肖 健，曹榮安*，賈 建，梁茜茜，李澤偉，魏恭祿，王 巍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

DEAE瓊脂糖凝膠純化龍膽多糖及其分子特性

肖 健，曹榮安*，賈 建，梁茜茜，李澤偉，魏恭祿，王 巍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

以龍膽為原料提取龍膽多糖，純化后對(duì)其分子特性進(jìn)行研究。通過正交試驗(yàn)確定了龍膽多糖的最佳提取參數(shù)：浸提時(shí)間2.5 h、浸提溫度90 ℃、液料比20∶1（V/m），得率為12.80%。利用DEAE瓊脂糖凝膠柱對(duì)龍膽多糖粗品進(jìn)行純化，得到F1和F2兩個(gè)分離組分，得率分別為14.1%和63.4%?；瘜W(xué)組成分析表明龍膽多糖粗品、F1和F2是由不同含量的總糖、蛋白質(zhì)、硫酸根和糖醛酸組成的，單糖組成主要包括阿拉伯糖和半乳糖，同時(shí)含有少量的葡萄糖、鼠李糖、甘露糖和木糖。采用高效尺寸排阻色譜-紫外檢測(cè)器-多角度激光光散射儀-示差折光檢測(cè)器聯(lián)機(jī)系統(tǒng)對(duì)多糖的分子質(zhì)量及分布進(jìn)行分析，結(jié)果表明龍膽粗品、F1和F2分子質(zhì)量（Mw）為67.2×103～788.4×103u，回轉(zhuǎn)半徑（Rg）為90.2～321.1 nm。研究確定了龍膽多糖的提取參數(shù)，并通過離子交換柱進(jìn)行純化，分析了龍膽多糖的分子特性，為下一步的生物活性研究奠定了基礎(chǔ)。

龍膽；多糖；分離純化；分子特性

肖健， 曹榮安， 賈建， 等. DEAE瓊脂糖凝膠純化龍膽多糖及其分子特性［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（15）: 130-135.

XIAO Jian， CAO Rongan， JIA Jian， et al. Purification and molecular characterization of polysaccharides from Gentianae Radix et Rhizoma by DEAE sepharose fast flow chromatography［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 130-135. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615022. http://www.spkx.net.cn

龍膽（Gentianae Radix et Rhizoma）為龍膽科植物龍膽的根和根莖［1］，臨床上用于治療肝膽疾病、高血壓病、急性腎盂腎炎、病毒性角膜炎、皮膚病、急性咽炎、慢性支氣管炎、上呼吸道感染、結(jié)膜炎等疾?。?］。龍膽在國(guó)際上亦為天然藥物，被收載為苦味健胃劑［3］。龍膽多糖為龍膽的有效成分之一，而多糖作為一類天然高分子化合物受到研究者的日益重視。多糖是由醛糖或酮糖組成的，由10 個(gè)以上單糖通過糖苷鍵連接而成的多聚物，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，在生命活動(dòng)中扮演重要角色［4-5］。人們對(duì)于糖類的早期研究只注意到它作為細(xì)胞的組成成分和能源物質(zhì)的重要性，后來發(fā)現(xiàn)有些多糖可以作為細(xì)胞表面專一的識(shí)別信號(hào)，起傳遞信息的作用，參與生命科學(xué)中細(xì)胞的各種活動(dòng)，具有多種多樣的生物學(xué)功能，例如多糖具有抗病毒［6］、抗衰老［7］、抗炎［8］、抗癌［9］、抗凝［10］、抗血栓［11］、降血糖和治療糖尿?。?2-13］等作用，還有免疫調(diào)節(jié)與抗腫瘤的生物學(xué)功效，它能激活免疫受體，提高機(jī)體的免疫功能［6，8］。而且多種植物和真菌多糖例如人參、黃芪、靈芝、茯苓和香菇多糖可以增強(qiáng)癌癥患者免疫力、改善臨床癥狀、提高生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生存時(shí)間等，已被廣泛用于各種腫瘤的治療［14］。本實(shí)驗(yàn)以龍膽為原料提取龍膽多糖，進(jìn)行提取參數(shù)的研究，并對(duì)其進(jìn)行分離純化， 進(jìn)而分析其化學(xué)成分、單糖組成、分子質(zhì)量及分布。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

