丁盼盼，丁 軻，，*，余祖華，李 旺，李元曉，劉一塵，何萬(wàn)領(lǐng)，趙戰(zhàn)勤，王玉琴，3，程相朝，張春杰

（1.河南科技大學(xué)宏翔發(fā)酵飼料實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471003；2.河南省動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

河南 洛陽(yáng) 471003；3.河南省肉羊繁育工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471003）

降膽固醇乳酸桿菌的篩選及對(duì)小鼠血清膽固醇的影響

丁盼盼1，丁 軻1，2，*，余祖華2，李 旺1，李元曉1，劉一塵1，何萬(wàn)領(lǐng)1，趙戰(zhàn)勤2，王玉琴1，3，程相朝2，張春杰2

（1.河南科技大學(xué)宏翔發(fā)酵飼料實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471003；2.河南省動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

河南 洛陽(yáng) 471003；3.河南省肉羊繁育工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471003）

目的：從羊新鮮糞便中分離篩選具有降膽固醇能力的乳酸桿菌，探討其對(duì)小鼠血清 膽固醇含量的影響。方法：以碳酸鈣-MRS培養(yǎng)基和膽固 醇-MRS培養(yǎng)基篩選具有高效降膽固醇能力的乳酸桿菌；利用形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析鑒定分離菌株L-3。為了驗(yàn)證其效果，將40 只8 周齡雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為基礎(chǔ)飼料組（A）、高脂模型組（B）、高脂模型+生理鹽水組（C）、高脂模型+菌株L-3組（D）。分別飼喂第15、30天，采血，測(cè)定總膽固醇（total cholesterol，TC）、總甘油三酯（triglyceride，TG）和高密度脂蛋白膽 固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）的含量。結(jié)果：篩選得到一株能夠高效降解膽固醇的菌株L-3，膽固醇降解率達(dá)到（35.93±0.43）%，經(jīng)鑒定為植物乳桿菌。飼喂第15天，成功構(gòu)建出高脂血癥小鼠模型。灌胃第 30天，與B組相比，D組TC、TG、動(dòng)脈硬化指數(shù)水平均極顯著降低（P＜0.01），HDL-C水平顯著升高（P＜0.05），HDL-C/TC水平極顯著升高（P＜0.01），而對(duì)照組幾乎無(wú)降膽固醇效果（P＞0.05）。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)獲得了1株在體內(nèi)外均具有高效降膽固醇能力的植物乳桿菌Lactobacillus plantarum L-3，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)其為功能性微生態(tài)制劑提供了可能。

乳酸桿菌；降膽固醇；小鼠；篩選

丁盼盼， 丁軻， 余祖華， 等. 降膽固醇乳酸桿菌的篩選及對(duì)小鼠血清膽固醇的影響［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（15）: 192-197. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615032. http://www.spkx.net.cn

DING Panpan， DING Ke， YU Zuhua， et al. Screening of Lactobacillus with cholesterol-degrading property and its effect on serum cholesterol in mice［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 192-197. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201615032. http://www.spkx.net.cn

高膽固醇血癥是引起冠心病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的最主要因素之一，已成為威脅人類(lèi)健康的首要因素，患病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)［1］。研究表明人體血清膽固醇每高出正常水平1 mmol，心血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)增加35%，血清總膽固醇每降低1%，發(fā)生冠心病的危險(xiǎn)性可減少2%～3%［2］。因此，降低血清膽固醇，可有效防止心血管疾病的發(fā)生。目前臨床上主要是靠藥物降解血清膽固醇，雖然快速有效，但具有一定的副作用，而且價(jià)格昂貴［3］。所以通過(guò)非藥物途徑降解血清膽固醇已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。已有研究證明，乳酸菌及其發(fā)酵乳制品可有效降低血清膽固醇水平［4］。Mann［5］發(fā)現(xiàn)非洲MASAI部落因長(zhǎng)期飲用乳酸菌發(fā)酵的乳制品，血清膽固醇呈較低水平。Harrison等［6］用嗜酸乳桿菌發(fā)酵的酸奶喂養(yǎng)嬰兒后發(fā)現(xiàn)嬰兒血清膽固醇水平明顯降低。這些結(jié)果引起了國(guó)內(nèi)外營(yíng)養(yǎng)學(xué)、微生物學(xué)等各界人士的普遍關(guān)注，從而掀起了微生物降膽固醇作用的研究熱 潮。目前，降膽固醇包括乳酸桿菌在內(nèi)的乳酸菌研究并不多，而相對(duì)于其他乳酸菌，乳酸桿菌應(yīng)用更為普遍。據(jù)報(bào)道，羊肉與其他畜禽肉相比，膽固醇含量相對(duì)較少，考慮到是否腸道微生物在起調(diào)節(jié)作用，所以選擇從羊體內(nèi)分離。因此本實(shí)驗(yàn)旨在從羊新鮮糞便中分離篩選高效降解膽固醇的乳酸桿菌，通過(guò)飼喂高血脂動(dòng)物模型小鼠，檢測(cè)分離菌對(duì)小鼠血清膽固醇的降解情況，以期尋找有效降膽固醇的乳酸桿菌菌種，對(duì)于開(kāi)發(fā)新型微生態(tài)制劑和功能性健康食品具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與培養(yǎng)基

