周中興+潘娜娜+譚麗娟

【摘要】目的 探討鹽酸法舒地尓對大鼠主動脈球囊損傷術后血管內(nèi)膜增生的影響，并測定血清中IL-8、TGF-β1濃度及TGF-β1在血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的表達情況。方法 選取SD大鼠40只，隨機分為對照組8只、手術組16只、藥物組16只，手術組和藥物組給予左頸動脈切口，并2 F球囊導管插管行主動脈內(nèi)膜損傷，手術組給予NS（0.5 ml/100 g/bid），藥物組給予鹽酸法舒地尓（0.5 mg/100 g/bid）腹腔注射，分別于損傷后14天、28天取大鼠主動脈血管標本，HE染色觀察各組增殖血管內(nèi)膜形態(tài)學變化，并測量新生內(nèi)膜面積（IA）、中膜面積（MA）、內(nèi)膜厚度（IT）、中膜厚度（MT）、內(nèi)膜面積/中膜面積比值（IA/MA），觀察大鼠血管內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生情況。并用ELISA法檢測血清中IL-8、TGF-β1的濃度，并免疫組化檢測TGF-β1在損傷后血管新生內(nèi)膜及中膜的表達情況。結果 對照組血管內(nèi)膜為扁平的內(nèi)皮細胞，中層為梭形平滑肌細胞的排列，內(nèi)膜光滑，未見平滑肌細胞增生及增殖情況。手術組球囊損傷后14天內(nèi)膜增生明顯，其IA、MA、IT、MT、IA/MA顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），至28天內(nèi)膜繼續(xù)增生。藥物組在14天內(nèi)膜增生明顯，內(nèi)膜及中膜面積及厚度的測量值顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。28天后藥物組內(nèi)膜增厚較14天時減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與手術組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。至14天時兩損傷組IL-8、TGF-β1在血漿中檢測出，而藥物組14天時血漿中可檢測到IL-8、TGF-β1相比手術組減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），至28天時手術組仍可檢測到IL-8、TGF-β1較14天時減少。至28天藥物組上述血清中的濃度較14天時減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與手術組相比減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。并14天時藥物組TGF-β1在新生內(nèi)膜及中膜可見表達，與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而28天時表達量相比模型組減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 鹽酸法舒地尓可有效抑制大鼠主動脈球囊損傷術后主動脈內(nèi)膜的增生及增殖，從而減少管腔面積的丟失，可能與其抑制早期炎癥因子IL-8及轉(zhuǎn)化生長因子-β1的表達有關。

【關鍵詞】鹽酸法舒地尓；球囊損傷；動脈內(nèi)膜；IL-8；TGF-β1

【中圖分類號】R285.5 【文獻標識碼】B 【文章編號】ISSN.2095-6681.2016.08.0.04

隨著經(jīng)皮冠狀動脈血管成形術的廣泛開展，不僅降低了冠心病，特別是急性心肌梗死患者的近期死亡率，而且改善了長期預后。而術后再狹窄的發(fā)生率嚴重影響了其遠期療效，多數(shù)研究認為術后的炎癥反應及中膜平滑肌細胞的遷移、增殖不僅參與了早期血栓事件的發(fā)生，更是參與了后期血管病理性重構和慢性縮窄的過程[1]。雖然冠狀動脈支架植入術可以抑制動脈血管的彈性回縮，改善血管壁的重塑，從而使再狹窄率降低，但另一方面它卻有增加血管壁損傷和血栓形成的危險，尤其是血管內(nèi)皮的損傷進一步加重了炎癥反應，纖維層的斷裂導致血管壁中層平滑肌細胞過度增殖并向內(nèi)膜遷移，血管新生內(nèi)膜形成導致再狹窄。因此早期抑制炎癥反應及中膜的病理性重構、重塑過程成為預防術后再狹窄的有效措施。IL-8是早期炎癥反應所釋放的重要因子，轉(zhuǎn)化生長因子β1是一組新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細胞生長、分化、免疫的TGF-β超家族，是多種細胞損傷后早期表型轉(zhuǎn)化及增殖的始動因子。Rho激酶為Rho蛋白下游作用底物，主要發(fā)揮信息傳導和分子開關作用。最早應用于蛛網(wǎng)膜下腔出血引起的腦血管痙攣，改善局部腦動脈循環(huán)的功能，而其在心血管領域的應用得到廣泛證實，特別是在冠狀動脈痙攣、心肌梗死、再狹窄、心力衰竭方面[2]。本文通過鹽酸法舒地尓對于大鼠主動脈球囊損傷術后主動脈內(nèi)膜增殖及對IL-8、TGF-β1表達的影響，旨在探討法舒地尓防治血管再狹窄的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（400±50）g購自青島市動物實驗中心。鹽酸法舒地尓（天津紅日制藥，30 mg/2 mL）；2.0 F自制球囊導管；高清彩色像分析系統(tǒng)（HPIA2000）（美國Beckman Coulter公司）；表達的免疫組化染色檢測試劑盒（北京碧云天生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立及實驗分組

