周先艷，樊 建，唐遠龍，莊永亮，孫麗平

（昆明理工大學(xué) 云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500）

羅非魚皮膠原蛋白水解產(chǎn)物的體外抗氧化活性和體內(nèi)抗衰老作用

周先艷，樊 建，唐遠龍，莊永亮，孫麗平*

（昆明理工大學(xué) 云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500）

對羅非魚皮膠原蛋白水解制備水解產(chǎn)物（tilapia skin gelatin hydrolysate，TSGH），分離得到3 個肽組分（TSGH-1、TSGH-2和TSGH-3），分析肽組分氨基酸組成，并對TSGH-3的體外抗氧化活性和體內(nèi)抗衰老能力進行評價。結(jié)果表明：TSGH-3的分子質(zhì)量低，疏水性氨基酸含量高，從自由基清除和金屬螯合兩個方面證實了TSGH-3具有很好的體外抗氧化活性。TSGH-3能顯著增加由D-半乳糖誘導(dǎo)衰老大鼠的血清、肝臟和腎臟組織的總抗氧化能力、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性，并且能顯著降低丙二醛的含量。此外，TSGH-3的攝入可以保護大鼠的肝臟和腎臟指數(shù)。因此，TSGH-3在抗氧化、抗衰老方面具有較好的應(yīng)用潛力。

羅非魚皮膠原蛋白水解產(chǎn)物；氨基酸組成；抗氧化活性；抗衰老

周先艷， 樊建， 唐遠龍， 等. 羅非魚皮膠原蛋白水解產(chǎn)物的體外抗氧化活性和體內(nèi)抗衰老作用［J］. 食品科學(xué)， 2016，37（15）: 221-226. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615037. http://www.spkx.net.cn

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自然衰老幾乎存在于所有生物體中，是一個極其復(fù)雜的過程［1］，隨著衰老程度的增加，會產(chǎn)生過多的活性氧（reactive oxygen species，ROS），并且減弱機體抗氧化防御系統(tǒng)。ROS的形成會引起細胞膜的損傷和DNA的氧化應(yīng)激。氧化性損傷會造成細胞損傷和凋亡，導(dǎo)致一些與年齡相關(guān)的慢性疾病惡化，包括阿爾茨海默癥、帕金森病、心臟病、動脈粥樣硬化、糖尿病等［2-3］，還有一些其他相關(guān)疾病，如氧化反應(yīng)導(dǎo)致老年癡呆患者大腦中生物小分子的積累［4］。因此，隨著世界老齡人口的增加，有關(guān)抗氧化和抗衰老的研究已經(jīng)成為熱點研究課題［5］。

膠原蛋白及其水解產(chǎn)物作為醫(yī)學(xué)和食品工業(yè)的原材料，由于其具有良好的生物活性、生物相容性和滲透性，并且對機體無刺激性，而被用作重要的活性成分［6］。膠原蛋白含有豐富的疏水性氨基酸，這些氨基酸使其具有更高的抗氧化活性。因此，膠原蛋白能夠用于提供天然的ROS清除肽［6］。

近期研究表明，魚皮具有易得到、污染少、無疾病傳播的風(fēng)險、無宗教障礙以及膠原蛋白產(chǎn)量高等特點，因而成為膠原蛋白的較好來源［7-8］。羅非魚（tilapia）屬于鱸形目麗魚科羅非魚屬，是世界上重要的淡水養(yǎng)殖魚類［9］。在過去的幾年中，羅非魚的生產(chǎn)量和加工量穩(wěn)步增長，并已成為領(lǐng)先出口的水產(chǎn)品之一。為了有效提高羅非魚皮的規(guī)模性應(yīng)用以及證實其抗氧化和抗衰老活性，在本研究中評價了羅非魚皮膠原蛋白水解產(chǎn)物（tilapia skin gelatin hydrolysate，TSGH）的體外抗氧化活性和體內(nèi)抗衰老能力及作用機制。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

