王鴻超，劉 媛，顧震南，陳海琴，張 灝，陳 衛(wèi)，陳永泉*

（江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

葉酸代謝抑制劑對小鼠骨髓基質細胞增殖和分化的影響

王鴻超，劉 媛，顧震南，陳海琴，張 灝，陳 衛(wèi)，陳永泉*

（江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

采用四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法、細胞形態(tài)分析法及誘導分化法結合油紅O染色法研究葉酸代謝中二氫葉酸還原酶抑制劑甲氨喋呤（methotrexate，MTX）、甲氨芐啶（trimethoprim，TMP）和乙胺嘧啶（pyrimethamine，PTM）對OP9小鼠骨髓基質細胞增殖和分化的影響，探討葉酸代謝與脂質合成的關系。MTT實驗結果顯示，在一定濃度范圍內，3 種葉酸抑制劑均能抑制OP9細胞增殖，并呈現(xiàn)一定的劑量-效應依賴關系。且3 種葉酸抑制劑在高濃度時對OP9細胞有毒性作用。倒置顯微鏡觀察和油紅O染色檢測結果顯示，TMP在500～1 000 μmol/L濃度范圍內對OP9細胞分化為脂肪細胞具有抑制作用。熒光定量聚合酶鏈式反應分析表明，TMP會使葉酸代謝途徑中二氫葉酸還原酶和亞甲基四氫葉酸脫氫酶的轉錄水平發(fā)生下調，這可能是TMP抑制脂肪細胞誘導分化的原因。

二氫葉酸還原酶抑制劑；OP9小鼠骨髓基質細胞；脂質合成；增殖；分化

王鴻超， 劉媛， 顧震南， 等. 葉酸代謝抑制劑對小鼠骨髓基質細胞增殖和分化的影響［J］. 食品科學， 2016， 37（15）: 215-220.

WANG Hongchao， LIU Yuan， GU Zhennan， et al. Effects of folate metabolism inhibitors on the proliferation and differentiation of OP9 mouse stromal cells［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 215-220. （in Chinese with English abstract）DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615036. http://www.spkx.net.cn

葉酸（蝶酰單谷氨酸）是指具有相關生物活性的一類水溶性B族維生素，其不同的輔酶形式可以作為一碳單位的供體或載體而發(fā)揮作用，主要參與以下幾類反應：蛋氨酸合成、嘌呤和嘧啶的合成、絲氨酸和甘氨酸的相互轉化、組氨酸的降解等［1］。葉酸具有重要的營養(yǎng)生理功能，包括參與遺傳物質和蛋白質代謝、影響胰腺分泌功能、促進機體生長、提高機體免疫能力［2-5］、調控肥胖基因［6-7］等。二氫葉酸（dihydrofolic acid，F(xiàn)H2）和四氫葉酸（tetrahydrofolic acid，F(xiàn)H4）是重要的葉酸化合物，二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）是FH4的唯一來源，對于維持細胞FH4及其衍生物水平起核心作用［8］。它可將FH2轉化為FH4，從而將葉酸運送至細胞中，作為一碳基團的載體參與多種生物學反應［2，9］。DHFR是抗生素和抗癌藥物作用的重要靶點，可選擇性地與DHFR結合，阻礙葉酸代謝，干擾腫瘤細胞DNA和蛋白質的合成，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用［10］。

依照其化學結構，DHFR抑制劑可分為經(jīng)典抗葉酸劑和非經(jīng)典抗葉酸劑，主要包括甲氨喋呤（methotrexate，MTX）、甲氨芐啶（trimethoprim，TMP）和乙胺嘧啶（pyrimethamine，PTM）［11-12］。近期研究表明，葉酸代謝還是脂肪合成所需還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的重要來源［13］途徑 ，葉酸代謝途徑中的亞甲基四氫葉酸脫氫酶（methylenetetrahydrofolate dehydrogenase，MTHFD）可將NADP+轉化為NADPH［10］用于脂肪的合成。由于DHFR是葉酸代謝中的關鍵酶，對其進行抑制很可能會干擾細胞中葉酸的正常代謝，通過影響細胞NADPH的水平進而調控脂質合成。本實驗采用可以分化為脂肪細胞［14］的OP9小鼠骨髓基質細胞為模型［15］，利用四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）和比色分析法研究3 種葉酸代謝抑制劑對OP9細胞的增殖及分化為脂肪細胞的作用，探討葉酸代謝與脂質合成的關系。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