采自洛陽(yáng)地區(qū)不同羊場(chǎng)羊的新鮮糞便20 份。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料：40 只雄性健康的BALB/c小鼠（8 周齡），體質(zhì)量約為27～30 g，購(gòu)自河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)翀?chǎng)。

膽固醇（分析純）、鄰苯二甲醛、正己烷（分析純） 北京澳博星生物技術(shù)有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒 南京建成生物工程研究所；細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；Tks Gflexx DNA Polymerase、DNA Marker、dNTP、10×PCR Buffer 日本TaKaRa公司；高脂飼料（豬油10%、蔗糖5%、膽固醇1%、膽鹽0.3%、基礎(chǔ)飼料83.7%）。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨1 g、牛肉膏0.5 g、酵母浸粉0.5 g、吐溫-80 0.1 mL、葡萄糖2.0 g、磷酸氫二鉀0.2 g、檸檬酸二銨0.2 g、乙酸鈉0.5 g、硫酸鎂0.058 g、硫酸錳0.025 g，加蒸餾水定容至100 mL；碳酸鈣-MRS培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基中加入0.2 g/100 mL的CaCO3；降膽固醇篩選培養(yǎng)基（MRS-CHOL-THIO）：在MRS培養(yǎng)基中加入0.2 g/100 mL的巰基乙酸鈉、0.3 g/100 mL膽鹽，加熱溶解，121 ℃滅菌20 min后按體積分?jǐn)?shù)1%加入10 mg/mL膽固醇。

1.2儀器與設(shè)備

ND100-1型氮?dú)獯祾邇x 杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司；UV-1200紫外分光光度計(jì) 上海翱藝儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SW-CJIFD型單人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；Thermo 4 ℃離心機(jī) 中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

1.3方法

1.3.1降膽固醇菌株的初篩

每個(gè)糞便樣品稱(chēng)取約1.0 g，分別加入裝有9.0 mL無(wú)菌生理鹽水的錐形瓶中，漩渦振蕩5 min。靜止片刻后吸取0.2 mL上清液涂布于碳酸鈣-MRS瓊脂平板，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。挑取有溶鈣圈的菌落，在MRS瓊脂平板上劃線純化，連續(xù)劃線純化3 次，觀察菌落形態(tài)，采用革蘭氏染色法對(duì)菌株進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。挑選革蘭氏陽(yáng)性無(wú)芽孢的桿狀菌株，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2降膽固醇菌株的復(fù)篩

將初篩分離的菌株接種到MRS培養(yǎng)基中活化后，按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種于10 mL降膽固醇篩選培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧靜止培養(yǎng)，每隔12 h搖勻1 次，培養(yǎng)48 h后，吸取混勻的菌液1 mL，5 000 r/min離心10 min，參照文獻(xiàn)［7］采用鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）比色法測(cè)定膽固醇含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取1 mg/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液，分別配制成5 個(gè)不同質(zhì)量濃度（20、40、60、80、100 μg/mL）的工作液，然后各取1 mL工作液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，空白為1 mL無(wú)水乙醇，實(shí)驗(yàn)平行3 次，測(cè)定方法同上。膽固醇溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.006 0x-0.012 1（R2=0.990 0），回歸方程擬合后相關(guān)性較好，說(shuō)明用此法測(cè)定膽固醇含量是可行的。