羅非魚皮膠原蛋白水解產(chǎn)物（TSGH） 由昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院實驗室制備［10］。

Sephadex G-25 通用電氣醫(yī)療集團；乙腈（色譜純） 德國Merck KGaA公司；2，2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2’-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS） 美國Sigma公司；D-半乳糖 上海源聚生物科技有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物技術(shù)研究所。

1.2實驗動物

50 只6 周齡昆明雄性大鼠，體質(zhì)量為18～25 g，由安徽長臨河醫(yī)藥科技有限公司提供。

1.3儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（high performance liquid chromatograph，HPLC） 安捷倫科技有限公司；AL204型電子天平梅特勒-托利多（上海）有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市科析儀器有限公司；TU-1901紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限公司；TGL-20B高速臺式離心機上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.4實驗方法

1.4.1羅非魚皮膠原蛋白水解產(chǎn)物的純化

將凍干的TSGH粉末溶于蒸餾水中，使其質(zhì)量濃度為300 mg/mL，然后用蒸餾水平衡過的Sephadex G-25凝膠柱（Ф1.6 cm×80 cm）進行分離，洗脫液為蒸餾水，流速為0.5 mL/min，每6 min收集1 管，在220 nm波長處檢測吸光度。多次重復(fù)以上純化步驟至收集到的肽足夠進行后續(xù)實驗。

1.4.2氨基酸組成分析

將樣品用6 mol/L HCl在110 ℃條件下水解24 h后，采用HPLC方法測定氨基酸組成?？偟氖杷园被幔╰otal hydrophobic amino acids，THAA）含量以Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Cys和Met的總量進行計算。

1.4.3體外抗氧化活性測定

1.4.3.1羥自由基（·OH）清除能力的測定

采用莫開菊等［11］的方法：吸取1.0 mL樣品于10 mL離心管中，分別加入8.0 mmol/L FeSO4溶液0.3 mL，3.0 mmol/L水楊酸溶液1.0 mL以及20 mmol/L H2O2溶液0.25 mL，37 ℃水浴30 min，取出用流水冷卻至室溫后，加入0.45 mL純水，使最終體積為3.0 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液于510 nm波長處測吸光度，1 mL溶劑代替樣品作為對照組。以GSH為對照，比較樣品與其對·OH的清除效果。

式中：A0為蒸餾水+FeSO4+H2O2+水楊酸的吸光度；A1為加入樣品+FeSO4+H2O2+水楊酸的吸光度；A2為樣品+FeSO4+H2O2+水的吸光度。

1.4.3.2ABTS+·清除能力的測定

根據(jù)Re等［12］的方法進行測定。ABTS+·的制備方法為：5 mL 7 mmol/L ABTS與88 μL 40 mmol/L過硫酸鉀混勻后，室溫避光放置12～16 h，形成ABTS+·儲備液，然后用乙醇稀釋得到工作液，使得該工作液在30 ℃，734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02（乙醇調(diào)零），然后將該工作液在30 ℃條件下保溫備用。取0.5 mL樣品與ABTS+·儲備液混勻，10 s后30 ℃水浴6 min，于734 nm波長處測定吸光度。以水溶性維生素E（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）為對照，比較樣品與其對ABTS+·的清除效果。

式中：A對照為0.5 mL乙醇+4.0 mL ABTS+·工作液（0 min時）的吸光度；A樣品對照為0.5 mL樣品+4.0 mL乙醇的吸光度；A樣品為0.5 mL樣品+4.0 mL ABTS+·工作液的吸光度。

1.4.3.3Fe2+螯合活性的測定

根據(jù)Torres-Fuentes等［13］的方法進行測定，其方法為：3 mL樣品與0.1 mL的2 mmol/L FeCl2混勻，室溫放置5 min后加入0.2 mL 5 mmol/L Ferrozine試劑，振蕩混勻后室溫下放置30 min，于561 nm波長處測定吸光度。Fe2+螯合率計算見公式（3）。以乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）為對照，比較樣品與其對Fe2+的螯合效果。