龍膽購(gòu)自安徽亳州茲元堂。

DEAE瓊脂糖凝膠 美國(guó)GE Healthcare公司；蛋白質(zhì)定量試劑盒 美國(guó)Bio-Rad公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清白蛋白、明膠、葡萄糖醛酸 美國(guó)Sigma-Aldrich公司。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

3802 UV/VZS分光光度計(jì) 美國(guó)Unico公司；TSK Gel色譜柱 日本Tosoh公司；2487紫外檢測(cè)器、2414示差折光檢測(cè)器 美國(guó)Waters公司；DAWN HELEOS多角度激光光散射檢測(cè)器 美國(guó)Wyatt公司；6890N/ MSD5973氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3方法

1.3.1龍膽多糖提取參數(shù)研究

1.3.1.1提取工藝

采用水提醇沉法提取龍膽多糖，工藝如下：挑選龍膽原料除雜后60 ℃烘干，研磨過40 目篩，加入85%乙醇，70 ℃加熱回流攪拌2 h，冷卻后室溫?cái)嚢?2 h，離心后殘?jiān)蟹謩e加入85%乙醇和無(wú)水丙酮室溫?cái)嚢?，離心后沉淀在通風(fēng)櫥中自然干燥。按照一定的液料比加入蒸餾水進(jìn)行浸提，浸提兩次，合并兩次的提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，加入乙醇使最終乙醇的體積分?jǐn)?shù)為80%，攪拌10 min后放入4 ℃冰箱中靜置12 h，離心后棄去上清液，沉淀分別加入無(wú)水乙醇和丙酮洗滌兩次，離心后沉淀室溫干燥，稱質(zhì)量后按照下式計(jì)算多糖得率。

1.3.1.2單因素試驗(yàn)

液料比對(duì)多糖得率的影響：選取液料比（V/m）分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，浸提溫度80 ℃，浸提時(shí)間2 h，進(jìn)行多糖的提取，研究液料比對(duì)多糖得率的影響。

浸提溫度對(duì)多糖得率的影響：液料比（V/m）10∶1，選取浸提溫度分別為75、80、85、90、95 ℃，浸提時(shí)間為2 h，進(jìn)行多糖的提取，研究浸提溫度對(duì)多糖得率的影響。

浸提時(shí)間對(duì)糖得率的影響：液料比（V/m）10∶1，浸提溫度80 ℃，選取浸提時(shí)間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，進(jìn)行多糖的提取，研究浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響。

1.3.1.3正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，3 個(gè)因素各選取3 個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，從而最終確定提取龍膽多糖的最佳參數(shù)，并利用最佳參數(shù)進(jìn)行提取，測(cè)定龍膽多糖得率。

1.3.2龍膽多糖的純化

250 mg龍膽多糖溶于10 mL蒸餾水中，60 ℃溶解，3 ?m膜過濾后注入DEAE瓊脂糖凝膠柱進(jìn)行純化，洗脫液分別為蒸餾水，0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L NaCl溶液，分別洗脫5 h，洗脫速率為1.5 mL/min。蒸餾水洗脫2 h后開始收集解析液，10 min/管。按照苯酚-硫酸法［15］測(cè)定解析液的總糖含量，合并相應(yīng)的溶液，濃縮、透析后凍干得到多糖分離組分。

1.3.3總糖含量測(cè)定

總糖含量測(cè)定參照Dubois等［15］的苯酚-硫 酸法：多糖配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的溶液，60 ℃溶解待用。溶液中加入5%苯酚溶液后旋渦振蕩，加入濃硫酸溶液，充分旋渦振蕩，室溫反應(yīng)20 min后在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。選擇葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，將樣品吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中總糖含量。