40只SD大鼠分為3組：正常對照組（n=8）；手術組（主動脈球囊損傷術+腹腔注射NS 0.5 ml/100 g/Bid，n=16）；法舒地尓組（HF球囊損傷+腹腔注射鹽酸法舒地尓0.5 mg/100 g/Bid，n=16）。

1.2.2 大鼠主動脈內(nèi)膜損傷模型的建立

將大鼠用將大鼠以3%的水合氯醛（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，做頸部長約2 cm正中切口，鈍性分離左側(cè)頸總動脈，遠心端用絲線結扎，近心端用無創(chuàng)動脈夾夾閉，在兩端間剪一小口，從切口向近心端緩慢插入球囊導管（2 F，球囊長度2 cm），深度約10～12 cm至髂動脈分叉處，以0.15～0.2 mL生理鹽水充盈球囊，回拉球囊并旋轉(zhuǎn)導管至左頸總動脈分叉處，反復抽拉6次以確保充分剝脫內(nèi)皮，拔出球囊導管，結扎血管，逐層縫合切口，術后3天給予青霉素20萬IU/100 g腹腔注射，并常規(guī)飼養(yǎng)至處死，采用HE免疫組化染色，光鏡觀察球囊損傷大鼠頸動脈使動脈血管內(nèi)膜剝脫，判斷模型建立成功。

1.2.3 增殖血管內(nèi)膜面積測定

分別于球囊損傷后14天、28天取對照組4只及損傷組各6只大鼠腹腔注射過量的水合氯醛，左側(cè)腹部切口5～7 cm，鈍性分離并游離主動脈，腎動脈分叉處逆行分離至主動脈根部，插管用生理鹽水灌洗胸腹主動脈。留取主動脈標本組織2 cm左右，用4%中性多聚甲醛溶液固定24 h的主動脈組織標本，常規(guī)按石蠟切片制作程序（固定、脫水、透明及包埋處理），然后切片脫蠟后，進行HE染色。隨機選取5個視野，光鏡下觀察新生內(nèi)膜增生情況，圖像分析系統(tǒng)測定IA、MA、MA、IT、IA/MA。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清IL-8、TGF-β1濃度

分別于術后14天、28天，制取主動脈組織前，大鼠摘除眼球取血（采集前動物禁飲食8 h），送本院檢驗科，ELISA法測定血漿中IL-8、TGF-β1的濃度，具體操作步驟按照ELISA檢測試劑盒的說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學處理

以SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。計量資料以“x±s”表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 主動脈標本組織病理學形態(tài)及定量分析

手術組及藥物組（HF）在術中及術后有2只大鼠死亡，考慮與術中動脈夾層、麻醉藥過量及術后長期腹腔注射，大鼠長期處于應激狀態(tài)，導致進食減少引起。各組主動脈標本組織病理學見圖1、圖2、圖3。14天后手術組及HF組大鼠主動脈內(nèi)膜增生明顯，其IA、MA、MA、IT、IA/MA相比于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。手術組與HF組之間，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。至28天時手術組內(nèi)膜繼續(xù)增生，藥物組IA、MA、MA、IT、IA/MA指標的改善相比14天時，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與手術組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