式中：ρ0為未接種菌株培養(yǎng)上清液550 nm波長(zhǎng)處吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)應(yīng)的膽固醇質(zhì)量濃度；ρ1為分離菌株發(fā)酵后培養(yǎng)上清液550 nm波長(zhǎng)處吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)應(yīng)的膽固醇質(zhì)量濃度。

1.3.3菌種鑒定

生理生化鑒定：對(duì)菌株按照《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［8］和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［9］進(jìn)行部分生理生化指標(biāo)測(cè)定，包括明膠液化、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、蘋(píng)果酸產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、硫化氫實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣、運(yùn)動(dòng)性、溫度實(shí)驗(yàn)（15、45 ℃）、7 g/100 mL NaCl、糖發(fā)酵產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)（葡萄糖、麥芽糖、核糖、蜜二糖、木糖、松三糖、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、鼠李糖、纖維二糖）。

16S rDNA分子鑒定：利用細(xì)菌全基因組DNA提取劑盒抽提分離菌株的全基因組DNA，并以此為模板，采用桿菌科16S rDNA基因的通用引物［10］P1（5’-AACTGAAGAGTTTGATCCTGGCTC-3’），P2（5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25 ?L）為：10×PCR Buffer 2.5 ?L，dNTP mixture 2 ?L，Tks Gflexx DNA Polymerase 0.5 ?L，P1、P2各0.5 ?L，模板1 ?L，加ddH2O至25 ?L。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。取4 ?L PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的BLAST程序在GenBank基因庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，選取相似性較高菌株的16S rDNA序列，利用MEGA5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。

1.3.4小鼠分組及飼喂方式

取培養(yǎng)后的Lactobacillus plantarum L-3，用生理鹽水洗滌2 次，將菌體濃度調(diào)整到1.0×109CFU/mL，用于小鼠灌胃實(shí)驗(yàn)。將40 只8 周齡BALB/c小鼠按各組間平均體質(zhì)量無(wú)顯著差異重新分為4 組：A組飼喂基礎(chǔ)飼料，B組飼喂高脂飼料，C組飼喂高脂飼料+生理鹽水，D組飼喂高脂飼料+菌株L-3，每組10 只。每只小鼠灌胃1 mL/次，連續(xù)灌胃30 d。

1.3.5血清中TC、TG、HDL-C含量的測(cè)定

在實(shí)驗(yàn)第15、30天分別采血（采血前禁食12 h），分離血清，2 500 r/min離心10 min取血清。分別參照試劑盒說(shuō)明，采用酶標(biāo)儀測(cè)定血清中TC、TG和HDL-C的含量并對(duì)比各組間血清指標(biāo)的差異，計(jì)算動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)（arteriosclerosis index，AI）［11］。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，用方差分析檢驗(yàn)顯著性，多重比較用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）檢驗(yàn)，P＜0.01為極顯著性差異，P＜0.05為顯著性差異。

2　結(jié)果與分析

2.1 乳酸桿菌的初篩結(jié)果

從碳酸鈣-MRS瓊脂平板挑取菌落周?chē)忻黠@溶鈣圈，邊緣整齊，正面凸起，乳白色，不透明，表面濕潤(rùn)光滑的單菌落，MRS瓊脂平板劃線純化后，且革蘭氏染色陽(yáng)性，不能形成芽孢，菌體呈直或彎的桿狀，單個(gè)、成對(duì)或呈鏈狀。初步共挑選35 株疑似菌株，部分菌株顯微形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1　部分分離菌株的革蘭氏染色形態(tài)（1 000×）Fig. 1 Morphology of isolated strains by Gram-staining （1 000 ×）

2.2菌株的膽固醇降解率

菌株體外降膽固醇能力是以菌體在含膽固醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)前后的膽固醇量的變化差值來(lái)評(píng)價(jià)的，以不接種的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。經(jīng)篩選得到35 株菌株中14 株具有降膽固醇能力，菌株對(duì)膽固醇降解率從17.50%～35.93%不等，結(jié)果見(jiàn)表1，其中菌株L-3的體外膽固醇降解率最高可達(dá)35.93%，因此，將該菌株用于下一步實(shí)驗(yàn)。

表1　分離菌株降解膽固醇能力Table 1 Cholesterol-reducing capacity of the screened bacteria

表1　分離菌株降解膽固醇能力Table 1 Cholesterol-reducing capacity of the screened bacteria

菌株膽固醇降解率/%菌株膽固醇降解率/% L-117.50±0.54 L-822.86±0.11 L-220.92±0.42L-921.13±0.21 L-335.93±0.43L-1027.42±0.23 L-425.41±0.27L-1730.43±0.17 L-519.92±0.34L-1832.87±0.45 L-618.65±0.28L-1930.86±0.58 L-717.93±0.22L-2018.92±0.34