1.3.4蛋白質(zhì)含量測(cè)定

蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用Lowry法（福林-酚法）［16］，使用蛋白質(zhì)定量試劑盒：多糖配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的溶液，60 ℃溶解待用。溶液加入試劑 A，充分旋渦振蕩，室溫反應(yīng)10 min。加入試劑B，充分旋渦振蕩，室溫反應(yīng)15 min后在750 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。選擇牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，將樣品吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.3.5硫酸根含量測(cè)定

硫酸根含量測(cè)定采用Dodgson等［17］的氯化鋇-明膠濁度法：多糖用0.5 mol/L HCl溶液在110 ℃烘箱中水解5 h。水解液加入質(zhì)量濃度為3 g/100 mL三氯乙酸溶液，旋渦振蕩后再加入氯化鋇-明膠溶液，室溫反應(yīng)20 min后在360 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。選擇硫酸鉀為標(biāo)準(zhǔn)品，將樣品吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中硫酸根含量。

1.3.6糖醛酸含量測(cè)定

糖醛酸含量測(cè)定采用Filiset ti-Cozzi等［18］的間羥基聯(lián)苯法：多糖配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，60 ℃溶解待用。樣品溶液加入磺酰胺鉀溶液（pH 1.6），旋渦振蕩后加入四硼酸鈉-硫酸溶液，充分旋渦振蕩，100 ℃沸水中反應(yīng)20 min，冰浴中迅速冷卻，加入質(zhì)量濃度為0.15 g/100 mL間羥基聯(lián)苯溶液（溶解在質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL氫氧化鈉溶液中），對(duì)照組僅加入質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL氫氧化鈉溶液。充分旋渦振蕩后室溫反應(yīng)10 min，在535 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，采用葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，將樣品吸光度減去對(duì)照組吸光度的結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出樣品中糖醛酸含量。

1.3.7單糖組成分析

參考Ciucanu等［19］的方法并稍作改動(dòng)（樣品處理全過程需要氮?dú)獗Ｗo(hù)）：樣品和7 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品（鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖）分別加入三氟乙酸，100 ℃水解6 h，之后分別加入硼氘化鈉（NaBD4）和無(wú)水醋酸進(jìn)行還原和乙?；?，制得相應(yīng)的糖醇乙酸酯衍生物。注入1 μL到GC-MS儀中進(jìn)行分析，采用的是HP-5MS石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣作為氦氣，流速為1.2 mL/min。升溫程序?yàn)?60～210 ℃（10 min之內(nèi)），之后10 min內(nèi)以5 ℃/min升溫到240 ℃，保持在250 ℃，進(jìn)樣口溫度也保持在250 ℃。用電子轟擊源（electron impaction，EI）分析，電子能量為70 eV，質(zhì)量掃描范圍為35～450 m/z。根據(jù)氣相色譜出峰時(shí)間和質(zhì)譜的離子峰與單糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比從而確定單糖組成。

1.3.8分子質(zhì)量及分布測(cè)定

多糖配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液，60 ℃加熱溶解，3 ?m膜過濾后注入排阻色譜-紫外檢測(cè)器-多角度激光光散射儀-示差折光檢測(cè)器聯(lián)機(jī)系統(tǒng)中測(cè)定分子質(zhì)量及分布情況。采用牛血清白蛋白對(duì)儀器進(jìn)行校正，流動(dòng)相是0.15 mol/L NaNO3和0.02% NaN3，流速為0.4 mL/min，結(jié)果分析采用ASTRA 6.1軟件。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2　結(jié)果與分析

2.1龍膽多糖的提取條件

2.1.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)于龍膽多糖提取參數(shù)的研究，首先進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，選取的因素包括液料比、浸提溫度和浸提時(shí)間。液料比對(duì)多糖得率的影響見圖1，在液料比（V/m）10∶1～20∶1范圍內(nèi)，隨著液料比的增大，多糖得率呈明顯上升趨勢(shì)，當(dāng)液料比（V/m）為20∶1時(shí)，多糖得率最高，為11.50%，之后隨著液料比的繼續(xù)升高，多糖得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，所以選取15∶1、20∶1、25∶1為進(jìn)行龍膽多糖提取正交試驗(yàn)的液料比（V/m）。