式中：A對照為3.0 mL水+0.1 mL FeCl2+0.2 mL Ferrozine試劑的吸光度；A樣品對照為3.0 mL水+0.1 mL FeCl2+0.2 mL水的吸光度；A樣品為3.0 mL樣品+0.1 mL FeCl2+0.2 mL Ferrozine試劑的吸光度。

1.4.4體內(nèi)抗衰老能力的測定

1.4.4.1動物分組及處理

動物按標(biāo)準(zhǔn)認證的飲食和自來水進行飼養(yǎng)，并且在實驗前讓其有3 d時間適應(yīng)新環(huán)境。在本研究中，所有動物在黑暗的動物房里飼養(yǎng)12 h，溫度為18～21 ℃，相對濕度為45%～65%。為了減少污染，把大鼠飼養(yǎng)在干凈的籠子里，適應(yīng)環(huán)境3 d后，根據(jù)大鼠質(zhì)量將其分為5 組，每組10 只：對照組（CG）、D-半乳糖模型組（DG）、TSGH-3高劑量組（HG）、TSGH-3中劑量組（MG）和TSGH-3低劑量組（LG）。向DG、HG、MG和LG組的大鼠經(jīng)腹腔注射1 000 mg/（kg·d）的D-半乳糖，對照組（CG）腹腔注射相同體積的生理鹽水（0.9%）；LG、MG和HG組大鼠分別每天口腔灌喂50、100、150 mg/（kg·d）的TSGH-3（溶于2.0 mL蒸餾水中）；對照組（CG）和D-半乳糖（MG）組的大鼠經(jīng)口腔灌喂0.2 mL的生理鹽水（0.9%）。每周對大鼠稱質(zhì)量1 次，并按其質(zhì)量變化調(diào)整注射和灌喂的劑量。整個實驗過程為期45 d。

1.4.4.2不同組織抗氧化指數(shù)的測定

45 d后，對大鼠進行空腹處理，然后收集血液進行分離，并在5 ℃、2 000 r/min條件下離心血清15 min。收集肝臟和腎臟，用冰的生理鹽水洗掉血液，然后用濾紙吸掉上面的水分。用相應(yīng)的試劑盒測定血清、肝臟和腎臟的SOD和GSH-Px活性以及T-AOC和MDA水平。以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，按照試劑盒的操作說明，采用Lowry法測定蛋白濃度。

1.4.4.3臟器指數(shù)的測定

收集肝臟和腎臟，其臟器指數(shù)按照下式進行計算。

1.5數(shù)據(jù)分析

2　結(jié)果與分析

2.1純化肽的特征

用Sephadex G-25凝膠柱分離純化TSGH，收集到3 個主要的肽段，分別為TSGH-1、TSGH-2和TSGH-3，結(jié)果見圖1。根據(jù)凝膠分離的原理可知，3 個肽段的分子質(zhì)量大小為：TSGH-3＜TSGH-2＜TSGH-1。

圖1　Sephadex G-25凝膠柱分離活性組分的色譜圖Fig. 1 Chromatogram of bioactive fractions isolated by Sephadex G-25 gel column

每個肽段的氨基酸組成分析如表1所示，3 種肽段均富含Gly、Glu、Asp、Pro和Ala，而Cys、Met和Phe的含量較低，這和其他膠原蛋白水解產(chǎn)物類似。由表1可知，TSGH-3的疏水性氨基酸總量（32.09%）明顯高于TSGH-1（28.16%）和TSGH-2 （30.22%），表明TSGH-3具有較高的抗氧化活性。因此選用TSGH-3進行后續(xù)的實驗。

