎo)28d時(shí)，實(shí)驗(yàn)眼BMP-2 mRNA表達(dá)量為0.376±0.025，與自身對(duì)照組（0.926±0.013）和正常對(duì)照組（0.972±0.016）相比明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-5.179，P=0.009；t=-7.016，P= 0.002；圖4）。3討論

在眼球正常發(fā)育過(guò)程中，鞏膜成纖維細(xì)胞及其分泌的I型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)成分共同構(gòu)成細(xì)胞外壁，維持眼球組織完整并決定眼軸長(zhǎng)度［7］。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物模型眼典型的鞏膜改變是厚度變薄，這種減少主要是膠原蛋白I合成減少、蛋白聚糖降解增加共同造成的，Ⅲ型膠原和Ⅳ型膠原的含量并不受影響，這種改變導(dǎo)致鞏膜膠原纖維組成成分的改變，而后者直接影響膠原纖維直徑，是小直徑的膠原纖維增加的原因，本研究發(fā)現(xiàn)形覺(jué)剝奪后鞏膜較對(duì)側(cè)眼變薄，膠原纖維排列紊亂，粗細(xì)不均，間隙變大，以形覺(jué)剝奪4wk尤為明顯，可能由于FDM眼膠原纖維合成的紊亂而新的膠原纖維又尚未生成，成纖維細(xì)胞密度降低，鞏膜變薄，引起鞏膜生物力學(xué)特性的改變，最終導(dǎo)致眼軸的延長(zhǎng)。

以往大量的研究證明，近視的發(fā)生是大量異常信息的作用下，視網(wǎng)膜上的信號(hào)直接到達(dá)鞏膜，發(fā)生近視，然而胡誕寧等［8］將已知有關(guān)近視的生長(zhǎng)因子、激素和神經(jīng)傳遞因子同人類視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，上述細(xì)胞含有幾乎所有的受體，據(jù)此可以推測(cè)是由視網(wǎng)膜將信號(hào)傳遞給色素上皮和脈絡(luò)膜，由其再產(chǎn)生下一級(jí)活性物質(zhì)（二級(jí)信號(hào)），再作用于鞏膜。

圖2　各組小鼠鞏膜HE染色圖片（×400） A:形覺(jué)剝奪21d自身對(duì)照眼；B:形覺(jué)剝奪21d實(shí)驗(yàn)眼；C:21d正常對(duì)照眼；D:形覺(jué)剝奪28d自身對(duì)照眼；E:形覺(jué)剝奪28d實(shí)驗(yàn)眼；F:28d正常對(duì)照眼。

圖3　各組小鼠免疫組織化學(xué)染色圖片（×400） A:FDM 21d組自身對(duì)照眼；B:FDM 21d組實(shí)驗(yàn)眼；C:FDM 28d組自身對(duì)照眼；D:FDM 28d組實(shí)驗(yàn)眼。

圖4　各組C57BL/6小鼠鞏膜中BMP-2 mRNA的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)眼分別與自身對(duì)照眼及正常眼比較，P＜0.05。

現(xiàn)認(rèn)為，TGF-β介導(dǎo)的鞏膜成纖維細(xì)胞的激活是發(fā)生鞏膜重塑的重要原因［9-11］。而BMPs是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）超家族最大的成員，能夠調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，是TGF-β家族中多效的調(diào)節(jié)因子，本研究發(fā)現(xiàn)B6小鼠視網(wǎng)膜和鞏膜中均存在BMP-2，F(xiàn)DM眼視網(wǎng)膜和鞏膜中BMP-2表達(dá)量明顯下降，表明BMP-2在鞏膜重塑過(guò)程中起到重要作用。