2.3菌株鑒定

2.3.1生理生化鑒定

菌株L-3過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)均為陰性，不液化明膠，不產(chǎn)生硫化氫氣體，無(wú)運(yùn)動(dòng)性，可以在15 ℃和7 g/100 mL NaCl環(huán)境中生長(zhǎng)，但不能在45 ℃環(huán)境中生長(zhǎng)，并且可以利用葡萄糖、麥芽糖、核糖、蜜二糖、木糖、松三糖、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖產(chǎn)酸，但不能利用纖維二糖、甘露糖、鼠李糖產(chǎn)酸。與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［9］中植物乳桿菌的生理生化特性基本相符，因此初步鑒定菌株L-3為植物乳桿菌（L. plantarum）。

2.3.2菌株的16S rDNA鑒定結(jié)果

圖2　分離菌株L-3 16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA fragment from strain L-3

以菌株L-3基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，如圖2所示，在約1 500 bp處有一條特異性條帶，與預(yù)期大小相符。經(jīng)測(cè)序獲得該序列大小為1 487 bp（GenBank登錄號(hào)為KR824936），利用NCBI上的BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株L-3和植物乳桿菌的相似性超過(guò)99%，挑選出與該菌株親緣性較近的序列，通過(guò)MEGA5.0軟件中的“鄰接法（neighbor-joining，N-J）”模塊對(duì)該序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。由圖3可知，菌株L. plantarum L-3與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum ATCC 14917）在進(jìn)化樹(shù)上處于同一個(gè)分支，親緣關(guān)系最近，因此，可確定菌株L-3為植物乳桿菌。

圖3　基于分離菌株L-3分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree derived from the 16S rDNA sequence of Lactobacillus plantarum L-3

2.4菌株L-3對(duì)高血脂癥小鼠血脂的影響

表2　植物乳桿菌L-3對(duì)小鼠血清TC、TG和HDL-C含量的影響Table 2 Effect of Lactobacillus plantaarruumm L-3 on serum TC， TG and HDLL--CCmmol/L

表2　植物乳桿菌L-3對(duì)小鼠血清TC、TG和HDL-C含量的影響Table 2 Effect of Lactobacillus plantaarruumm L-3 on serum TC， TG and HDLL--CCmmol/L

注：同列小寫(xiě)字母不同表示差異顯著（P＜0.05）；同列大寫(xiě)字母不同表示差異極顯著（P＜0.01）。下同。

組別TCTGHDL-C 15 d30 d15 d30 d15 d30 d A組1.75±0.17cB1.82±0.15cB1.20±0.09bBC1.28±0.07cB1.45±0.14aA1.56±0.17acAB組3.38±0.26aA3.71±0.24aA1.64±0.13aA1.81±0.11aA1.61±0.11aA1.37±0.07bcAC組3.24±0.23abA3.50±0.29aA1.60±0.14aAC1.65±0.09abAC1.53±0.17aA1.47±0.11acAD組2.72±0.22bA2.55±0.08bB1.57±0.11aAC1.44±0.10bcBC1.49±0.17aA1.75±0.11aA

由表2可知，小鼠飼喂高脂飼料第15天，與A組相比，B、C、D組小鼠血清TC水平均極顯著升高（P＜0.01），D組較B組TC水平顯著降低（P＜0.05），B組TG水平較A組極顯著升高（P＜0.01），C、D組TG水平顯著升高（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)第30天，與A組相比，B、C組小鼠血清中TC和TG含量均極顯著升高（P＜0.0 1），D組T C和T G水平分別顯著升高（P＜0.05）和無(wú)顯著差異（P＞0.05）；B、C、D組HDL-C水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）；與B組相比，C組TC、TG、HDL-C水平均無(wú)顯著差異（P＞0.05），D組TC、TG水平均極顯著降低（P＜0.01），HDL-C水平顯著升高（P＜0.05）；與C組相比，D組TC水平極顯著降低（P＜0.01），TG、HDL-C水平均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.5小鼠體質(zhì)量、AI及HDL-C/TC變化

