任 琴，雷思佳，付秋霞，戴少波，蔡妍琳

（深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳 518055）

中華鱉胚胎發(fā)育的觀察及溫度對胚胎發(fā)育速度的影響*

任 琴，雷思佳*，付秋霞，戴少波，蔡妍琳

（深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳 518055）

以中華鱉為研究對象，在溫度為25℃、29℃、31℃、32℃和32.5℃，相對濕度75%~90%的孵化環(huán)境下，從第8天開始連續(xù)解剖并觀察了各溫度組胚胎發(fā)育的過程，列出孵化溫度29℃時的胚胎發(fā)育分期，根據(jù)受精卵胚胎日齡及胚胎形態(tài)特征變化，將整個胚胎發(fā)育過程分為26期，以頭部、四肢、背甲及腹甲的變化作為主要分期依據(jù).同時比較了不同孵化溫度下中華鱉胚胎發(fā)育的速度，結(jié)果表明，25℃不利于受精卵的存活，在上述溫度范圍內(nèi)孵化速度隨孵化溫度的升高而加快.

中華鱉；胚胎發(fā)育；分期；孵化溫度

大多數(shù)龜鱉目動物都具溫度依賴型性別決定（temperature-dependent sex determination，TSD）[1-5]，孵化溫度是影響受精卵胚胎發(fā)育的重要環(huán)境因子.對不同發(fā)育階段的胚胎進(jìn)行分期，不僅為中華鱉繁育研究提供極具價值的信息，更是性別分化研究的基礎(chǔ).國內(nèi)外關(guān)于龜鱉類胚胎發(fā)育的研究均有報道，其中對龜類的相關(guān)研究相對較多，如擬鱷龜（Chelydra serpentine）[6]、西部錦龜（Chrysemys Picta bellii）[7]、綠海龜（Chelonia mydas）[8]、黃喉擬水龜（Mauremysmutic cacantor）[9]、烏龜（Chinemys Reevesii）[10]、中華條頸龜（Mauremys sinensis）[11]等，而對鱉類的相關(guān)研究缺乏系統(tǒng)的研究.

中華鱉（Trionyx sinensis）隸屬爬行綱（Reptilia）、龜鱉目（Testudinata）、鱉科（Trionychidae）、鱉屬（Pelodiscus），是我國名貴的食用水產(chǎn)動物[12]，其營養(yǎng)豐富可以入藥，在國內(nèi)外市場上十分暢銷.本項目以中華鱉作為研究對象，對其胚胎發(fā)育過程及胚胎形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行詳細(xì)描述，同時記錄溫度對其胚胎發(fā)育速度的影響，以期為中華鱉的繁育以及性別分化研究提供數(shù)據(jù)參考，同時為中華鱉定向育種提供可靠的技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用中華鱉受精卵于2015年7月至8月購自湖南省漢壽中華鱉養(yǎng)殖基地，選取個體較大，受精斑完整且明顯的受精卵進(jìn)行孵化實驗.

1.2 受精卵孵化管理條件

受精卵的孵化在恒溫恒濕箱（美國，Thermo Fisher 3949，溫度控制精度±0.1℃）中進(jìn)行，實驗設(shè)置了5個孵化溫度：25℃、29.0℃、31.0℃、32℃和32.5℃.本實驗采用裸孵的方式進(jìn)行，將受精卵懸空架于管架上并將管架放置在盛有少量水的盆中，相對濕度為75%~90%.

1.3 受精卵外觀觀察及胚胎固定

在整個孵化過程中觀察受精斑的變化情況，通過光照觀察血絲的變化情況并拍照記錄.因孵化第1周時相變化很快，且胚胎太小無法對其肉眼觀察進(jìn)行準(zhǔn)確判斷，故孵化第1周并未進(jìn)行胚胎采樣.從孵化第8天開始每天取數(shù)枚受精卵參考文獻(xiàn)[9]和文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行固定，各期取出的胚胎用Bouin’s液固定17~24h后用70%的酒精保存.