圖1　液料比對(duì)多糖得率的影響Fig. 1 Effect of liquid/solid ratio on the yield of polysaccharides

浸提溫度對(duì)多糖得率的影響見圖2，可知在75～90 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，多糖得率呈明顯上升趨勢(shì)，當(dāng)浸提溫度為90 ℃時(shí)多糖得率最高，為11.60%，之后隨著溫度的繼續(xù)升高，多糖得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，所以選取85、90、95 ℃為進(jìn)行龍膽多糖提取正交試驗(yàn)的溫度。

圖2 浸提溫度對(duì)多糖得率的影響Fig. 2 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides

圖3為浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響，可知在1.0～2.0 h內(nèi)，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率呈明顯上升趨勢(shì)，當(dāng)浸提時(shí)間為2.0 h時(shí)多糖得率最高，為11.47%，之后隨著浸提時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，多糖得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，所以選取1.5、2.0、2.5 h為進(jìn)行龍膽多糖提取正交試驗(yàn)的時(shí)間。

圖3　浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig. 3 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides

2.1.2正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取液料比（V/m）15∶1、20∶1、25∶1，浸提溫度85、90、95 ℃，浸提時(shí)間1.5、2.0、2.5 h進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表1。

表1　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 1 Orthogonal array design with experimental results

通過比較R值可知影響龍膽多糖得率因素的主次順序?yàn)镃浸提時(shí)間＞B浸提溫度＞A液料比。通過k值的比較確定提取龍膽多糖的最佳組合為A2B2C3，即液料比20∶1、浸提溫度90 ℃、浸提時(shí)間2.5 h，龍膽多糖得率為12.80%。同時(shí)也有其他研究者對(duì)龍膽多糖的提取參數(shù)進(jìn)行了研究，王晨瑜等［20］確定水溶性龍膽多糖的最佳提取工藝條件為：提取溫度100 ℃、料液比1∶25、提取時(shí)間3.0 h、提取次數(shù)2 次，而Wang Chenyu等［21］從龍膽中提取水溶性多糖最佳參數(shù)為：提取溫度100 ℃、料液比1∶26.56、提取時(shí)間3 h、提取2 次，通過本實(shí)驗(yàn)確定的提取參數(shù)與以上兩篇文獻(xiàn)的參數(shù)相近。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中龍膽多糖的得率為12.80%，這也與史偉國(guó)［22］、王晨瑜［20］和Wang Chenyu［21］等所報(bào)道的龍膽多糖的提取率分別為12.59%、14.0%和13.0%的結(jié)果相近，提取參數(shù)和提取率上的一些差別可能是由于龍膽原料產(chǎn)地、提取實(shí)驗(yàn)條件和設(shè)備差異造成的。

2.2龍膽多糖純化結(jié)果

利用DEAE瓊脂糖凝膠柱對(duì)提取得到的龍膽多糖粗品進(jìn)行純化，之后按照苯酚-硫酸法測(cè)定收集液的吸光度，以洗脫體積為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制出洗脫圖。由圖4可知，經(jīng)過洗脫后得到兩個(gè)洗脫峰，分別命名為分離組分F1和F2，可知F1主要是由蒸餾水洗脫出來的中性多糖，而F2主要是由0.5 mol/L NaCl洗脫出來的酸性多糖。將F1和F2溶液濃縮、透析后凍干，稱質(zhì)量后計(jì)算得率，F(xiàn)1的得率為14.1%，F(xiàn)2的得率為63.4%。

圖4　龍膽多糖的DEAE瓊脂糖凝膠柱洗脫曲線Fig. 4 Elution profile of the crude polysaccharide from Gentianae Radix et Rhizoma on DEAE Sepharose fast flow