表1　TSGH肽段的氨基酸組成Table 1 Amino acid compositions of the fractions of TSGH‰

2.2體外抗氧化活性

由圖2可知，TSGH-3的·OH清除率隨其質(zhì)量濃度的增加而增大，其半抑制濃度（50% maximal inhibitory concentration，IC50）值為383.5 μg/mL。在質(zhì)量濃度為800 μg/mL時，TSGH-3和GSH的清除活性均達到最大，分別為74.8%和82.2%。

圖2　不同質(zhì)量濃度TSGH--33的·OHH清除活性Fig. 2 Hydroxyl free radical scavenging activity of TSGH-3 at different concentrations in vitro

2.2.2ABTS+·清除能力

圖3　TSGH-3在不同質(zhì)量濃度下的ABBTTSS+·清除能力Fig. 3 ABTS free radical scavenging activity of TSGH-3 at different concentrations in vitro

由圖3可知，與Trolox相比，不同質(zhì)量濃度的TSGH-3的ABTS+·清除能力，TSGH-3的活性低于Trolox，其清除活性隨樣品質(zhì)量濃度的增加而增大，成線性相關(guān)。TSGH-3對ABTS+·清除能力的IC50為132.4 μg/mL。

2.2.3Fe2+螯合能力

圖4　TSGH-3在不同質(zhì)量濃度下的FFee2+螯合能力Fig. 4 Fe2+-chelating ability of TSGH-3 at different concentrations in vitro

由圖4可知，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，F(xiàn)e2+螯合能力增大。在質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，TSGH-3和EDTA的螯合能力分別為81.2%和94.8%，證明了TSGH-3具有Fe2+螯合能力。

2.3TSGH-3的體內(nèi)抗氧化作用

2.3.1TSGH-3對大鼠不同組織中T-AOC的影響

表2　TSGH-3對大鼠不同組織中T-AOC活力的影響Table 2 Effect of TSGH-3 on T-AOC in different tissues of rats

如表2所示，不同組織中DG的T-AOC顯著低于CG組（P＜0.05），結(jié)果表明D-乳糖會破壞機體的抗氧化系統(tǒng)，加速衰老進程，隨著TSGH-3質(zhì)量濃度的增加T-AOC增大。在血清中，MG和HG組中的T-AOC顯著高于DG組（P＜0.05），HG與CG無顯著性差異（P＞0.05）。在肝臟中，TSGH-3的濃度非常重要，HG的T-AOC顯著高于LG和MG組（P＜0.05），而MG和LG沒有顯著性差異（P＞0.05）。腎臟中的變化與肝臟中的類似，也就是說TSGH-3能夠改善D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠的抗氧化活性。

2.3.2TSGH-3對大鼠不同組織中MDA含量的影響

表3　TSGH-3對大鼠不同組織中MDA含量的影響Table 3 Effect of TSGH-3 on MDA contents in different tissues of rats

由表3可知，在不同組織中，DG組的MDA含量顯著高于CG組（P＜0.05），進一步證明了用D-半乳糖處理大鼠能成功地重現(xiàn)動物衰老模型。TSGH-3能減少MDA含量，并且隨著TSGH-3質(zhì)量濃度的增加，MDA含量降低。然而，TSGH-3處理的3 個劑量組并沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.3.3TSGH-3對大鼠不同組織中SOD活性的影響

表4　TSGH-3對大鼠不同組織中SOD活性的影響Table 4 Effect of TSGH-3 on SOD activity in different tissues of rats

如表4所示，與CG組相比，DG組的SOD活性顯著降低（P＜0.05）。隨著TSGH-3質(zhì)量濃度的增加，可以有效地保護大鼠中SOD的活性，LG組的SOD活性與CG組無顯著性差異（P＞0.05）。以上結(jié)果均可表明TSGH-3能明顯阻止由D-半乳糖誘導(dǎo)的超氧自由基對機體的損傷，并且在較低的質(zhì)量濃度下就能改善SOD的產(chǎn)生。

2.3.4TSGH-3對大鼠不同組織中GSH-Px活性的影響

表5　TSGH-3對大鼠不同組織中GSH-Px活性的影響Table 5 Effect of TSGH-3 on GSH-Px activity in different tissues of rats