2 結(jié)果

2.1 中華鱉胚胎發(fā)育的分期及依據(jù)

主要參考文獻(xiàn)[6]的研究結(jié)果對中華鱉的發(fā)育時相做了重新定義，Yntema提出的龜發(fā)育時相劃分標(biāo)準(zhǔn)是目前國際上引用最多的龜時相劃分標(biāo)準(zhǔn).根據(jù)胚胎日齡及胚胎形態(tài)特征變化將整個胚胎發(fā)育過程分為26期，主要以頭部、四肢、背甲及腹甲的變化作為分期依據(jù).

受精卵在29℃孵化溫度下的發(fā)育過程如下：

第11期（第8天）:胚體細(xì)長稍彎曲，肢芽已出現(xiàn)，眼睛黑色素覆蓋不完全.

第12期（第9天）：胚體加粗，彎曲幅度加大，肢芽更明顯，眼睛仍未完全黑亮.

第13期（第10天）：胚體呈最大幅度彎曲，肢芽明顯可見；頭部較大，頭突明顯，眼睛黑亮；尾部完全向腹側(cè)彎曲蜷縮；胚體內(nèi)血管較豐富，心跳活躍.

第14期（第12天）：胚體開始拉伸變粗，肢芽明顯可見，指板開始形成；背甲雛形開始出現(xiàn)；尾部向腹側(cè)蜷縮一直持續(xù)到18期.

第15期（第14天）：背甲出現(xiàn)，其長度約占胚體線軸的1/3；指板發(fā)育良好，外周平滑不存在指間凹槽；吻突出現(xiàn)；部分腸道穿過體壁突出體外.

第16期（第16天）：背甲變大，隱約可見背甲肋紋，腹甲雛形開始出現(xiàn)；指板較大，外周平滑出現(xiàn)輕微的指間凹槽；上顎突出較明顯，下顎末端到達(dá)晶狀體水平；腸道突出體外一直持續(xù)到22期.

第17期（第18天，圖1-17）：背甲長度約占胚體線軸的1/2，背甲肋紋明顯，約8對，脊柱明顯并有輕微色素沉積，裙邊開始出現(xiàn)；腹甲形成更明顯；指板四周出現(xiàn)輕微鋸齒狀突起，頭部小于身體部分，眼睛大而突出，下顎末端到達(dá)眼睛前端水平，鼻突出現(xiàn).

第18期（第20天，圖1-18）：背甲變寬大，其長度超過胚體線軸的1/2，背甲肋紋明顯8對，脊柱明顯且色素沉積更多，裙邊明顯，將尾部全部蓋住；腹甲形成更明顯；四肢可自由擺動并伴有輕微色素沉積，足趾突出使得指板四周鋸齒狀突起更深；頭部小于身體部分，眼睛大而突出，下眼瞼出現(xiàn)，下顎末端延伸遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出眼睛前端水平，鼻突明顯；由于腹甲的良好的形成逐漸遮擋了心臟的跳躍情況.

第19期（第23天，圖1-19）：背甲約占胚體線軸2/3，脊柱色素沉積更明顯，裙邊明顯，尾部不再向腹側(cè)蜷縮；腹甲形成良好；四肢色素沉積加深，內(nèi)側(cè)兩個足趾已完全獨立張開，外側(cè)三個足趾仍以蹼狀相連，且足趾細(xì)長明顯；頭部小于身體部分，脖子可自由伸縮，眼睛大而突出，下眼瞼還未到達(dá)晶狀體水平.

第20期（第26天，圖1-20）：背甲長度約占胚體線軸的3/4，背甲色素沉積明顯并出現(xiàn)輕微的類似白斑狀花紋，裙邊明顯，尾部可擺動；腹甲形成更明顯；四肢靈活可自由擺動且色素沉積加深；頭部顯著小于身體部分，脖子自由伸縮明顯有力，隨著上下眼瞼的生長，眼睛突出不再明顯，眼睛沿脖頸方向及兩眼之間的皮膚上出現(xiàn)一條較淺的黑色條紋，下眼瞼到達(dá)晶狀體水平；鼻突明顯并向上翹起.

第21期（第29天，圖1-21）：背甲色素沉積明顯增加，類似白斑狀的花紋明顯；腹甲形成完好；四肢明顯伸長變粗，靈活可自由擺動，四肢內(nèi)側(cè)背部出現(xiàn)皮膚褶皺，色素沉積加深，內(nèi)側(cè)三趾末端出現(xiàn)白色指甲，標(biāo)志著爪子的形成；眼睛沿脖頸方向及兩眼之間的皮膚上的黑色條紋明顯加深，下眼瞼可越過晶狀體水平；鼻突明顯向前突出且出現(xiàn)明顯對稱結(jié)構(gòu).