OP9細胞購自于中科院上海細胞庫。

胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、液體MEM-α培養(yǎng)基、胰蛋白酶消化液 美國HyClone公司；青-鏈霉素、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、胰島素（insulin，INS）、地塞米松（dexamethasone，DEX）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX） 美國Sigma公司；油紅O干粉 蘇州英杰有限公司；MTX、TMP、PTM 百靈威科技有限公司。

1.2儀器與設備

倒置顯微鏡 日本尼康公司；細胞培養(yǎng)箱、臺式離心機、酶標儀 美國熱電公司；熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、凝膠成像儀美國伯樂公司。

1.3方法

1.3.1OP9細胞培養(yǎng)

將OP9細胞置于含20%胎牛血清的MEM-α培養(yǎng)基（含100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素）中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，細胞貼壁呈梭狀生長，按照細胞生長密度，每隔2～3 d換液一次，待細胞密度長到80%時傳代并傳板，以備實驗所需。

1.3.2MTT法檢測葉酸抑制劑對OP9細胞增殖的影響

對于貼壁生長的OP9細胞，待細胞密度長到80%時，按照5×104個/孔將細胞接種到96 孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)1 d使其生長至貼壁后開始干預處理，并降低細胞培養(yǎng)的胎牛血清體積分數(shù)為5%。實驗組分別設置為對照組（溶劑DMSO和培養(yǎng)基）和實驗組（葉酸代謝抑制劑和培養(yǎng)基），其中實驗組每孔加入葉酸抑制劑（MTX、TMP和PTM），使其終濃度為10～2 500 μmol/L。培養(yǎng)48 h后，每孔加入22 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于490 nm波長處測得光密度（OD）值［16］，并用空白孔調零，按照下式計算細胞增殖率。

1.3.3細胞形態(tài)學分析

對于貼壁生長的OP9細胞，待細胞密度長到80%時，傳板至96 孔板中。待細胞貼壁生長1 d后，開始加藥干預處理。分別設置對照組（溶劑DMSO和培養(yǎng)基）和實驗組（藥物和培養(yǎng)基）。實驗組加入終濃度1.3.2節(jié)所述的葉酸抑制劑（MTX、TMP和PTM），繼續(xù)培養(yǎng)72 h后用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

1.3.4OP9細胞的誘導分化

1.3.4.1誘導分化過程

參考Wolins等［15］的方法，對于貼壁生長狀態(tài)良好的OP9細胞，待細胞密度生長到80%時，接種到6 孔板，每孔2 mL，使其貼壁生長達到接觸抑制2 d后，在DM1培養(yǎng)基（MEM-α培養(yǎng)基添加20% FBS、175 nmol/L INS、0.25 μmol/L DEX、0.5 mmol/L IBMX和1%青-鏈霉素）中繼續(xù)培養(yǎng)2 d。隨后更換培養(yǎng)基為DM2（MEM-α培養(yǎng)基添加20% FBS、175 nmol/L INS和1%青-鏈霉素）中繼續(xù)培養(yǎng)，以使脂滴積累。

1.3.4.2油紅O染色

油紅O儲存液配制：稱取0.5 g油紅O干粉，溶于100 mL異丙醇中。棕色瓶密封，4 ℃保存?zhèn)溆?。按?.3.4.1節(jié)的誘導分化方法，在OP9細胞誘導分化第7天，開始對細胞進行染色。棄掉6 孔板中的培養(yǎng)基，每孔加入1 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗3 遍，然后用1 mL 10%多聚甲醛室溫固定30 min。PBS清洗3 遍后，每孔加入1 mL油紅O工作液（油紅O儲存液-水（V/V，3∶2））于50 ℃水浴中浸染40 min。棄掉油紅O，每孔用1 mL PBS洗3 遍，細胞中加入1 mL的PBS在顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5葉酸代謝抑制劑對OP9細胞誘導分化的影響