2.3龍膽多糖的化學(xué)組成

對(duì)龍膽多糖粗品和分離組分F1、F2的化學(xué)成分和單糖組成進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見表2。龍膽多糖粗品主要由59.0%總糖、12.8%蛋白質(zhì)、6.8%硫酸根和26.7%糖醛酸組成，而F1和F2的化學(xué)成分別為總糖91.2%和58.9%、蛋白質(zhì)4.1%和12.2%、硫酸根6.4%和9.2%、糖醛酸0.7%和28.8%。圖5是單糖標(biāo)準(zhǔn)品和龍膽多糖衍生物的總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖，圖5A是7 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖，按照出峰時(shí)間先后順序?qū)?yīng)的單糖分別為鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中鼠李糖和巖藻糖衍生物的質(zhì)譜圖是一致的，阿拉伯糖和木糖衍生物的質(zhì)譜圖是一致的，甘露糖、葡萄糖和半乳糖衍生物的質(zhì)譜圖是一致的。圖5B、C、D分別為龍膽多糖粗品、F1和F2衍生物的總離子流色譜圖，根據(jù)出峰時(shí)間和質(zhì)譜圖對(duì)比確定對(duì)應(yīng)單糖的種類，同時(shí)根據(jù)峰面積計(jì)算單糖組成和比例。由表2可知，龍膽多糖粗品主要由阿拉伯糖（42.6%）和半乳糖（43.8%）組成，同時(shí)含有少量的葡萄糖（5.3%）、鼠李糖（4.8%）、甘露糖（2.7%）和木糖（0.8%）。F1和F2的單糖組成同粗品也非常相近，也是主要由阿拉伯糖（分別為53.3%和40.1%）和半乳糖（分別36.6%和47.7%）組成，同時(shí)分別含有5.3%和2.8%的葡萄糖、0.3%和7.5%的鼠李糖、3.8%和1.3%的甘露糖、0.7%和0.6%的木糖。王赫［23］從龍膽水溶性多糖中分離純化得到2 種不同的均一多糖組分TP-1、TP-2，經(jīng)氣相色譜法檢測(cè)，二者主要由阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖組成，同時(shí)含有少量的巖藻糖、木糖和甘露糖。而本實(shí)驗(yàn)分析確定的龍膽多糖的單糖組成主要為阿拉伯糖和半乳糖，葡萄糖的含量非常少，造成這種差別的原因可能是采用的龍膽原料和純化方法的不同，王赫采用的是Sephadex G100型凝膠柱純化龍膽多糖，而本研究采用的是DEAE瓊脂糖凝膠柱。

表2　龍膽多糖粗品和分離組分的化學(xué)成分和單糖組成及含量Table 2 Chemical and monosaccharide compositions and content of the crude polysaccharide and fractions from Gentianae Radix et Rhizoma

圖5　單糖標(biāo)準(zhǔn)品和龍膽多糖糖醇乙酸酯衍生物的總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖Fig. 5 Total ion current chromatogram and mass spectra for alditol acetates derivatives of monosaccharides and polysaccharides from Gentianae Radix et Rhizoma

2.4龍膽多糖的分子質(zhì)量及分布

采用高效尺寸排阻色譜-紫外檢測(cè)器-多角度激光光散射儀-示差折光檢測(cè)器聯(lián)機(jī)系統(tǒng)對(duì)龍膽多糖的分子質(zhì)量及分布情況進(jìn)行了研究，示差折光檢測(cè)曲線和紫外色譜見圖6。龍膽多糖粗品示差折光檢測(cè)曲線（圖6A）上有峰形不對(duì)稱的兩個(gè)峰，分別為洗脫時(shí)間30～42 min的峰Ⅰ和42～51 min的峰Ⅱ。F2也存在兩個(gè)峰（圖6C），分別為洗脫時(shí)間32～45 min的峰Ⅰ和45～51 min的峰Ⅱ，可知粗品和F2不是均一多糖。而F1在洗脫時(shí)間為40～51 min內(nèi)只存在一個(gè)峰形對(duì)稱的峰（圖6B），說明其是均一多糖。同時(shí)粗品和F2也存在明顯的紫外檢測(cè)峰，而F1的紫外檢測(cè)峰非常小，說明粗品和F2含有一定的蛋白質(zhì)，而F1的蛋白質(zhì)含量很低，這與2.3節(jié)化學(xué)組成檢測(cè)中F1蛋白質(zhì)含量較低的結(jié)果是相互吻合的。