第22期（第32天，圖1-22）：背甲長度約占胚體線軸的4/5，背甲色素沉積明顯增加但還并沒有接近黑色，四肢內(nèi)側(cè)背部出現(xiàn)皮膚褶皺增加，色素沉積加深，爪子更為粗長而明顯；脖子自由伸縮明顯有力，眼睛逐漸被眼瞼覆蓋而表現(xiàn)的不再突出；卵黃逐漸被胚體吸收，其大小與胚體相當(dāng).

第23期（第36d，圖2-23）：背甲白斑開始消失，黑色斑點出現(xiàn)，隨著背甲色素沉積的增多肋骨已看不見，腹部肚臍處腸道已縮回體內(nèi)只殘留卵黃囊；四肢明顯變粗伸長且有力，可爬行，內(nèi)側(cè)背部皮膚褶皺加深，色素沉積加深；眼睛上下眼瞼可完全閉合；與22期相比個體增大約1/2，整體很靈活，并可自行翻轉(zhuǎn)身體，身體稍大于卵黃大小.

圖1 胚胎分期（第17~22期）

第24期（第40d，圖2-24）：身體整體的色素加深，背甲上之前的白斑已基本消失，黑色斑點明顯，肋骨已看不見；臍突出并包含部分卵黃囊，卵黃逐漸被吸收進(jìn)體內(nèi)；整體非常靈活，身體明顯大于卵黃大小.

第25期（第44d，圖2-25）：形態(tài)特征與孵出的稚鱉基本一致，僅存少量卵黃未被吸收，個別胚胎已開始提前孵出.

第26期（第48d，圖2-26）：出殼：稚鱉頭部以及前肢撐破卵殼，卵黃全部被吸收，腹甲下方留下一個較小的臍孔，但也有少數(shù)個體殘留相對較小的卵黃囊.

圖2 胚胎分期(第23~26期)

2.2 溫度對中華鱉胚胎發(fā)育速度的影響

本實驗共設(shè)置5個孵化溫度：25℃、29℃、31℃、32℃和32.5℃，從第8天開始每天取數(shù)枚受精卵進(jìn)行受精卵外觀及胚胎外觀觀察，判斷發(fā)育時相并記錄相應(yīng)的孵化日齡，各溫度下受精卵胚胎發(fā)育分期見圖3.25℃環(huán)境下受精卵孵化至第42天（第21期）時已全部死亡；孵化溫度為29℃時受精卵孵化最短用時45 d，最長用時61 d；31℃環(huán)境下受精卵孵化最短用時42 d，最長用時58 d；32℃環(huán)境下受精卵孵化最短用時40 d，最長用時57 d；32.5℃環(huán)境下受精卵孵化最短用時39 d，最長用時53 d.結(jié)果表明，溫度過低受精卵無法存活，而高溫能加快中華鱉的胚胎發(fā)育速度.同時從圖3可以看出，胚胎發(fā)育前期不同孵化溫度下的時相差異并不明顯，而在胚胎發(fā)育至第18期以后，差異逐漸加大.

圖3 溫度對中華鱉胚胎發(fā)育速度的影響

3 討 論

3.1 關(guān)于龜鱉類胚胎發(fā)育的分期與比較

目前國內(nèi)外已有不少關(guān)于龜鱉類胚胎發(fā)育分期的研究報道，但由于所采取的分期依據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)不同，將龜鱉類各個物種的分期期數(shù)分為23~31期不等.迄今為止，報道的分期標(biāo)準(zhǔn)主要有孵化胚胎日齡、胚胎大小、胚胎形態(tài)特征和/或內(nèi)部組織器官發(fā)生變化[7,8,10,12,15]，其中，文獻(xiàn)[6]關(guān)于龜發(fā)育時相的劃分方法被國際上公認(rèn)為時相劃分標(biāo)準(zhǔn).本實驗中，主要參考文獻(xiàn)[6]的分期方法，以受精卵外觀、胚胎日齡及胚胎形態(tài)特征變化為依據(jù)將中華鱉胚胎發(fā)育分為26期，但由于本項目是從孵化第8天開始取樣觀察，因此還有待進(jìn)一步完善中華鱉胚胎發(fā)育的整個過程.由于大多數(shù)溫度性別決定型的龜鱉類性別分化的敏感期在15期以后，本文提供了11~26期比較詳細(xì)的特征參數(shù)，為中華鱉性別分化及其性別調(diào)控研究提供了較為詳細(xì)的基礎(chǔ)資料.