表3　植物乳桿菌L-3對(duì)小鼠體質(zhì)量、AI及HDL-C/TC的影響Table 3 Effect of Lactobacillus plantarruumm L-3 on body weight and atherogenic indeex （x

表3　植物乳桿菌L-3對(duì)小鼠體質(zhì)量、AI及HDL-C/TC的影響Table 3 Effect of Lactobacillus plantarruumm L-3 on body weight and atherogenic indeex （x

組別體質(zhì)量/gAIHDL-C/TC 15 d30 d15 d30 d15 d30 d A組30.94±1.14aA41.73±0.81aA0.22±0.05bB0.22±0.07bB0.83±0.33aA0.84±0.04aAB組31.00±1.38aA45.06±2.40aA1.14±0.13aA1.98±0.86aA0.49±0.04bB0.38±0.02cCC組31.32±1.89aA43.43±1.39aA1.26±0.24aA1.48±0.25aA0.48±0.05bB0.44±0.04cCD組29.52±1.16aA39.60±2.65aA0.94±0.20aA0.62±0.11bB0.56±0.05bB0.68±0.32bB

由表3可知，各組小鼠體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)期間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。第15天，與A組相比，B、C、D組AI均極顯著升高（P＜0.01），HDL-C/TC值均極顯著降低（P＜0.01）。第30天，與A組相比，B、C組AI值均極顯著升高（P＜0.01），B、C、D組HDL-C/TC值均極顯著降低（P＜0.01）；與B組相比，C組AI和HDL-C/TC值變化不明顯（P＞0.05），D組AI和HDL-C/TC值分別極顯著降低和升高（P＜0.01）；與C組相比，D組AI值極顯著降低（P＜0.01）。

3　討 論

乳酸菌源具有多樣性，降膽固醇乳酸菌主要是從乳制品、發(fā)酵制品中篩選［12-13］。與文獻(xiàn)報(bào)道比較，本實(shí)驗(yàn)成功從新鮮羊糞中篩選出一株體外膽固醇降解率達(dá)到35.93%的菌株，經(jīng)鑒定為植物乳桿菌，是相關(guān)報(bào)道來(lái)源于羊糞不多見(jiàn)的菌株。與已報(bào)道的菌株相比，菌株的降膽固醇能力之間存在一定差異。王今雨等［14］從酸奶中分離篩選出Lactobacillus plantarum NDC75017，其體外膽固醇降解率達(dá)到16.43%。Yildiz等［15］從嬰兒糞便中分離篩選的Lactobacillus plantarum GD2、Lactobacillus rhamnosus LP1、Lactobacillus rhamnosus E3和Lactobacillus rhamnosus E9膽固醇降解率分別為42.3%、30.3%、16.3%和30.8%。這種差異可能與菌株［15］、測(cè)定方法或者膽固醇源有一定的關(guān)系［16-17］。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)將分離出的菌株應(yīng)用到動(dòng)物模型中進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果進(jìn)一步證明了菌株L. plantarum L-3具有降膽固醇功能。