1.3.5.1葉酸代謝抑制劑對OP9細胞誘導分化后脂質積累的影響

在對OP9細胞進行誘導分化的同時，設置誘導對照組（簡稱對照組，加入誘導劑和溶劑DMSO）和實驗組（加入誘導劑和葉酸代謝抑制劑）。其中實驗組分別用培養(yǎng)基將MTX、TMP、PTM稀釋成終濃度為50～1 000 μmol/L，并與誘導劑一同加入孔中。每孔加入2 mL培養(yǎng)液。誘導7 d后，按照1.3.4.2節(jié)方法對細胞進行染色并拍照。染色后棄掉6 孔板中的PBS，每孔加入1 mL異丙醇將油紅O洗滌下來，轉移到96 孔板中，于510 nm波長處測定OD值，按照下式計算相對分化率。

1.3.5.2OP9細胞誘導分化過程中葉酸代謝關鍵酶的轉錄水平分析

在OP9細胞誘導分化為脂肪細胞后，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入1 mL Trizol裂解細胞并收取樣品。室溫靜置5 min后，加入200 μL預冷的三氯甲烷，顛倒振蕩30 s，靜置2 min，12 000×g離心15 min。將上清液轉移到新的無酶EP管中，加入等體積預冷的異丙醇，輕柔顛倒30 s，室溫靜置20 min。12 000×g離心15 min，棄掉上清，加入1 mL預冷的70%乙醇，8 000×g離心5 min。重復洗滌一次后，室溫晾干，加入20 μL無酶水回溶。采用TaKaRa的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進行反轉錄，構建cDNA文庫。由美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）上查找DHFR、MTHFD1、MTHFD2、MTHFD2L基因的cDNA序列，利用Primer Premier 5設計符合要求的熒光定量PCR的引物，序列見表1。

表1　引物序列Table 1 Primer sequenceess

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2　結果與分析

2.1葉酸抑制劑對OP9細胞增殖和形態(tài)的影響

2.1.1葉酸抑制劑對OP9細胞增殖的影響

如圖1A所示，MTX對OP9細胞增殖有一定的抑制作用，與對照組相比，隨著抑制劑濃度的升高，細胞的增殖率降低。MTX濃度≥200 μmol/L時，OP9細胞增殖率明顯降低（P＜0.001）。如圖1B所示，PTM濃度≥50 μmol/L時，對OP9細胞有明顯的抑制增殖作用（P＜0.01或P＜0.001），且隨著PTM濃度的增加，抑制作用逐漸增強，劑量-效應關系明顯。如圖1C所示，當TMP濃度≥600 μmol/L時，其對OP9細胞增殖的抑制作用非常明顯（P＜0.001），且隨著TMP濃度的增加，抑制作用逐步增強。

圖1　不同濃度的MTX（A）、PTM（B）和TMP（CC）對OOPP99細胞增殖的影響Fig. 1 Effects of different concentratins of MTX （A）， PTM （B）， and TMP （C） on the proliferation of OP9 cells

2.1.2葉酸抑制劑對OP9細胞形態(tài)的影響

圖2　不同濃度葉酸抑制劑對OP9OP9細胞形態(tài)的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of inhibitors on the morphology of OP9 cells

由圖2可知，與對照組（0 μmol/L）相比，當MTX濃度≤500 μmol/L時，OP9細胞形態(tài)正常，表明MTX在該濃度下對細胞形態(tài)并未造成傷害。而當MTX濃度達到1 000 μmol/L時，細胞相對分散，數(shù)量減少，細胞很可能發(fā)生了凋亡。這表明MTX在200～1 000 μmol/L范圍內既可以對細胞的增殖產(chǎn)生抑制作用，又對細胞的正常形態(tài)沒有損害。PTM對細胞的殺傷作用非常大。在其濃度到達200 μmol/L時，細胞數(shù)量急劇減少，從圖中可以看出，細胞已經(jīng)失去原本長梭狀的形態(tài)，變成長串珠狀，細胞核固縮突出，并發(fā)生裂解碎片，可能發(fā)生了細胞凋亡。這表明PTM這種抑制劑對于OP9細胞的傷害是比較嚴重的，在濃度過高時細胞毒性作用較強。當TMP濃度達到1 000 μmol/L時，其對OP9細胞的毒害作用也顯現(xiàn)出來。由圖2可知，當OP9細胞受到損傷時，細胞由原本的長梭狀變圓，細胞核突出，細胞也失去了正常的連接狀態(tài)，可能發(fā)生了細胞凋亡。綜合以上結果，TMP在500～1 000 μmol/L之間對細胞增殖的抑制作用較為明顯，而且對細胞的正常形態(tài)沒有損害。