14天后血清中IL-8、TGF-β1在手術組及HF組可檢測出。IL-8在HF組血漿中少于手術組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。至28天血清中IL-8在HF組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；TGF-β1在手術組仍持續(xù)檢測出，

3 討 論

彌漫性的血管內(nèi)皮功能障礙參與了冠心病的發(fā)生、發(fā)展的全過程[3]，特別對于急性冠脈綜合癥（acute coronary syndrome ACS）。PTCA及支架植入術雖可迅速改善患者的冠狀動脈血供，緩解癥狀，但術后誘發(fā)的血管壁損傷和炎癥反應[4]，將加速病變的進展。目前認為冠狀動脈支架置入對動脈壁損傷導致血管內(nèi)皮細胞損傷，血小板聚集，促進炎癥的發(fā)生，加重了病變部位的內(nèi)皮功能損害。炎性細胞和內(nèi)皮細胞及血小板又可釋放大量的細胞因子促使血管平滑肌增殖和遷移，影響患者遠期預后[5]。本實驗中球囊損傷術后14天主動脈內(nèi)膜鏡下面積、中膜面積、內(nèi)膜厚度、中膜厚度、內(nèi)膜面積/中膜面積相比對照組增加顯著，從而導致管腔面積的早期丟失。至28天時鏡下觀察到手術組內(nèi)膜面積持續(xù)丟失，病理性重塑機制導致管腔進一步狹窄，與既往研究一致。

Rho激酶是最早發(fā)現(xiàn)、也是目前研究較為清楚的一個小G蛋白RhoA的下游效應器。以兩種同源性極高的異構體存在：ROCKI（ROCKα炎癥反應過程）和ROCKII（ROCKβ血管平滑肌細胞）。ROCK的激活可在分子及細胞水平參與血管損傷后的炎癥反應及內(nèi)膜的增生、增殖過程。ROCK的激活可使一氧化氮合酶的表達下調(diào)，內(nèi)皮細胞來源的NO在調(diào)節(jié)血管張力、抑制血小板聚集、平滑肌細胞增殖和防止白細胞向血管壁的粘附等過程中發(fā)揮重要作用。法舒地爾（fasudil，F(xiàn)as）是第一個也是惟一應用于臨床的Rho激酶抑制劑，主要用于治療蛛網(wǎng)膜下腔出血所致的腦血管痙攣及相關的神經(jīng)系統(tǒng)缺血癥狀。在許多已開展的臨床前期研究中，發(fā)現(xiàn)法舒地爾對包括冠狀動脈痙攣、高血壓、肺動脈高壓、冠脈再通手術后的再狹窄和AS在內(nèi)的多種心血管疾病均有良好的治療作用和較高的安全性。研究證實，IL-8在心血管介入手術后無菌性炎癥反應中參與了眾多細胞因子的激活及趨化，是冠脈介入術后心臟事件強有力的預測因子[6]。本研究表明大鼠主動脈球囊損傷后血清中早期炎癥反應的發(fā)生，并測得早期應用法舒地尓可有效抑制早期炎癥反應的程度，減輕血管內(nèi)膜內(nèi)皮的損傷，并進一步抑制后續(xù)炎癥反應的進程，可能是其預防術后急性血栓事件及再狹窄的機制之一。

綜上所述，鹽酸法舒地尓（hydroxy fasudil HF）可有效抑制主動脈損傷術后管腔面積的丟失，預防術后再狹窄的發(fā)生[7]，而抑制早期炎癥因子IL-8及TGF-β1的產(chǎn)生與表達可能是其機制之一。究其分子機制及長期用藥效果還有待進一步研究，但可為冠脈介入治療術后再狹窄的防治提供新的依據(jù)，使鹽酸法舒地尓的臨床應用范圍更加廣泛。

參考文獻

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本文編輯：孫春宇