已有研究表明，龜鱉類不同物種間的主要器官，如心臟、尾部、四肢、背甲和腹甲出現(xiàn)的先后順序均一致，但所需時間的長短不一，且在胚胎發(fā)育早期各器官發(fā)育同步性較高，而在胚胎發(fā)育中后期差異逐漸變大[6,7,9,13,14].另外，結(jié)合孵化過程中的孵化溫度、濕度及其他環(huán)境因子的影響，使得各物種間的胚胎發(fā)育分期不盡相同，給不同物種之間的比較研究帶來一定的困難.因此，Greenbaum[15]提出在胚胎發(fā)育過程中選擇易于觀察、相對明顯且保守的胚胎形態(tài)特征（如前肢變化）作為分期標(biāo)準(zhǔn)，可以更好地減少種間差異性.

3.2 溫度對胚胎發(fā)育的影響

孵化溫度是龜鱉類性別分化的重要環(huán)境影響因子[16]，同時也是影響其孵化進(jìn)程的重要因素.本實驗研究結(jié)果表明，低溫組（25℃）受精卵全部死亡，而隨著孵化溫度的升高，孵化時間逐漸減少，這與文獻(xiàn)[17-19]的研究結(jié)果基本一致.另外，從圖3可以看出各溫度下中華鱉胚胎發(fā)育分期在發(fā)育后期差異逐漸拉開，說明孵化溫度對中華鱉胚胎發(fā)育后期的影響更顯著.因此，了解溫度對中華鱉胚胎發(fā)育的影響，不僅為中華鱉性別分化研究奠定基礎(chǔ)同時對中華鱉養(yǎng)殖戶來說，通過人為控制孵化溫度，在不影響受精卵存活及孵化后稚鱉生長的情況下，可以合理調(diào)整孵化溫度，縮短孵化周期以獲得最大的經(jīng)濟(jì)效益.

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Observation on the Embryonic Development of Soft-shell Turtle Pelodiscus sinensis and the Effect of Incubation Temperature on Embryonic Development Speed

REN Qin, LEl Sijia*, FU Qiuxia, DAl Shaobo, CAl Yanlin

（School of Applied Chemistry and Biotechnology, Shenzhen Polytechnic, Shenzhen, Guangdong 518000, China）

The incubation experiment of Pelodiscus sinensis has been conducted under the temperature of 25℃, 29℃, 31℃, 32℃ and 32.5℃, with a relative humidity of 75%~90%. From the eighth day on, we dissected and observed the process of embryonic development continuously. When the incubation temperature was at 29℃, the embryonic development was divided into 26 stages according to the appearance of fertilized eggs, embryo daily age and morphological characters. Every stage was mainly determined by the changes of head, limbs, carapace and plastron. Comparing the speed of embryonic development at different temperatures, the result shows that it is not conducive for the fertilized eggs to survive at 25℃ and the hatching speed increases with the rising incubation temperature.

P. sinensis; embryonic development; stages; incubation temperature

S966.5

A

1672-0318（2016）01-0040-05

10.13899/j.cnki.szptxb.2016.01.009

2015-11-18

*項目來源：深圳市科信委（ZYA201007060092A）；深圳市科創(chuàng)委（CXZZ20130517145458599）；廣東大學(xué)生科技創(chuàng)新培育專項基金（pdjh2015b0779）資助項目

任琴（1989-），女，湖南岳陽人，理學(xué)碩士，助教，研究方向：水產(chǎn)動物生理學(xué).

*通訊作者：雷思佳（1964-），女，湖南津市人，理學(xué)博士，教授，研究方向：水產(chǎn)動物生理生態(tài)學(xué).