由表5可知，DG組中的血清、肝臟和腎臟組織的GSH-Px活性顯著低于CG組（P＜0.05），LG、MG和HG組的抗氧化活性均高于DG組。HG組血清和肝臟組織中的GSH-Px活性與CG組無顯著性差異（P＞0.05），腎臟中HG與DG組相比GSH-Px活性有顯著性差異（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，TSGH-3對D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠中GSH-Px活性的再生有一定的影響。

2.3.5TSGH-3對大鼠內(nèi)臟組織的影響

表6　TSGH-3對大鼠臟器指數(shù)的影響Table 6 Effect of TSGH-3 on visceral indices of rats %

由表6可知，DG組的肝臟和腎臟指數(shù)顯著低于CG組（P＜0.05），初步表明衰老模型建立成功。TSGH-3的修復(fù)作用表明了劑量對衰老大鼠臟器指數(shù)的影響，HG組顯著高于DG組（P＜0.05），與CG組無顯著性差異（P＞0.05）。因此，推論出TSGH-3具有修復(fù)由D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠的肝臟和腎臟功能。

3　討 論

在蛋白水解液的抗氧化活性中，分子質(zhì)量的分布和氨基酸的組成起著很重要的作用［14-15］。一般來說，分子質(zhì)量和抗氧化活性之間沒有直接的關(guān)系，然而，很多研究表明低分子質(zhì)量的蛋白水解產(chǎn)物具有較高的抗氧化活性［16］。此外，低分子質(zhì)量的肽在腸道內(nèi)易被吸收，到達血液和靶器官。在本研究中，TSGH-3是TSGH中分子質(zhì)量較低的部分。此外，一些研究顯示高含量的疏水性氨基酸可以增加膠原蛋白肽在油脂中的溶解度，進而提高抗氧化活性［17］。TSGH-3的THAA含量高于TSGH-1和TSGH-2，因此，TSGH-3具有較高的抗氧化活性。

由于沒有單一的抗氧化標(biāo)準(zhǔn)方法來測定抗氧化活性，因此推薦使用不同的方法來分析抗氧化能力的不同機理［6，18］。在本次研究中，采用了3 種方法來評價TSGH-3的體外抗氧化活性，包括·OH和ABTS+·清除活性以及Fe2+螯合能力，檢測了自由基清除和金屬螯合兩種機制。結(jié)果表明TSGH-3具有很好的體外清除自由基和金屬螯合活性。

目前，通過注射D-半乳糖的方式形成的自然衰老已經(jīng)成為常用的實驗?zāi)Ｐ停驗橐赃@種方法處理的動物與自然衰老具有相同的特點，如隨著抗氧化酶的活性降低，線粒體功能失調(diào)，以及產(chǎn)生神經(jīng)毒素［19］。此外，許多研究表明由于給藥D-半乳糖，形成過多的ROS和積累過多的由美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）會加速動物模型的衰老，其中ROS的關(guān)注度最高［20］。因此在本研究中，選擇這種模型來評價TSGH-3的抗衰老能力。

氧化應(yīng)激是由于自由基的產(chǎn)生與抗氧化防御系統(tǒng)能力間失衡，從而產(chǎn)生大量的氧化中間產(chǎn)物［21］。健康與否與體內(nèi)防御系統(tǒng)的T-AOC緊密相關(guān)，在評價機體抗氧化能力時，T-AOC是一種很重要的指標(biāo)。正如研究結(jié)果中描述，注射D-半乳糖后，衰老大鼠的T-AOC顯著降低（P＜0.05）。然而，由于TSGH-3具有抗氧化活性，能顯著增加大鼠的抗氧化能力（P＜0.05）。