2.2葉酸抑制劑對OP9細胞分化的影響

圖3　3 OP9OP9分化前脂肪細胞與分化后脂肪細胞Fig. 3 Morphological micrographs of OP9 pre-adipocytes and adipocytes

如圖3A所示，誘導前OP9細胞為典型的梭狀，細胞內無脂滴。當細胞生長至一定階段后，完全融合產(chǎn)生接觸抑制，此時細胞生長停滯。誘導后細胞由梭狀變?yōu)閳A形，胞內有脂滴出現(xiàn)，隨著誘導時間的延長，脂滴逐漸增大（圖3C）。油紅O 是一種對油脂呈特異性的染料，OP9細胞被誘導分化成為脂肪細胞后，產(chǎn)生的油滴能與油紅O結合呈現(xiàn)紅色（圖3D），而誘導前細胞則不能被染色（圖3B）。

圖4　不同濃度的MTX（A）、PTM（B）和TMP（CC）對OOPP99細胞分化的影響Fig. 4 Effects of different concentrations of MTX（A）， PTM（B）， and TMP（C） on the differentiation of OP9

由圖4A可知，MTX在800～1 000 μmol/L范圍內對OP9細胞誘導分化的抑制作用比較明顯（P＜0.001）；PTM在10～100 μmol/L范圍內對OP9細胞的分化無抑制作用（圖4B）；TMP在500～1 000 μmol/L范圍內對OP9細胞分化的影響顯著（P＜0.001）（圖4C），隨著濃度的升高，其抑制OP9細胞分化的作用逐漸加強。濃度為1 000 μmol/L的TMP對OP9細胞分化的抑制效果最為顯著，此時OP9細胞的相對分化率下降達50%。綜上所述，500～1 000 μmol/L的TMP既可以抑制OP9細胞的增殖，又可以對細胞分化產(chǎn)生影響，是良好的OP9細胞分化抑制劑。

2.3TMP對OP9細胞分化過程中葉酸代謝關鍵基因轉錄水平的影響

圖5　5 DHFRDHFR（A）、AMTHFD1THFD1（B）、BMTHFD2THFD2（C）和CMTHFD2LHFD2L（D）D基因相對表達情況Fig. 5 Relative expression levels of DHFR （A），MTHFD1 （B），MTHFD2 （C） and MTHFD2L （D） genes

分析TMP對OP9細胞分化過程中葉酸代謝關鍵基因轉錄水平的影響，結果見圖5。當對OP9細胞進行誘導分化時，500～1 000 μmol/L的TMP對脂肪細胞的分化影響顯著，并可明顯下調DHFR基因和MTHFD1基因的轉錄水平（圖5A、B）。這表明DHFR和MTHFD1在OP9細胞分化為脂肪細胞的過程中起到了重要作用，葉酸代謝提供的NADPH很可能是脂肪細胞形成的關鍵。而MTHFD2基因的轉錄水平發(fā)生了上調（圖5C），這可能是由于MTHFD2提供的NADPH較少，該基因的調控難以對細胞的NADPH總量產(chǎn)生影響。MTHFD2L基因的轉錄水平?jīng)]有發(fā)生變化（圖5D），這可能是由于該基因不能提供NADPH，因此在OP9細胞的誘導分化過程中并沒有發(fā)揮重要作用。

3　討 論

細胞增殖是生物體的重要生命特征，細胞增殖檢測技術廣泛應用于分子生物學、腫瘤生物學等研究領域［17-18］。各種代謝抑制劑對細胞增殖的不同影響效果與細胞系種類、抑制劑種類及干預濃度和作用時間有重要關系。由于DHFR抑制劑的結構與DHFR的底物相似，故細胞快速增長過程中，DHFR抑制劑能選擇性地與DHFR結合，阻止或抑制正常底物與酶的結合，抑制其催化還原活性，使FH2不能轉化為FH4，阻礙葉酸代謝［8］。通過MTT分析結合細胞形態(tài)學研究結果發(fā)現(xiàn)，3 種葉酸抑制劑MTX、PTM和TMP在一定濃度范圍內都會對OP9細胞的增殖產(chǎn)生抑制作用，濃度增大達到一定程度之后則呈現(xiàn)出細胞毒性。后期實驗可考慮進一步通過DAPI等DNA特異性染料對細胞核進行染色，通過熒光顯微鏡觀察進一步確定細胞的凋亡情況［19-20］。葉酸代謝抑制劑的干預效果與抑制劑的種類、濃度都有很大的關系。