人們通常認(rèn)為血清中高濃度的TC是引起心血管疾病的主要因素之一，降低高膽固醇人群的TC及低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）濃度或升高HDL-C濃度可以減少心血管疾病的發(fā)病率。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始將目光聚集到降膽固醇乳酸菌體內(nèi)效果評(píng)價(jià)上［18-21］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)灌胃L. plantarum L-3，15 d后，成功構(gòu)建高血脂癥小鼠動(dòng)物模型。與A組相比，各組小鼠血清TC、AI、TG和HDL-C/TC水平均顯著升高，HDL-C水平變化不明顯。通過(guò)灌胃L. plantarum L-3，30 d后，與高膽固醇模型B組相比，陰性對(duì)照C組TC、TG、HDL-C、AI水平均無(wú)顯著差異，D組TC、TG、AI水平均極顯著降低，分別降低了31.3%、20.44%和68.7%，D組HDL-C和HDL-C/TC水平分別升高了27.7%、44.11%，這與已報(bào)道的研究結(jié)果相似。Wang Yanping等［22］將Lactobacillus plantarum MA2飼喂大鼠35 d后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組TG 、TC和HDL-C含量最高分別降低了25.03%、25.14%和14.11%。Huang Ying等［23］以大鼠為模型，將植物乳桿菌LP27以109CFU/d的劑量喂食小鼠28 d后，與對(duì)照組相比，小鼠血清中的TC和TG含量分別下降了37.2%和53.8%。Nguyen等［24］以小鼠為模型，將Lactobacillus plantarum PH04以107CFU/只的劑量喂食小鼠14 d后，與對(duì)照組相比，小鼠血清中的TC和TG含量?jī)H分別下降了7%和10%。然而也有報(bào)道稱(chēng)乳酸菌無(wú)降低血清脂質(zhì)的作用，F(xiàn)ak等［25］在研究羅伊乳酸桿菌對(duì)Apoe-/-小鼠代謝綜合征影響時(shí)發(fā)現(xiàn)該菌沒(méi)有降低小鼠TC和TG的作用。這可能是因?yàn)槟懝檀忌锝到怆m然機(jī)理是多方面的，但是對(duì)于菌株本身來(lái)說(shuō)是特異性的，如菌株要降解膽固醇，其本身可能產(chǎn)生膽鹽水解酶，或者菌體本身對(duì)膽固醇具有吸附作用，或與菌株的劑量、飼料中膽固醇的含量，同時(shí)與動(dòng)物對(duì)菌株的攝取量和實(shí)驗(yàn)周期等相關(guān)［22］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)體外篩選到L. plantarum L-3對(duì)患有高脂血癥的小鼠具有顯著的降血脂作用，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)其為功能性微生態(tài)飼料添加劑奠定了理論基礎(chǔ)，為生產(chǎn)低膽固醇肉、蛋、奶等高品質(zhì)畜產(chǎn)品提供了可能，但是其降膽固醇的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Screening of Lactobacillus with Cholesterol-Degrading Property and Its Effect on Serum Cholesterol in Mice

DING Panpan1， DING Ke1，2，*， YU Zuhua2， LI Wang1， LI Yuanxiao1， LIU Yichen1， HE Wanling1， ZHAO Zhanqin2， WANG Yuqin1，3，CHENG Xiangchao2， ZHANG Chunjie2
（1. Hongxiang Biological Feed Laboratory， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， China；2. Key Laboratory of Animal Disease and Public Health of Henan Province， Luoyang 471003， China；3. Research Center of Breeding Engineering Technology for Meat Sheep of Henan Province， Luoya ng 471003， China）

Objective: To screen Lactobacillus with high cholesterol-degrading capacity from fresh sheep feces and explore the effect of the screened strain on serum cholesterol level in hypercholesterolemic mice. Methods: We screened Lactobacillus with high cholesterol-reducing capacity using Calcium Carbonate-Man-Rogosa-Sharp （MRS） medium and cholesterol-MRS medium. The screened strain， named as L-3， was identified by colony morphology， physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequencing. A feeding experiment was conducted on forty Kunming male mice（eight weeks old）. The mice were randomly divided 4 groups: A， B， C and D， which were fed with normal diet， high fat diet （HFD）， HFD plus normal saline and HFD plus strain L-3， respectively. The serum levels of total cholesterol（TC）， triglyceride （TG）， and high density lipoprotein-cholesterol （HDL-C） were determined on the 15thand 30thday of the experiment. Results: This selected strain was identifie d as Lactobacillus plantarum L-3 and the degradation rate of cholesterol by the stain could reach up to （35.93 ± 0.43）%. A hypercholesterolemic mice model was successfully constructed after feeding a high-cholesterol diet for 15 days. Compared with group B， serum TC， TG and AI levels were extremely significantly decreased in group D after 30 days of oral administration of strain L-3 （P ＜ 0.01）， HDL-C levels of group D was significantly increased （P ＜ 0.05）， and HDL-C/TC levels were extremely significantly increased（P ＜ 0.01）. However， the negative control group did not show cholesterol degradation （P ＞ 0.05）. Conclusion: L. plantarum L-3 has probiotic potential as indicated by its hypocholesterolemic effect both in vivo and in vitro.

Lactobacillus； cholesterol degradation； mice； screening

2015-09-25

河南省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目（162102110064）；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（14B230002）

丁盼盼（1987—），女，碩士研究生，主要從事動(dòng)物微生態(tài)學(xué)研究。E-mail：dpl1021@163.com

丁軻（1977—），男，副教授，博士，主要從事動(dòng)物微生態(tài)與動(dòng)物傳染病學(xué)研究。E-mail：keding19@163.com

10.7506/spkx1002-6630-201615032

Q939.99

A

1002-6630（2016）15-0192-06

引文格式：