BMP-2是肝素結(jié)合型細(xì)胞因子，在角膜中能調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的凋亡［12］，在體外細(xì)胞培養(yǎng)中，BMP-2能促進(jìn)鞏膜成纖維細(xì)胞增殖，并呈劑量依賴性［13］。王青等［14］發(fā)現(xiàn)BMP-2在豚鼠的后鞏膜中有表達(dá)，并且FDM眼后鞏膜部的BMP-2表達(dá)明顯下降。本研究發(fā)現(xiàn)BMP-2在C57BL/6小鼠的視網(wǎng)膜和鞏膜中均有表達(dá)，并呈下降趨勢(shì)。提示BMP-2可能是近視的相關(guān)信號(hào)因子，參與了鞏膜重塑的過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)與其他實(shí)驗(yàn)不同的是:本實(shí)驗(yàn)首次驗(yàn)證了小鼠的視網(wǎng)膜和鞏膜中存在BMP-2，而且采用小鼠作為近視模型，最大的優(yōu)點(diǎn)是小鼠的基因表達(dá)譜明確，和人類基因有90%基因同源，其眼球的cDNA文庫(kù)同人類的極其相似，這就為今后在分子和基因水平研究近視提供了模型基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)中，我們參考Wu等［15］的實(shí)驗(yàn)方法，采用給小鼠佩戴眼罩的方法誘導(dǎo)近視模型，用離體測(cè)量的方法測(cè)量小鼠的眼軸長(zhǎng)度，褚仁遠(yuǎn)等已經(jīng)用離體測(cè)量眼軸長(zhǎng)度的方法說(shuō)明了形覺(jué)剝奪眼眼軸隨著遮蓋時(shí)間的延長(zhǎng)而延長(zhǎng)，證明了小鼠眼軸長(zhǎng)度離體測(cè)量的可行性［16-18］。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)的剝奪眼和自身對(duì)照眼均趨向近視方向發(fā)展，我們認(rèn)為可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的光照引起的，Zhou等［19］將B6小鼠給予不同的光照時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)光照時(shí)間最長(zhǎng)的小鼠更易發(fā)生軸性近視。吳曉敏等用13d的C57BL/6小鼠按照黑暗/光照周期分為18/6，12/12，6/12組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠眼球向近視方向發(fā)展，晶狀體變薄，玻璃體腔變長(zhǎng)，后極部鞏膜直徑變小，又將小鼠分別置于光照強(qiáng)度為125、250、375Lu條件下飼養(yǎng)14d后發(fā)現(xiàn)，光照強(qiáng)度不會(huì)影響小鼠眼球正常的屈光發(fā)育，然而這與國(guó)外學(xué)者的研究不相符。Karouta等［20］研究發(fā)現(xiàn)，形覺(jué)剝奪近視小雞分別用15 000Lu和500Lu照射，近視程度呈明顯降低趨勢(shì)。目前光照的強(qiáng)度和屈光狀態(tài)之間的關(guān)系目前仍不確定，有待進(jìn)一步的研究。

另外，在本研究發(fā)現(xiàn)以往小鼠造模過(guò)程中，大多采用8%水合氯醛（40mg/kg）麻醉小鼠。然而水合氯醛可以引起小鼠晶狀體混濁，這種混濁可能與小鼠眼球外突、眼瞼不能閉合和角膜干燥有關(guān)［21］，然而在近視造模的整個(gè)階段，需要晶狀體和角膜保持透明，以檢測(cè)小鼠剝奪前和剝奪后雙眼的屈光狀態(tài)，因此水合氯醛不適合用于小鼠近視模型的制備。而枸櫞酸芬太尼具有鎮(zhèn)痛的作用［22］，我們采用5%枸櫞酸芬太尼注射液以4mg/kg麻醉小鼠后，可以達(dá)到較好的效果，能夠順利完成小鼠造模過(guò)程，并且不會(huì)引起小鼠晶狀體混濁、角膜干燥等。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜和鞏膜中均存在BMP-2，并且小鼠形覺(jué)剝奪眼中鞏膜BMP-2呈下降趨勢(shì)，提示BMP-2可能參與了FDM后鞏膜重塑過(guò)程，但其信號(hào)通路的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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Role of bone morphogenetic protein-2 in scleraremodelingofformdeprivation myopic eyes in C57BL/6 mice

Yu Zhang，Xian Yang，Li-Ping Jiang，Gui-Bo Liu，Shuang-Shuang Wang

s:the National Natural Science Foundation of China（Youth Foundation，No.81300790）；Natural Science Foundation of Shangdong Province（No.BS2010SF009）

2015-12-11 Accepted:2016-02-25

C57BL/6mice；bonemorphogenetic protein-2；form-depriviation myopia；sclera

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 81300790）；山東省自然基金項(xiàng)目（No.BS2010SF009）

（266003）中國(guó)山東省青島市，青島大學(xué)附屬醫(yī)院眼科作者簡(jiǎn)介:張玉，女，在讀碩士研究生，研究方向:小兒斜視與弱視。

楊先，博士，副教授，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向:視光學(xué)與斜視弱視.yangxian_zhao@126.com

2015-12-11

2016-02-25

Zhang Y，Yang X，Jiang LP，et al.Role of bone morphogenetic protein-2 in sclera remodeling of form deprivation myopic eyes in C57BL/6 mice.Guoji Yanke Zazhi（Int Eye Sci）2016；16（3）:423-427

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.3.05