常用的OP9細胞誘導分化為脂肪細胞的方法與3T3-L1細胞的誘導方法相近［21］，包括血清替代法，胰島素油方法和成脂雞尾酒方法［15］。油紅O染色法表明OP9誘導分化積累脂滴的效果較好［21］。有研究表明該誘導方法可以激活細胞脂合成的關鍵基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ），促進OP9細胞分化成為脂肪細胞［15］。然而這種方法誘導脂肪細胞的具體通路和途徑并不清晰，因此需要進一步深入研究。

3 種葉酸代謝抑制劑中，只有TMP在500～1 000 μmol/L范圍內可抑制OP9細胞的脂滴積累，對脂肪細胞的誘導分化產(chǎn)生顯著影響。NADPH在脂肪的合成中具有關鍵作用——提供唯一的還原力。由于TMP會對DHFR的活性產(chǎn)生抑制，葉酸代謝受到阻礙，進而可能會對脂肪細胞的形成產(chǎn)生影響。葉酸代謝途徑中的亞甲基四氫葉酸脫氫酶包括MTHFD1、MTHFD2和MTHFD2L，其中MTHFD1位于細胞質中，MTHFD2位于線粒體中，它們都以NADP+為底物，生成NADPH［22-23］，而MTHFD2L以NAD+為底物，生成NADH［24-25］。添加TMP后，只有MEHFD1的轉錄水平發(fā)生下調，這表明MTHFD1很可能在葉酸代謝產(chǎn)NADPH過程中發(fā)揮重要作用，是OP9細胞誘導分化為脂肪細胞的關鍵調控基因。

本研究考察了3 種葉酸抑制劑對OP9細胞增殖和分化的影響，結果表明3 種葉酸抑制劑均能抑制OP9細胞的增殖，并在一定濃度范圍內呈濃度-效應依賴關系，其中PTM的效果最強；但只有500～1 000 μmol/L的TMP會對OP9細胞誘導分化為脂肪細胞產(chǎn)生顯著抑制作用；TMP通過下調DHFR和MTHFD1基因的轉錄水平進而影響細胞中NADPH的水平，可能是其通過抑制葉酸代謝影響脂質合成的作用機制。

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Effects of Folate Metabolism Inhibitors on the Proliferation and Differentiation of OP9 Mouse Stromal Cells

WANG Hongchao， LIU Yuan， GU Zhennan， CHEN Haiqin， ZHANG Hao， CHEN Wei， CHEN Yongquan*
（School of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China）

Folate is a water-soluble vitamin B which has important physiological functions. The effects of methotrexate（MTX）， trimethoprim （TMP）， and pyrimethamine （PTM） on the proliferation and differentiation of OP9 mouse stromal cells were investigated by methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） assay， cell morphology analysis and induced differentiation combined with oil red O staining. MTX， TMP and PTM significantly inhibited the proliferation of OP9 cells in a dosedependent manner within a certain concentration range. Cell morphology analysis showed that MTX， TMP and PTM were cytotoxic to OP9 cells at high concentration. The results of inverted electron microscopic observation and oil red staining showed that only TMP significantly inhibited the differentiation of OP9 cells in a dose-dependent manner in the range of 500-1 000 μmol/L. The transcription levels of DHFR and MTHFD1 were down-regulated by TMP， which may explain why the differentiation of OP9 cells was inhibited by TMP.

dihydrololate reductase inhibitors； OP9 mouse stromal cells； lipid synthesis； proliferation； differentiation

10.7506/spkx1002-6630-201615036

Q28

A

1002-6630（2016）15-0215-06

10.7506/spkx1002-6630-201615036. http://www.spkx.net.cn

2016-04-11

國家自然科學基金青年科學基金項目（31400038）

王鴻超（1985—），男，講師，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：hcwang@jiangnan.edu.cn

陳永泉（1961—），男，教授，博士，研究方向為營養(yǎng)因子與人體健康。E-mail：yqchen@jiangnan.edu.cn

引文格式：