過多活性氧自由基的產(chǎn)生會引起存在于生物膜上的多不飽和脂肪酸氧化，并且形成一系列脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA，從而引起細胞損傷［22］。許多研究表明，MDA含量的增加是機體衰老的信號，MDA的含量能間接地反映出細胞受到自由基攻擊的嚴(yán)重程度［23］。本研究表明，在攝入TSGH-3后，血清和其他組織中MDA含量下降，說明TSGH-3可能因其自由基清除活性和金屬螯合能力，而具有抑制體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的能力。

在酶促防御系統(tǒng)中，SOD、過氧化氫酶（catalase，CAT）和GSH-Px等酶起著主要作用［24］，SOD可以將超氧自由基轉(zhuǎn)變?yōu)檫^氧化氫，同時，CAT將過氧化氫分解為水和氧氣。另一方面，GSH-Px將過氧化氫分解為谷胱甘肽中存在的其他化合物［25］。在本研究中，衰老大鼠的SOD和GSH-Px活性在注射D-半乳糖后顯著降低（P＜0.05）。TSGH-3能增大血清、肝臟和腎臟的SOD和GSH-Px活性，并保護體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)，從而抑制器官老化。

臟器指數(shù)是實驗動物臟器質(zhì)量和體質(zhì)量的比例，由于這種方法的簡單和靈敏性，而被廣泛用于毒理學(xué)實驗中［26］。肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)可以用作體內(nèi)抗氧化能力的指標(biāo)。在本研究中，TSGH-3能抑制肝臟和腎臟指數(shù)的降低，從而增加大鼠的體內(nèi)抗氧化能力。

4　結(jié) 論

研究表明，TSGH-3具有較高的體外抗氧化活性，并且在大鼠體內(nèi)能抑制由D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老。體外抗氧化活性通過測定·OH和ABTS+·清除能力以及Fe2+螯合能力進行評價。預(yù)防衰老的作用通過血清、肝臟和腎臟中T-AOC、SOD、GSH-Px和MDA的定量分析以及肝臟和腎臟的指數(shù)進行評價，這些活性與TSGH-3的分子質(zhì)量和氨基酸組成有關(guān)。因此，可推測食品和營養(yǎng)物質(zhì)中富含TSGH-3對人體衰老的預(yù)防有一定的作用。

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In vitro Antioxidant Activity and in vivo Anti-Aging Effect of Tilapia Skin Gelatin Hydrolysates

ZHOU Xianyan， FAN Jian， TANG Yuanlong， ZHUANG Yongliang， SUN Liping*
（Yunnan Institute of Food Safety， Kunming University of Science and Technology， Kunming 650500， China）

The amino acid composition of three peptides fractions （TSGH-1， TSGH-2 and TSGH-3） separated from tilapia skin gel atin hydrolysate （TSGH） was measured. Additionally， the antioxidant activity in vitro and anti-aging capacity in vivo of TSGH-3 were evaluated. The results showed TSGH-3 had low molecular weight and high hydrophobic amino acid contents. TSGH-3 had high antioxidant activity in vitro in terms of free radical scavenging and metal chelating activity. Furthermore， the in vivo anti-aging activity in a D-galactose-induced aging mouse model indicated that TSGH-3 could significantly increase T-AOC， SOD and GSH-Px activities in serum， liver and kidney tissues of rats （P ＜ 0.05）， and significantly decreased MDA contents （P ＜ 0.05）. Besides， liver and kidney indices of rats could be also protected after the intake of TSGH-3. Therefore， TSGH-3 possesses high antioxidant activity and can be used as a natural anti-aging agent in the medicinal and food industries.

tilapia skin gelatin hydrolysates； amino acid composition； antioxidant activity； anti-aging

10.7506/spkx1002-6630-201615037

TS254.9

A

1002-6630（2016）15-0221-06引文格式：

2015-09-17

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（31360381）

周先艷（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品副產(chǎn)品高值化利用。E-mail：zas0418@163.com

孫麗平（1981—），女，教授，博士，研究方向為食品副產(chǎn)品高值化利用。E-mail：Kmlps@163.com