同時(shí)利用ASTRA 6.1軟件進(jìn)行分析，得到分子質(zhì)量（Mw）和回轉(zhuǎn)半徑（Rg）的數(shù)值見表3?？芍制贩澧窈头澧虻腗w分別為616.5×103、246.9×103u，Rg分別為90.2、270.2 nm。F1的Mw為67.2×103u，Rg為178.6 nm。F2的峰Ⅰ和峰Ⅱ的Mw分別為788.4×103、185.1×103u，Rg分別為90.3、321.1 nm。

圖6　龍膽多糖粗品和分離組分的示差折光檢測(cè)曲線和紫外色譜圖Fig. 6 RI and UV chromatograms of the crude polysaccharide and fractions from Gentianae Radix et Rhizoma

表3　龍膽多糖粗品和分離組分的分子質(zhì)量和回轉(zhuǎn)半徑Table 3 Molecular weights and radii of gyration of the crude polysaccharide and fractions from Gentianae Radix et Rhizoma

3　結(jié) 論

本研究確定了提取龍膽多糖的最佳參數(shù)為浸提時(shí)間2.5 h、浸提溫度90℃、液料比20∶1（V/m），此條件下龍膽多糖得率為12.80%。利用DEAE瓊脂糖凝膠柱進(jìn)行純化，得到了極性不同的龍膽多糖組分F1和F2?；瘜W(xué)組成分析表明龍膽多糖是由總糖、蛋白質(zhì)、硫酸根和糖醛酸組成的，單糖組成主要包括阿拉伯糖和半乳糖，同時(shí)含有少量的葡萄糖、鼠李糖、甘露糖和木糖。粗品、F1和F2的Mw為67.2×103～788.4×103u，Rg為90.2～321.1 nm，同時(shí)分子質(zhì)量分布表明粗品和F2不是均一多糖，而F1是均一多糖。通過本研究明確了龍膽多糖的提取參數(shù)、 純化方法和分子特 性，為下一步對(duì)其生物活性和構(gòu)效關(guān)系的分析奠定了基礎(chǔ)。

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Purification and Molecular Characterization of Polysaccharides from Gentianae Radix et Rhizoma by DEAE Sepharose Fast Flow Chromatography

XIAO Jian， CAO Rongan*， JIA Jian， LIANG Xixi， LI Zewei， WEI Gonglu， WANG Wei
（College of Food Science， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）

The molecular characterization of the polysaccharides purified from Gentianae Radix et Rhizoma was investigated in this study. By using orthogonal array design， the optimal extraction parameters that provided the maximum yield of polysaccharides of 12.80% were determined as follows: extraction time 2.5 h， temperature 90 ℃， and ratio of liquid to solid 20:1 （V/m）. The crude polysaccharide was purified by DEAE sepharose fast flow chromatography to obtain two fractions，F(xiàn)1and F2， with a yield of 14.1% and 63.4%， respectively. All the crude polysaccharide and purified fractions were composed of neutral sugar， protein， sulfate and uronic acid with various ratios. Arabinose and galactose were the major monosaccharide units along with a small portion of glucose， rhamnose， mannose and xylose. The molecular weights （Mw） and radii of gyration（Rg） of all three samples ranged from 67.2 × 103to 788.4 × 103u and from 90.2 to 321.1 nm， respectively， as determined by HPSEC-UV-MALLS-RI system. The results obtained in this study can provide the basis for further bioactivity studies.

Gentianae Radix et Rhizoma； polysaccharides； separation and purification； molecular characterization

10.7506/spkx1002-6630-201615022

TS201.1

A

1002-6630（2016）15-0130-06

10.7506/spkx1002-6630-201615022. http://www.spkx.net.cn

2015-11-05

2015年黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201510223010）；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)2014年度校內(nèi)培育課題（XZR2014-08）；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)成、引進(jìn)人才科研啟動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目（XDB2015-30）

肖?。?994—），男，本科生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：1501800314@qq.com

曹榮安（1980—），男，講師，博士，研究方向?yàn)樘烊簧锘钚援a(chǎn)物。E-mail：racao@163.com

引文格式：